本發(fā)明涉及一種利用抗敏蛋白LSP1促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的組培方法，屬于中藥甘草組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘草酸(Glycyrrhizic acid)屬于E型皂苷的一種，是甘草中含量最豐富的皂苷。作為甘草中最主要的活性成分，甘草酸主要有以下幾種用途：(1)醫(yī)藥工業(yè)：甘草酸具有抗炎保肝、抗病毒、抗腫瘤、干擾素誘生劑，調(diào)節(jié)免疫功能等作用，臨床應(yīng)用于慢性肝炎、支氣管炎和艾滋病及多種癌癥的防治。(2)食品及卷煙業(yè)：甘草酸是一種高甜度低熱值的保健甜味劑，其甜度約為蔗糖的250倍以上，添加于食品，飲料，糖果中作甜味劑，可克服多用糖而引起的發(fā)酵，酸敗等缺點(diǎn)，而且有殺菌、潔齒、消炎、潤(rùn)喉等功用。(3)化妝品工業(yè)：甘草酸分子中含有親水性基團(tuán)和親油性基團(tuán)，能降低水溶液表面張力，有很強(qiáng)的發(fā)泡力，具有乳化、分散、保濕潤(rùn)發(fā)、軟化皮膚、抗皺、抗皮脂、防治色素沉積、消炎止癢及洗滌去污的效果。
盡管甘草酸有如此之多的用途，但從甘草或甘草不定根中進(jìn)行提取，其收率較低，難于滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。
目前尚未有利用抗敏蛋白LSP1促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的甘草不定根組培方法中甘草酸化合物含量較低的不足，提供一種促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的組培方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
一種促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的組培方法，包括如下步驟：
(1)將甘草的根、莖或葉接種于固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)甘草不定根的生成，將甘草不定根接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)33-37天；
所述固體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為3-4％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，加入瓊脂使終質(zhì)量濃度為0.6-0.7％，調(diào)節(jié)pH＝5.8-6.0；
所述液體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為3％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，調(diào)節(jié)pH＝5.8-6.0；
(2)將抗敏蛋白LSP1加入到步驟(1)已培養(yǎng)33-37天的甘草不定根的液體培養(yǎng)基中，使抗敏蛋白LSP1的終濃度為25-200mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，收獲，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
步驟(2)抗敏蛋白LSP1的終濃度為50mg/L。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)單，能顯著提高甘草不定根中甘草酸化合物含量，生長(zhǎng)周期短，生產(chǎn)成本低，便于甘草酸的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
MS培養(yǎng)基，商品化。
PDA培養(yǎng)基，(20％土豆+2％葡萄糖+2％瓊脂,余量是水)
實(shí)施例1
固體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為3.5％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，加入瓊脂使終質(zhì)量濃度為0.65％，調(diào)節(jié)pH＝5.9。
實(shí)施例2
固體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為4％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，加入瓊脂使終質(zhì)量濃度為0.6％，調(diào)節(jié)pH＝5.8。
實(shí)施例3
固體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為3％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，加入瓊脂使終質(zhì)量濃度為0.7％，調(diào)節(jié)pH＝6.0。
實(shí)施例4
液體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為3％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，調(diào)節(jié)pH＝5.9。
實(shí)施例5
液體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為3％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，調(diào)節(jié)pH＝5.8。
實(shí)施例6
液體培養(yǎng)基用下述方法配成：在1/2MS培養(yǎng)基中加入蔗糖使終質(zhì)量濃度為3％，加入吲哚丁酸使終濃度為1.0mg/L，調(diào)節(jié)pH＝6.0。
實(shí)施例7
一種促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的組培方法，包括如下步驟：
(1)將甘草的根接種于實(shí)施例1配制的固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)甘草不定根的生成，將甘草不定根接種于實(shí)施例4配制的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35天；
(2)將抗敏蛋白LSP1加入到步驟(1)已培養(yǎng)35天的甘草不定根的液體培養(yǎng)基中，使抗敏蛋白LSP1的終濃度為50mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)5天，收獲，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
實(shí)施例8
一種促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的組培方法，包括如下步驟：
(1)將甘草的莖接種于實(shí)施例2配制的固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)甘草不定根的生成，將甘草不定根接種于實(shí)施例5配制的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)33天；
(2)將抗敏蛋白LSP1加入到步驟(1)已培養(yǎng)33天的甘草不定根的液體培養(yǎng)基中，使抗敏蛋白LSP1的終濃度為25mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6天，收獲，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
步驟(2)抗敏蛋白LSP1的終濃度為50mg/L。
