本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種臍帶保存液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：臍帶是胎兒時(shí)期連接母體與胎兒的索狀結(jié)構(gòu)，其外被羊膜，內(nèi)含2條臍動(dòng)脈、1條臍靜脈，在動(dòng)靜脈之間含有特殊的胚胎粘液樣結(jié)締組織-華爾通氏膠(WhartonpsJelly)，從華爾通氏膠分離得到的基質(zhì)細(xì)胞即為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)。1991年McElreavery首次從人臍帶華通氏膠分離培養(yǎng)出一種具有多項(xiàng)分化潛能的成纖維樣細(xì)胞，即人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)。hUC-MSCs比來源于骨髓、脂肪以及其他組織的MSCs更具有優(yōu)勢，首先，臍帶來源不受倫理爭議，并且成本較低；其次，hUC-MSCs不會(huì)引起畸胎瘤，并且具有抑癌性，由于hUC-MSCs還具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)、基質(zhì)支持、旁分泌、遷移和基因穩(wěn)定性，故具有良好的臨床治療潛能。臍帶在采集、運(yùn)輸、分離的過程中都需要處于無菌狀態(tài)，由于孕婦分娩時(shí)間的不確定性，臍帶在采集后不能完全保證馬上用于原代分離，大多數(shù)情況下都需要保存一段時(shí)間，臍帶保存液的功效決定了臍帶原代分離的成功率，傳統(tǒng)采用將臍帶組織浸沒在含多種組分的PBS中，例如專利CN101868536A公開了一種保存液，配方為186μg/mLCaCl2·2H2O，400μg/mLKCl，60μg/mLKH2PO4，200μg/mLMgSO4·7H2O，8000μg/mLNaCl，350μg/mLNaHCO3，90μg/mLNaH2PO4·7H2O，2000μg/mL葡萄糖、及青霉素和鏈霉素的1％等摩爾混合物。但是，這種PBS保存液配制較為復(fù)雜和繁瑣，自行配置工作量較大，而購買成品，因?yàn)槠鋬r(jià)格昂貴導(dǎo)致成本增加。針對上述問題，現(xiàn)有專利CN102550543A公開了一種成分簡單的臍帶保存液，由生理鹽水、青霉素和鏈霉素組成。雖然在該保存液制備上比較簡單，而且成本也較低，但是在保存臍帶的效果方面卻較差，易造成臍帶腫脹或遍體通紅，而且保存的臍帶在制備hUC-MSCs時(shí)，爬出細(xì)胞所需天數(shù)普遍較長。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種臍帶保存液及其應(yīng)用，使得所述臍帶保存液組成簡單，同時(shí)保證臍帶較好的保存效果，減少hUC-MSCs爬出細(xì)胞所需天數(shù)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種臍帶保存液，包括生理鹽水、葡萄糖、維生素H、葉酸、青霉素和鏈霉素。針對現(xiàn)有臍帶保存制劑成分復(fù)雜以及保存效果不佳的問題，本發(fā)明簡化保存液中的成分，同時(shí)從臍帶的保存效果角度考慮，選擇幾種適宜的組分組成一種能夠保證臍帶較好的保存效果，減少hUC-MSCs爬出細(xì)胞所需天數(shù)的新型臍帶保存液。其中，作為優(yōu)選，葡萄糖濃度為2000-4000mg/L，維生素H濃度為0.1-0.6mg/L，葉酸濃度為1.0-5.0mg/L，青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，上述各組分濃度可選擇如下：(1)葡萄糖濃度為2000mg/L，維生素H濃度為0.2mg/L，葉酸濃度為2.0mg/L，青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL；(2)葡萄糖濃度為4000mg/L，維生素H濃度為0.6mg/L，葉酸濃度為5.0mg/L，青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL；(3)葡萄糖濃度為3000mg/L，維生素H濃度為0.4mg/L，葉酸濃度為3.0mg/L，青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL。此外，為了能夠及時(shí)掌握保存液是否已經(jīng)產(chǎn)生變質(zhì)，本發(fā)明保存液中還可以加入酚紅。優(yōu)選地，所述酚紅的濃度為5.0mg/L。本發(fā)明保存液和傳統(tǒng)的PBS保存液以及專利CN102550543A實(shí)施例1保存液進(jìn)行保存效果和爬出細(xì)胞所需天數(shù)的對比試驗(yàn)，結(jié)果顯示，經(jīng)過本發(fā)明保存液保存48h后，所有臍帶均表現(xiàn)正常，而傳統(tǒng)的PBS保存液和專利CN102550543A實(shí)施例1保存液在保存臍帶48h后，分別出現(xiàn)了臍帶遍體通紅和腫脹的異常狀態(tài)，無法用于hUC-MSCs的制備；在通過組織塊培養(yǎng)法制備hUC-MSCs時(shí)，經(jīng)過本發(fā)明保存液保存的臍帶在爬出細(xì)胞所需天數(shù)上較另外兩者時(shí)間短，表現(xiàn)出更好的活力。由此，本發(fā)明隨之提供了本發(fā)明所述臍帶保存液在保存臍帶和/或制備保存臍帶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明提供了一種保存臍帶的方法，將臍帶分離后置于權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述臍帶保存液中，于4℃下保存。