專利名稱：一種臍帶保存液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種短期保存采集后到分離前的臍帶的保存液。
背景技術(shù)：
臍帶是連接胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)，除了有兩條動脈和一條靜脈三根血管外，血管和羊膜之間疏松的膠狀物質(zhì)(我們稱之為華通氏膠)里還含有豐富的臍帶間充質(zhì)干細胞。 間充質(zhì)干細胞是干細胞家族的重要成員，具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、 免疫調(diào)控和自我復制等特點，是用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復理想的種子細胞。臍帶間充質(zhì)干細胞因其來源廣泛，易獲得，并具有間充質(zhì)干細胞的所有特性，日益受到人們的關(guān)注，越來越多的人開始儲存臍帶間充質(zhì)干細胞以備將來不時之需。儲存臍帶間充質(zhì)干細胞包括臍帶的采集、運輸、交接、檢測、分離、凍存、復蘇、原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)等諸多步驟，在臍帶采集后到分離前需要運輸、交接和檢測三個步驟，實際操作中需要存放較長的時間。臍帶一旦采集，脫離了原有的體內(nèi)環(huán)境，其中間充質(zhì)干細胞的活性會受很多的因素的影響，諸如時間、溫度、滲透壓等。目前的臍帶間充質(zhì)干細胞的保存很多情況需要異地采集， 運輸、交接和檢測三個步驟所用的時間就更長，臍帶需存放的時間較長，影響因素就更加的復雜。所以，對采集的臍帶進行必要的保存是臍帶間充質(zhì)干細胞儲存中不可缺少的重要步馬聚ο目前，國內(nèi)的臍帶保存多采用直接裝瓶或者補加基礎(chǔ)培養(yǎng)基的方法來保存臍帶。 直接裝瓶臍帶的保存時間一般少于M小時，給臍帶的運輸、交接和檢測帶來了不小的時間壓力，也限制了臍帶間充質(zhì)干細胞保存業(yè)務(wù)發(fā)展的范圍；另外，通過加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基來保存臍帶，因為基礎(chǔ)培養(yǎng)基不能達到臨床級別的要求，為臍帶間充質(zhì)干細胞的保存帶來了風險， 而且基礎(chǔ)培養(yǎng)基富含營養(yǎng)物質(zhì)，臍帶的新陳代謝不能有效減少，新陳代謝的廢物隨時間累積也會影響臍帶間充質(zhì)干細胞的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中保存時間短、干細胞活性受影響、基礎(chǔ)培養(yǎng)基達不到臨床使用級別的問題，而提供一種既能達到臨床標準又能有效保存臍帶的保存液，該保存液配比簡單，操作容易實現(xiàn)，使采集后的臍帶在運輸、交接、分離前檢測等過程中，能夠在較長時間內(nèi)有效保存生物活性，提高取材使用效率。為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種臍帶保存液，在IL臍帶保存液中含有氯化鈉6000-6800mg、葡萄糖1000_2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg、氯化鉀250-400mg、無水氯化鈣50_300mg、頭孢哌酮鈉100_150mg、酚紅l_10mg，余量為注射用水。進一步地，在IL臍帶保存液中含有氯化鈉6200-6600mg、葡萄糖1000_1200mg、 人血清白蛋白10000-12000 mg、氯化鉀300-400mg、無水氯化鈣150-200mg、頭孢哌酮鈉120-130mg、酚紅4-6mg，余量為注射用水。如上所述的全部成分均為注射級別。一種臍帶保存液的制備方法，包括以下步驟
(a)取0.5L的注射用水，加入氯化鈉6000-6800mg、氯化鉀250_400mg、無水氯化鈣 50-300mg后充分混勻；
(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg后充分混勻；
(c)取0.IL的注射用水，加入頭孢哌酮鈉100-150mg后充分混勻；
(d)取0.IL的注射用水，加入酚紅I-IOmg后充分混勻；
(e)將步驟(a)(b) (c) (d)分別得到的溶液加入到同一容器中，混勻后觀察溶液是否澄清，若有沉淀，將溶液置磁力攪拌器上攪拌直至溶液澄清；