實(shí)施例9
一種促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的組培方法，包括如下步驟：
(1)將甘草的葉接種于實(shí)施例3配制的固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)甘草不定根的生成，將甘草不定根接種于實(shí)施例6配制的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)37天；
(2)將抗敏蛋白LSP1加入到步驟(1)已培養(yǎng)37天的甘草不定根的液體培養(yǎng)基中，使抗敏蛋白LSP1的終濃度為200mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)4天，收獲，所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所示。
步驟(2)抗敏蛋白LSP1的終濃度為50mg/L。
實(shí)施例10
甘草不定根的組培方法(對(duì)照組)，包括如下步驟：
將甘草根接種于實(shí)施例1配制的固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)甘草不定根的生成，將甘草不定根接種于實(shí)施例4配制的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40天，收獲。
實(shí)施例11
各實(shí)施例獲得的甘草不定根中甘草酸化合物的提取及含量測(cè)定：
(1)色譜條件
液相色譜條件：色譜柱為Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相A：乙腈，B：0.05％磷酸；梯度洗脫程序：0～8min，A：19％；8～35min，A為19～50％；35～36min，A為50～100％；36～40min，A為100～19％。檢測(cè)波長(zhǎng)237nm；柱溫30℃；流速1.0mL·min-1；進(jìn)樣體積為20μL。
(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
精密稱取甘草酸標(biāo)品1mg，加少量甲醇超聲溶解后置于5mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，分別得到甘草酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。對(duì)照品儲(chǔ)備液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后密封，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)樣品溶液的制備
精密稱取0.2g實(shí)施例7、8、9、10獲得的甘草不定根，干燥后獲得的甘草不定根樣品分別置于50mL具塞三角瓶中，各加入20mL甲醇，超聲提取(250W，40kHz)30min，然后60℃水浴振蕩器振蕩90min，過(guò)濾，濾渣再加入20mL甲醇，超聲提取(250W，40kHz)30min，然后60℃水浴振蕩器振蕩90min，過(guò)濾，合并濾液。揮干(提取物)，再加入1mL甲醇超聲溶解，再加甲醇定容至1mL，用高效液相色譜儀。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)施例7、8、9、10測(cè)定的甘草酸含量依次為0.41mg/g、0.32mg/g、0.28mg/g、0.12mg/g。
抗敏蛋白LSP1由北京華大蛋白公司鑒定，其序列(SEQ ID NO.1)為：
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大學(xué)
<120> 一種促進(jìn)甘草不定根中甘草酸積累的組培方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 341
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae strain
<400> 1
Met His Arg Thr Tyr Ser Leu Arg Asn Gln Arg Ala Pro Thr Ala Ala
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Thr Lys Ser Lys Phe
20 25 30
Phe Gly Lys Ala Ser Ile Ala Ser Ser Phe Arg Lys Asn Ala Ala Gly
35 40 45
Asn Phe Gly Pro Glu Leu Ala Arg Lys Leu Ser Gln Leu Val Lys Thr
50 55 60
Glu Lys Gly Val Leu Arg Ala Met Glu Val Val Ala Ser Glu Arg Arg
65 70 75 80
Glu Ala Ala Lys Gln Leu Ser Leu Trp Gly Ala Asp Asn Asp Asp Asp
85 90 95
Val Ser Asp Val Thr Asp Lys Leu Gly Val Leu Ile Tyr Glu Leu Gly
100 105 110
Glu Leu Gln Asp Gln Phe Ile Asp Lys Tyr Asp Gln Tyr Arg Val Thr
115 120 125
Leu Lys Ser Ile Arg Asn Ile Glu Ala Ser Val Gln Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Arg Lys Glu Lys Ile Thr Asp Glu Ile Ala His Leu Lys Tyr Lys Asp
145 150 155 160
Pro Gln Ser Thr Lys Ile Pro Val Leu Glu Gln Glu Leu Val Arg Ala
165 170 175
Glu Ala Glu Ser Leu Val Ala Glu Ala Gln Leu Ser Asn Ile Thr Arg
180 185 190
Glu Lys Leu Lys Ala Ala Tyr Ser Tyr Met Phe Asp Ser Leu Arg Glu
195 200 205
Leu Ser Glu Lys Phe Ala Leu Ile Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Leu Leu
210 215 220
Glu Leu Leu Asp Asp Ser Pro Val Thr Pro Gly Glu Ala Arg Pro Ala
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Tyr Glu Ala Ser Arg Gln Ile Ile Met Asp Ala Glu Ser
245 250 255
Ala Leu Glu Ser Trp Thr Leu Asp Met Ala Ala Val Lys Pro Thr Leu
260 265 270
Ser Phe His Gln Thr Val Asp Asp Val Tyr Glu Asp Glu Asp Gly Glu
275 280 285
Glu Glu Glu Glu Pro Glu Ile Gln Asn Gly Asp Ile Pro Gly Gln Val
290 295 300
Val Glu Glu Glu Glu Val Glu Trp Thr Thr Glu Val Pro Val Asp Asp
305 310 315 320
Glu Ala His Glu Ala Asp His His Val Ser Gln Asn Gly His Thr Ser
325 330 335
Gly Ser Glu Asn Ile
340