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選擇生理鹽水、葡萄糖、維生素H、葉酸以及雙抗作為臍帶保存液的組分，相比傳統(tǒng)的PBS加雙抗的保存液，本發(fā)明組成更加簡單，而在臍帶保存效果上卻表現(xiàn)出較為出色的功效，不僅能夠保證臍帶正?；?，而且縮短爬出細(xì)胞的所需天數(shù)，為臍帶原代分離hUC-MSCs提供了較好地條件。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例公開了一種臍帶保存液及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應(yīng)用已通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。以下就本發(fā)明所提供的一種臍帶保存液及其應(yīng)用做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1：本發(fā)明所述臍帶保存液葡萄糖濃度為2000mg/L，維生素H濃度為0.2mg/L，葉酸濃度為2.0mg/L，青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL，酚紅濃度為5.0mg/L。實(shí)施例2：本發(fā)明所述臍帶保存液葡萄糖濃度為4000mg/L，維生素H濃度為0.6mg/L，葉酸濃度為5.0mg/L，青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL。實(shí)施例3：本發(fā)明所述臍帶保存液葡萄糖濃度為3000mg/L，維生素H濃度為0.4mg/L，葉酸濃度為3.0mg/L，青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL。實(shí)施例4：臍帶保存試驗(yàn)保存液A-C：實(shí)施例1-實(shí)施例3保存液；保存液D：傳統(tǒng)PBS+1倍雙抗(青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL)；傳統(tǒng)PBS1L配方:氯化鈉(NaCl)，8g；氯化鉀(KCl)，0.2g；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，1.44g；磷酸二氫鉀(KH2PO4)，0.24g；調(diào)pH7.2,定容1L，然后高壓蒸汽滅菌，4℃保存。保存液E：專利CN102550543A實(shí)施例1保存液；方法：采集臍帶20條(均經(jīng)過產(chǎn)婦授權(quán)同意，胎兒均足月生產(chǎn)且產(chǎn)婦無傳染性疾病)，每條臍帶平均截?cái)?份，分別置于中保存液A-E中，均置于4℃保存48h。保存48h后，觀察臍帶形態(tài)和顏色，同時(shí)使用組織塊培養(yǎng)法分離接種，加入DMEM/F12+20％FBS，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)爬出細(xì)胞的天數(shù)，待細(xì)胞融合度達(dá)80％以上進(jìn)行傳代。結(jié)果見表1。表1臍帶保存試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例5：細(xì)胞免疫表型分析取保護(hù)液A組第3代細(xì)胞，消化后清洗3次，制成細(xì)胞懸液，加入抗體，流式細(xì)胞儀檢測分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表達(dá)情況。結(jié)果見表2。表2CD73CD90CD105CD11bCD19CD34CD45HLA-DR100.00％99.70％96.30％0.00％0.00％0.00％0.10％0.20％由表2的流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果可知，保護(hù)液A組第3代細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45，CD11，HLA-DR和CD19，而整合素和黏附分子CD90，以及常用的人間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD73，CD105則均呈高表達(dá)，符合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。此外，將保護(hù)液B、C兩組第3代細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果相同。實(shí)施例6：體外向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測取保護(hù)液A組第3代細(xì)胞，按2.5*104細(xì)胞濃度接種于含有DMEM/F12+20％FBS培養(yǎng)基的24孔板中，至細(xì)胞80％融合時(shí)，更換為含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰島素、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培養(yǎng)液，每周換液2次，3周后用多聚甲醛固定，油紅O染色。結(jié)果顯示，保護(hù)液A組第3代細(xì)胞可以形成脂肪細(xì)胞，油紅O染色發(fā)現(xiàn)后者細(xì)胞漿充滿了油滴空泡，說明該保存液保存臍帶后得到的細(xì)胞具有正常的分化能力。此外，將保護(hù)液B、C兩組第3代細(xì)胞進(jìn)行成脂分化，結(jié)果相同。以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3