(f)將步驟(e)所得混合溶液中補加注射用水至1L，此時溶液顏色應(yīng)為紫紅色，若溶液顏色呈桔黃，則說明配置過程有問題應(yīng)及時廢棄，以0. 22um濾器過濾后2-10°C保存，即為臍帶保存液。本發(fā)明臍帶保存液中的主要成分氯化鈉、氯化鉀、無水氯化鈣的主要作用是維持臍帶內(nèi)細胞的滲透平衡；主要成分葡萄糖、人血清白蛋白的主要作用是短時間提供營養(yǎng)成分又盡可能的減少代謝；主要成分注射用水的主要作用是保持臍帶的濕潤狀態(tài)和溶解保存液的有效成分；輔助成分頭孢哌酮鈉和酚紅的作用是對可能發(fā)生的污染進行預(yù)防和提示已經(jīng)發(fā)生的污染。本發(fā)明的臍帶保存液用于保存從臍帶采集后到臍帶分離前的人來源的臍帶。本發(fā)明的臍帶保存液可以在保存臍帶的過程中降低臍帶的新陳代謝，減少代謝物的累積，又能提供一些基本的營養(yǎng)物質(zhì)和能量物質(zhì)，以維持最低的代謝水平，能有效地保存臍帶中的間充質(zhì)干細胞的活性，大大減少運輸、交接、檢測的時間限制。經(jīng)此種保存液保存的臍帶，分離出的間充質(zhì)干細胞活性受時間的影響很小，大大減少了臍帶從采集到制備的時間限制，且所用的所有成分均符合臨床標準，污染率小。經(jīng)此保存液2-10°C恒溫保存的臍帶，在保存 72小時后臍帶中細胞活性是采集的新鮮臍帶的95%，采集保存后的臍帶同不加任何溶液保存的臍帶的污染率相比，由1. 2%降到了 0. 15%。


圖1為經(jīng)保存液保存的72小時的臍帶分離后培養(yǎng)出的Pl代臍帶間充質(zhì)干細胞。
具體實施例方式實施例1
一種臍帶保存液，是在IL保存液中包含氯化鈉6000mg、葡萄糖lOOOmg、人血清白蛋白 lOOOOmg、氯化鉀250mg、無水氯化鈣50mg、頭孢哌酮鈉100mg、酚紅lmg，余量為注射用水，上述的全部成分均為注射級別。該保存液制備方法為
(a)取0. 5L的注射用水，加入氯化鈉6000mg、氯化鉀250mg、無水氯化鈣50mg后充分混
勻；(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖lOOOmg、人血清白蛋白IOOOOmg后充分混勻；
(c)取0.IL的注射用水，加入頭孢哌酮鈉IOOmg后充分混勻；
(d)取0.IL的注射用水，加入酚紅Img后充分混勻；
(e)將步驟(a)(b) (c) (d)分別得到的溶液加入到同一容器中，混勻后觀察溶液是否澄清，若有沉淀，將溶液置磁力攪拌器上攪拌直至溶液澄清；
(f)將步驟(e)所得混合溶液中補加注射用水至1L，此時溶液顏色應(yīng)為紫紅色，以 0. 22um濾器過濾后2-10°C保存，即為臍帶保存液。實施例2
一種臍帶保存液，是在IL保存液中包含氯化鈉6800mg、葡萄糖2000mg、人血清白蛋白 20000mg、氯化鉀400mg、無水氯化鈣300mg、頭孢哌酮鈉150mg、酚紅10mg，余量為注射用水， 上述的全部成分均為注射級別。該保存液制備方法為
(a)取0.5L的注射用水，，加入氯化鈉6800mg、氯化鉀400mg、無水氯化鈣300mg后充分混勻；
(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖2000mg、人血清白蛋白20000mg后充分混勻；
(c)取0.IL的注射用水，加入頭孢哌酮鈉150mg后充分混勻；
(d)取0.IL的注射用水，加入酚紅IOmg后充分混勻；
(e)將步驟(a)(b) (c) (d)分別得到的溶液加入到同一容器中，混勻后觀察溶液是否澄清，若有沉淀，將溶液置磁力攪拌器上攪拌直至溶液澄清；
(f)將步驟(e)所得混合溶液中補加注射用水至1L，此時溶液顏色應(yīng)為紫紅色，以 0. 22um濾器過濾后2-10°C保存，即為臍帶保存液。實施例3
一種臍帶保存液，是在IL保存液中包含氯化鈉6500mg、葡萄糖1500mg、人血清白蛋白 15000mg、氯化鉀300mg、無水氯化鈣150mg、頭孢哌酮鈉120mg、酚紅5mg，余量為注射用水， 上述的全部成分均為注射級別。該保存液制備方法為
(a)取0.5L的注射用水，加入氯化鈉6500mg、氯化鉀300mg、無水氯化鈣150mg后充分混勻；
(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖1500mg、人血清白蛋白15000mg后充分混勻；
(c)取0.IL的注射用水，加入頭孢哌酮鈉120mg后充分混勻；
