本發(fā)明涉及一種花粉長期保存方法，具體是一種桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存方法。

背景技術(shù)：

桃葉衛(wèi)矛，又名白杜、絲綿木，是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬的一種小喬木，是我國常見的觀賞類庭園樹種之一，其葉形秀麗，植株繁茂，包被有紅色假種皮的果實可長期宿存于枝頭，到了冬季，白雪紅果相映，十分美麗，為冬季的北方園林增添了不少色彩。桃葉衛(wèi)矛在耐寒、抗旱、抗風(fēng)等方面具有良好的適應(yīng)性；桃葉衛(wèi)矛果實總皂苷對人肝癌細胞系-SMMC、人宮頸癌細胞系-HeLa和乳腺癌細胞系-MCF7有明顯的抑制生長作用；桃葉衛(wèi)矛的種子含豐富的脂肪類物質(zhì)，含油率高達40％以上，可用做工業(yè)用油；木材細膩堅韌，可用于雕刻、制帆桿或滑車等；種子及根藥用，可用于治療膝關(guān)節(jié)痛、漆瘡等疾病。由此可見，桃葉衛(wèi)矛是一種集工業(yè)、藥用、觀賞應(yīng)用于一體的植物，具有較高的推廣價值。若采用傳統(tǒng)的種植保存，極易使其受到病菌或蟲害的影響，進而造成極大的人力財力的損失,成熟的花粉含有植物的全部遺傳品質(zhì)信息，花粉超低溫保存操作簡單，是進行種質(zhì)資源保存的一條新途徑，是目前唯一可行的長期而穩(wěn)定地保存種質(zhì)資源的方法。

植物種質(zhì)資源超低溫保存是指將植物細胞、組織或器官在液氮(-196℃)的超低溫條件下進行保存。在如此低的溫度下，植物材料中參與新陳代謝的各種生物酶的活性受到極大抑制，生物體新陳代謝基本停止，處于“假死”狀態(tài)，利用該方法可以實現(xiàn)植物種質(zhì)資源的永久保存。目前成功進行超低溫保存的材料類型有種子、休眠芽、莖尖分生組織、花粉、合子胚(胚軸)、體細胞胚、懸浮細胞、愈傷組織、原生質(zhì)體等。其中花粉超低溫保存操作簡單，可保持特定的基因型。

將超低溫保存技術(shù)應(yīng)用于花粉保存，其優(yōu)點：操作簡單易行、占用空間小、安全穩(wěn)定保存成本低可以大大延長花粉的保存時間，使花粉的貯運和交換成為可能，同時還能很好服務(wù)于育種工作，提高育種效率經(jīng)過低溫保存的花粉能保持其遺傳完整性和穩(wěn)定性低溫條件下還可以避免病蟲害的引入，為地區(qū)間、國際間的種質(zhì)交換提供方便。

桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存目前還未見報道。因此，研發(fā)一種適合于桃葉衛(wèi)矛花粉的可行的超低溫保存方法是非常必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

將不同時間采集的桃葉衛(wèi)矛新鮮花粉放入1.8ml的凍存管中，花粉的體積不超過凍存管容量的2/3，然后將冷凍管放入盛有硅膠干燥劑的干燥皿內(nèi)干燥不同的時間后獲得不同含水量的花粉，干燥皿規(guī)格為V＝410mm×410mm×310mm、Φ＝300mm；將裝有花粉的凍存管投入﹣196℃液氮罐中保存；取出凍存管進行不同化凍處理；化凍后將花粉在不同濃度的蔗糖和硼酸培養(yǎng)液中測定萌發(fā)率。

所述不同采集時間，1d中不同時間所采集的花粉萌發(fā)率不同，我們分別采集了6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00的桃葉衛(wèi)矛花粉。

所述干燥不同的時間分別為干燥2h、4h、6h、8h、10h、12h。

所述不同含水量，為桃葉衛(wèi)矛花粉干燥的時間不同，得到的含水量。

所述不同化凍方式，分別為三種：(1)室溫化凍30min；(2)40℃水浴化凍2min；(3)自來水沖洗8min。

所述不同蔗糖和硼酸濃度，以桃葉衛(wèi)矛花粉為材料，去離子水作為溶劑，加入不同濃度的蔗糖和硼酸，采用二因素完全隨機的方法，共設(shè)計了16種不同培養(yǎng)基。分別為：蔗糖50g/L+硼酸0mg/L；蔗糖50g/L+硼酸100mg/L；蔗糖50g/L+硼酸150mg/L；蔗糖50g/L+硼酸200mg/L；蔗糖100g/L+硼酸0mg/L；蔗糖100g/L+硼酸100mg/L；蔗糖100g/L+硼酸150mg/L；蔗糖100g/L+硼酸200mg/L；蔗糖150g/L+硼酸0mg/L；蔗糖150g/L+硼酸100mg/L；蔗糖150g/L+硼酸150mg/L；蔗糖150g/L+硼酸200mg/L；蔗糖200g/L+硼酸0mg/L；蔗糖200g/L+硼酸100mg/L；蔗糖200g/L+硼酸150mg/L；蔗糖200g/L+硼酸200mg/L。

