本發(fā)明屬于植物育種或組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種茄子單倍體植株加倍方法。

背景技術(shù)：

茄子(solariummelongenal)，原產(chǎn)亞洲熱帶，我國(guó)各省均有栽培。草本或亞灌木狀，果可供蔬食，根、莖、葉、種子皆可入藥。

近年發(fā)展起來(lái)的以組織培養(yǎng)和遺傳工程為主導(dǎo)的生物技術(shù),為縮短育種年限開(kāi)辟了一條新途徑。70年代初,riana等成功地通過(guò)茄子花藥培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織途徑成苗，目前不論是茄子花藥還是花粉(小孢子)培養(yǎng)，都已有許多成功的報(bào)道，但國(guó)內(nèi)利用花藥或花粉培養(yǎng)獲得的親本，選育出茄子新品種的報(bào)道卻并不多。究其原因，主要是茄子花藥或花粉培養(yǎng)產(chǎn)生再生植株的頻率不高，且再生植株中的單倍體加倍頻率不高，成熟的單倍體植株加倍困難。一般加倍方法是：采用一定濃度的秋水仙素溶液，處理比較幼嫩植株的生長(zhǎng)點(diǎn)一定時(shí)間，成功的報(bào)道國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)于北京市農(nóng)科院蔬菜所單倍體組，其加倍處理后的植株結(jié)實(shí)率最高的可達(dá)到87.5％，但加倍前植株是否均為單倍體，以及結(jié)實(shí)植株是否為二倍體則并未說(shuō)明。筆者在加倍方法研究過(guò)程中，也采用了秋水仙素溶液滴生長(zhǎng)點(diǎn)的處理方法，處理后枝條要么死亡，要么沒(méi)有加倍成功，與其他茄子育種單位交流，普遍反應(yīng)茄子單倍體植株處理生長(zhǎng)點(diǎn)誘導(dǎo)加倍比較難以成功。

除了活體植株生長(zhǎng)點(diǎn)誘導(dǎo)加倍方法外，組培過(guò)程中誘導(dǎo)生根苗或無(wú)根幼苗加倍、秋水仙素浸幼苗根或分蘗節(jié)法等也是常用的方法，但這些常用方法均存在同樣的問(wèn)題：一旦處理過(guò)程中造成苗死亡，則非但單倍體不能成功加倍，而且原有單倍體材料也會(huì)丟失。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，對(duì)茄子單倍體植株開(kāi)展離體誘導(dǎo)枝條加倍的技術(shù)研究，在保存原始材料的同時(shí)進(jìn)行加倍，保證每一單倍體植株加倍成功，提高了茄子花藥(粉)培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于育種實(shí)踐的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種茄子單倍體植株加倍方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的效果不佳等問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種茄子單倍體植株加倍方法，它包括如下步驟：

(1)采集單倍體茄子植株枝條，將基部約2cm浸入多菌靈溶液，再轉(zhuǎn)入秋水仙素溶液中進(jìn)行加倍處理；

(2)取步驟(1)中加倍處理后的枝條用水沖洗后，將基部剪成45度斜面，浸入iba溶液中，再插入基質(zhì)中；

(3)將步驟(2)中插入基質(zhì)中的枝條用塑料薄膜密封后，進(jìn)行光照培養(yǎng)，15～20天后即得加倍后的茄子扦插苗。

步驟(1)中，所述的單倍體茄子植株枝條的采集方法為：當(dāng)單倍體茄子植株發(fā)育到四門斗開(kāi)花時(shí)，將雙干整枝留下的四個(gè)枝條，從分叉處向上留2-4片葉剪掉，待隱芽萌出的枝條達(dá)到10cm左右時(shí)，將枝條從底部剪下。

步驟(1)中，所述的多菌靈溶液由有效成分含量為50wt％的多菌靈可濕性粉劑與水按照1：500～800的質(zhì)量比稀釋得到；將基部浸入多菌靈溶液，浸泡時(shí)間為0.5～4h，優(yōu)選0.5～2h。

步驟(1)中，所述的秋水仙素溶液的濃度為0.05～0.5wt％，所述的加倍處理的方法為將枝條基部浸入秋水仙素溶液中4～72h。

其中，優(yōu)選的是，秋水仙素溶液的濃度為0.05wt％，浸泡時(shí)間為72h；或者秋水仙素溶液的濃度為0.2wt％，浸泡時(shí)間為5h。

步驟(2)中，所述的iba溶液的濃度為500～1000ppm，枝條基部2cm在iba溶液中的浸泡時(shí)間為1～10s。

步驟(2)中，所述的基質(zhì)為蛭石或由蛭石、草灰和珍珠巖以5：4：1的體積比混合而成，厚度不小于10cm，澆透但不積水。

步驟(2)中，在基質(zhì)中，枝條的插入深度為3～4cm，傾斜角度為30度，株行距為8cm。

步驟(3)中，所述的光照培養(yǎng)的溫度為24～26℃，光周期為12～16h，暗周期為8～12h，光照強(qiáng)度為1000～1500lx。

步驟(3)中，前兩周內(nèi)不打開(kāi)薄膜，兩周后可打開(kāi)薄膜，拔除未生根枝條并澆水后，重新蓋好薄膜。

植株倍性鑒定及二次加倍處理：植株倍性鑒定采用分裂過(guò)程中染色體計(jì)數(shù)的方法，二倍體植株體細(xì)胞染色體數(shù)目為24條，花藥中花粉量多，人工輔助自交后，多數(shù)能夠結(jié)果并產(chǎn)生種子。