(d)取0.IL的注射用水，加入酚紅5mg后充分混勻；
(e)將步驟(a)(b) (c) (d)分別得到的溶液加入到同一容器中的溶液加入到同一容器， 混勻后觀察溶液是否澄清，若有沉淀，將溶液置磁力攪拌器上攪拌直至溶液澄清；
(f)將步驟(e)所得混合溶液中補加注射用水至1L，此時溶液顏色應(yīng)為紫紅色，以 0. 22um濾器過濾后2-10°C保存，即為臍帶保存液。臍帶的采集及保存實施例1-3所述的臍帶保存液均用于保存從臍帶采集后到臍帶分離前的人來源的臍帶，即胎兒娩出后10秒鐘內(nèi)，按手術(shù)常規(guī)結(jié)扎臍帶后剪斷采集，將采集的臍帶放入裝有醫(yī)用酒精的消毒瓶中，浸泡1分鐘，再放入裝有無菌生理鹽水的清洗瓶中浸泡1分鐘后，放入裝有本發(fā)明所述的臍帶保存液的臍帶采集瓶中，擰緊瓶蓋并密封，放入恒溫箱中2-10°C恒溫保存至分離。保存液的保存效果對比胎兒娩出后10秒鐘內(nèi)，按手術(shù)常規(guī)結(jié)扎臍帶后剪斷采集，將采集的臍帶放入裝有醫(yī)用酒精的消毒瓶中，浸泡1分鐘，再放入裝有無菌生理鹽水的清洗瓶中浸泡1分鐘后，均分為5段，分別保存在本發(fā)明的臍帶保存液、磷酸鹽緩沖液PBS、 生理鹽水和培養(yǎng)基DMEM/F12中，最后一段直接將臍帶單獨放置，在2-10°C恒溫保存M小時、48小時、72小時后分離，取相同克數(shù)組織塊常規(guī)培養(yǎng)15天后，消化計數(shù)，留一段新鮮的臍帶小段不保存作為對照，直接分離后取相同克數(shù)組織塊常規(guī)培養(yǎng)15天，消化后計數(shù)為 1. 02Φ106。保存結(jié)果顯示如下
權(quán)利要求
1.一種臍帶保存液，其特征在于，在IL臍帶保存液中含有氯化鈉6000-6800mg、葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg、氯化鉀250_400mg、無水氯化鈣50_300mg、 頭孢哌酮鈉100-150mg、酚紅Ι-lOmg，余量為注射用水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶保存液，其特征在于，在IL臍帶保存液中含有氯化鈉6200-6600 mg、葡萄糖1000-1200mg、人血清白蛋白10000-12000 mg、氯化鉀 300-400mg、無水氯化鈣150-200mg、頭孢哌酮鈉120_130mg、酚紅4_6mg，余量為注射用水。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種臍帶保存液的制備方法，包括以下步驟(a)取0.5L的注射用水，加入氯化鈉6000-6800mg、氯化鉀250_400mg、無水氯化鈣 50-300mg后充分混勻；(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg后充分混勻；(c)取0.IL的注射用水，加入頭孢哌酮鈉100-150mg后充分混勻；(d)取0.IL的注射用水，加入酚紅I-IOmg后充分混勻；(e)將步驟(a)(b) (c) (d)分別得到的溶液加入到同一容器中，混勻后觀察溶液是否澄清，若有沉淀，將溶液置磁力攪拌器上攪拌直至溶液澄清；(f)將步驟(e)所得混合溶液中補加注射用水至1L，以0.22um濾器過濾后2_10°C保存，即為臍帶保存液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種臍帶保存液，用來短期保存采集后到分離前的臍帶。該臍帶保存液的主要成分為氯化鈉、葡萄糖、人血清白蛋白、氯化鉀、無水氯化鈣，輔助成分為頭孢哌酮鈉和酚紅。其主要成分的作用是維持臍帶組織內(nèi)細胞的滲透平衡、保持臍帶的濕潤狀態(tài)和短時間提供營養(yǎng)成分；輔助成分的作用是對可能發(fā)生的污染進行預(yù)防和提示已經(jīng)發(fā)生的污染。使用此保存液可以保存臍帶內(nèi)間充質(zhì)干細胞的活性，臍帶在2℃-10℃的情況下有效保存至少72小時，分離出的間充質(zhì)干細胞活性受時間的影響很小，大大減少了臍帶從采集到制備的時間限制，所用的所有成分均符合臨床使用標準，并能有效降低污染概率。
文檔編號A01N1/02GK102334472SQ20111021939
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者宋云慶, 成玉萍, 李俊, 楊兵 申請人:江蘇省北科生物科技有限公司