通過對以上技術(shù)方案進行實驗找出最佳一種桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存方法，用于權(quán)利要求。

具體實施方式：

以下對本發(fā)明結(jié)合具體的實例作進一步的詳細說明，并介紹本發(fā)明的相關(guān)研究結(jié)果。

1.以東北林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的桃葉衛(wèi)矛花粉為例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

1)不同采集時間對桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響

從桃葉衛(wèi)矛開花的一天中選定不同的時段，即6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00每隔兩小時采集花粉，觀察其萌發(fā)率。

表1 不同采集時間對桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響

2)經(jīng)不同干燥時間得不同含水量花粉超低溫保存前后萌發(fā)率

首先采用烘干法測得桃葉衛(wèi)矛花粉的最大含水量后，利用硅膠干燥法進行花粉不同含水量梯度的配制，然后測定花粉的萌發(fā)率；后將其投入液氮罐中保存一段時間后取出，經(jīng)化凍后測定桃葉衛(wèi)矛花粉經(jīng)超低溫保存后的萌發(fā)率。

表2 不同干燥時間得不同含水量花粉超低溫保存前萌發(fā)率

表3 不同干燥時間得不同含水量花粉超低溫保存后萌發(fā)率

3)不同化凍方式對花粉萌發(fā)率的影響

采用了3種化凍方式(1)室溫化凍30min；(2)40℃水浴化凍2min；(3)自來水沖洗8min對桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存24h后的進行化凍試驗，比較3種化凍方式對花粉萌發(fā)力的影響。

表4 不同化凍方式對花粉萌發(fā)率的影響

4)不同蔗糖和硼酸濃度對桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響

以桃葉衛(wèi)矛花粉為材料，去離子水作為溶劑，加入不同濃度的蔗糖和硼酸，采用二因素完全隨機的方法，共設(shè)計了16種不同培養(yǎng)基。在培養(yǎng)液上均勻地撒播桃葉衛(wèi)矛花粉，然后將其放置在25℃人工氣候箱中光照培養(yǎng)一段時間后觀察花粉萌發(fā)狀況，根據(jù)花粉的萌發(fā)率從而確定桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)液。

表5 不同濃度蔗糖和硼酸對桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響

2.實驗結(jié)果

1)由表1可知，由于采集的時間的不同，花粉萌發(fā)率是不同的，其大致趨勢為：6:00-12：00時段為下降趨勢，在12:00花粉萌發(fā)率降至最低；而在12:00-16：00時段花粉萌發(fā)率呈上升趨勢，并在16:00時到達最高；在隨后的16:00-18:00時段，花粉萌發(fā)率逐步下降。由此可得出，16:00的桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率最高。

2)由表2，表3可以看出不同含水量的桃葉衛(wèi)矛花粉在保存前的萌發(fā)率在液氮保存前的萌發(fā)率沒有顯著的差異，但當(dāng)花粉經(jīng)過液氮保存后，出現(xiàn)了顯著的差異。當(dāng)桃葉衛(wèi)矛花粉含水量為初始狀態(tài)(14.56％)時，液氮保存后的花粉全部死亡，隨著花粉含水量的進一步降低，在12.32％-4.14％的含水量區(qū)間內(nèi)，超低溫保存后的花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)出逐步升高的趨勢。而當(dāng)花粉含水量進一步從4.14％降低至1.67％時，超低溫保存后的花粉萌發(fā)率又開始降低，并最終全部死亡，因此將裝有花粉的凍存管放入盛有硅膠干燥劑的干燥皿內(nèi)干燥10h，使花粉含水量保持在4％～4.5％之間；花粉的萌發(fā)率最高。

3)由表4可知，化凍方式對保存后的桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率有極顯著影響，采用室溫化凍30min后桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率可達14.34％，其效果要優(yōu)于40℃水浴化凍2min和室溫化凍30min這兩種化凍方式。由此可以推斷室溫化凍30min的化凍效果較好。

4)由表5可知，桃葉衛(wèi)矛花粉在不同配方的培養(yǎng)液中萌發(fā)情況有差異?；ǚ墼谡崽菨舛葹?00g/L時萌發(fā)率達到最高，而隨著蔗糖濃度的進一步增加，花粉的萌發(fā)率又降低。結(jié)合桃葉衛(wèi)矛花粉的萌發(fā)率，最終我們篩選出葉衛(wèi)矛花粉培養(yǎng)液中蔗糖濃度和硼酸濃度最適配比為：蔗糖100g/L+硼酸150mg/L。