未加倍成功的植株，可以從原始單倍體植株上采集枝條再進(jìn)行加倍處理，或從加倍未成功的單倍體上采集枝條進(jìn)行二次加倍處理，直至該植株加倍成功為止。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：

應(yīng)用本發(fā)明方法，所保存的單倍體植株均加倍成功，扦插成活的加倍植株可迅速進(jìn)入生殖生長(zhǎng)，開(kāi)花結(jié)果并得到了自交種子。扦插結(jié)合加倍，對(duì)茄子單倍體植株進(jìn)行了有效的保存、研究和利用。利用本發(fā)明方法，枝條成活率在夏季污染嚴(yán)重季節(jié)可以達(dá)到10％以上，成活株加倍率可達(dá)50％至100％

附圖說(shuō)明

圖1為234號(hào)單倍體植株及其根尖細(xì)胞(12條染色體)；

圖2為234加倍處理后結(jié)果的二倍體植株及其花粉母細(xì)胞(中期ⅰ，12個(gè)二價(jià)體，2n＝24)；

圖3為水培扦插保存的84-2單倍體植株及其根尖細(xì)胞(2n＝12)；

圖4為84-2加倍處理后結(jié)果的二倍體植株及其根尖細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1

試驗(yàn)于2016年8月8日開(kāi)始，在金陵科技學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。單倍體植株編號(hào)為84-2和234，分別是2015年和2016年花藥培養(yǎng)獲得的茄子單倍體植株，其中84-2為枝條扦插成活而保存的植株。50％wp多菌靈粉劑為上海悅聯(lián)化工有限公司生產(chǎn)，其有效成分含量為50wt％，每升自來(lái)水中含有1.25克粉劑，配置成為稀釋800倍的混懸液；秋水仙素粉劑(分子量為399.49)為sigma公司原產(chǎn)分裝，秋水仙素粉劑用超純水直接溶解，配置成0.05wt％和0.2wt％兩種濃度的溶液；吲哚-3-丁酸(iba,分子量為203.24)，由中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，粉劑先用少量100％酒精溶解，再用超純水稀釋到1000ppm。

1.采集單倍體植株上的枝條：當(dāng)234號(hào)和84-2號(hào)單倍體植株發(fā)育到四門斗開(kāi)花時(shí)，將雙干整枝留下的四個(gè)枝條，從分叉處向上留2-4片葉剪掉，待隱芽萌出的枝條達(dá)到10cm左右時(shí)，將枝條從底部剪下，立即放入多菌靈(50％粉劑)800倍水溶液中；234號(hào)共10個(gè)枝條，84-2共20個(gè)枝條。

2.扦插前枝條處理和扦插基質(zhì)準(zhǔn)備：將枝條在50％多菌靈800倍液中，室溫下浸泡2h后取出，晾干或吸干基部液體，再轉(zhuǎn)入秋水仙素溶液中進(jìn)行加倍處理。

在枝條浸泡處理過(guò)程中準(zhǔn)備好扦插基質(zhì)，基質(zhì)采用保濕效果好的純蛭石，裝入不透水的塑料箱內(nèi)，厚度10cm以上，澆透但不積水，備用。

3.秋水仙素加倍處理：加倍處理有低濃度溶液長(zhǎng)時(shí)間處理和高濃度溶液短時(shí)間處理兩種方法，分別為0.05％秋水仙素溶液浸泡枝條下部72h，和0.2％秋水仙素溶液浸泡處理5h。

4.枝條扦插：自來(lái)水沖洗加倍處理過(guò)的枝條，用鋒利的修枝剪等將基部剪成45度斜面，頂端剪平或不剪。將修剪過(guò)的枝條基部斜面浸入1000ppm的iba溶液中，1-10s后取出，向前方傾斜30度，插入基質(zhì)中，株行距約8cm，深度達(dá)到3-4cm，扦插完后淋一遍小水，注意基質(zhì)中不能積水。

5、覆蓋保濕：用塑料薄膜將塑料箱蓋嚴(yán)，然后整個(gè)放入光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為25℃，光暗周期12h/12h，光照強(qiáng)度調(diào)整為1500lx。

6.扦插后管理：扦插后2周內(nèi)不開(kāi)膜，2周后打開(kāi)塑料膜，觀察統(tǒng)計(jì)成活率。生根成活的枝條不腐不蔫不干，部分枝條上的芽有一定量的生長(zhǎng)，死亡的枝條則干縮萎蔫。將未生根枝條拔除，并根據(jù)基質(zhì)干濕情況適當(dāng)澆小水，重新蓋好薄膜，與培養(yǎng)箱頂端之間留約1cm寬縫隙，并在保證植株不萎蔫的基礎(chǔ)上逐步加大縫隙寬度，直至揭除薄膜。最后將成活的扦插苗移栽到大盆內(nèi)或田間，按照正常栽培管理即可。

6.植株倍性鑒定及二次加倍處理：當(dāng)成活的加倍處理植株現(xiàn)蕾開(kāi)花后，對(duì)植株葉形指數(shù)、花蕾寬度、有無(wú)花粉，以及是否坐果等進(jìn)行觀察，并采摘加倍處理后的植株上的花蕾進(jìn)行減數(shù)分裂過(guò)程中染色體計(jì)數(shù)，以鑒定植株的倍性，結(jié)果見(jiàn)表1。二倍體植株體細(xì)胞中染色體數(shù)目為24條，花藥中花粉量多，人工輔助自交后，多數(shù)能夠結(jié)果并產(chǎn)生種子。

表1234和84-2枝條加倍處理結(jié)果