本申請(qǐng)要求2014年6月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/014,916的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益。在此通過(guò)提及將本申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)中。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明關(guān)注自在蘇云金芽孢桿菌中找到的新型營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)殺蟲(chóng)蛋白毒素開(kāi)發(fā)的新型殺蟲(chóng)蛋白毒素及其用于控制昆蟲(chóng)的用途。發(fā)明背景昆蟲(chóng)和其它害蟲(chóng)在作物損失和控制這些害蟲(chóng)的費(fèi)用方面每年導(dǎo)致農(nóng)民花費(fèi)數(shù)十億美元。除了田間作物的損失外，昆蟲(chóng)害蟲(chóng)也對(duì)蔬菜和水果種植者，觀賞花卉的生產(chǎn)者和家庭園藝師造成負(fù)擔(dān)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中由昆蟲(chóng)害蟲(chóng)引起的損失包括作物產(chǎn)率的降低，作物質(zhì)量的降低和收獲成本的增加。昆蟲(chóng)害蟲(chóng)主要通過(guò)化學(xué)殺蟲(chóng)劑(pesticides)的密集應(yīng)用來(lái)控制，所述化學(xué)殺蟲(chóng)劑通過(guò)抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)，防止昆蟲(chóng)進(jìn)食或繁殖或?qū)е滤劳龆l(fā)揮作用。因此，可以達(dá)到良好的昆蟲(chóng)控制，但是這些化學(xué)品有時(shí)也可以影響其它有益昆蟲(chóng)。源自廣泛使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑的另一個(gè)問(wèn)題是昆蟲(chóng)抗性群體的出現(xiàn)。這已經(jīng)通過(guò)各種抗性管理實(shí)踐得到部分緩解，但是對(duì)替代的害蟲(chóng)控制劑的需求日益增加。生物害蟲(chóng)控制劑，諸如表達(dá)殺蟲(chóng)毒素如δ-內(nèi)毒素的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)菌株也已經(jīng)應(yīng)用于作物植物產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)果，提供了對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的備選或補(bǔ)充。已經(jīng)分離了編碼這些δ-內(nèi)毒素中某一些的基因，并且已經(jīng)顯示它們?cè)诋愒此拗髦械谋磉_(dá)提供了用于控制經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的另一種工具。特別地，在轉(zhuǎn)基因植物中殺蟲(chóng)毒素(諸如蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素)的表達(dá)已經(jīng)提供了針對(duì)選定的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的有效保護(hù)，并且表達(dá)此類(lèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，為農(nóng)民減少化學(xué)昆蟲(chóng)控制劑的應(yīng)用創(chuàng)造了條件。土壤微生物蘇云金芽孢桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性的孢子形成細(xì)菌，其特征在于伴孢結(jié)晶蛋白包含體。蘇云金芽孢桿菌仍然是用于開(kāi)發(fā)植物整合殺蟲(chóng)劑的新型殺蟲(chóng)蛋白的主要來(lái)源。使用細(xì)菌分離株的各種菌株，我們發(fā)明了新的Bt毒素，其對(duì)商業(yè)上重要的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)有活性。在北美玉米昆蟲(chóng)抗性市場(chǎng)中，草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(秋粘蟲(chóng)(fallarmyworm)“FAW”)，歐洲玉米螟(OstrinianubialisHübner)(歐洲玉米螟“ECB”)和谷實(shí)夜蛾(HelicoverpazeaBoddie)(玉米穗蟲(chóng)“CEW”)是最關(guān)鍵的害蟲(chóng)，盡管其它地區(qū)中存在其它關(guān)鍵的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)(例如棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)(棉鈴蟲(chóng)(cottonbollworm)“CBW”或玉米穗蟲(chóng)“CEW”))，和其他次要但重要的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)物種。Bt毒素占生物殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)的90％以上，為已經(jīng)開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因作物提供昆蟲(chóng)攝食抗性的基因幾乎全部來(lái)源于Bt毒素。Bt細(xì)菌生成殺蟲(chóng)δ-內(nèi)毒素，包括晶體(Cry)，細(xì)胞毒素(Cyt)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)殺蟲(chóng)蛋白(VIP)毒素，這取決于它們的基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。Cry毒素在孢子形成期間作為不溶性晶體蛋白生成。VIP毒素則在Bt細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段中作為可溶性蛋白質(zhì)生成。VIP蛋白在其結(jié)構(gòu)上不同于Cry蛋白，但是與Cry毒素一樣擁有作用于昆蟲(chóng)中腸中的細(xì)胞的成孔劑(poreformer)的性質(zhì)(Yu,C.-G.,etal.,1997Appl.Environ.Microbiol.63:532-536,Lee,M.K.,etal.,2003,Appl.Environ.Microbiol.69:4648-4657,Shotkoski,F.,etal.,2003,Proc.BeltwideCottonConf,89-93)。我們?cè)诖嗣枋隽诵耉IP毒素的發(fā)明，這些毒素具有廣譜殺蟲(chóng)活性，包括針對(duì)ECB的殺蟲(chóng)活性，其與目前已知的VIP蛋白(Yu,C.-G.,etal.,1997Appl.Environ.Microbiol.63:532-536)相比是獨(dú)特的。專(zhuān)利文獻(xiàn)WO2013/134523，WO94/21795，WO96/10083，5,877,012，6,107,279，6,137,033，和6,291,156，以及Estruchetal.(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-5394)和Yuetal.(1997,Appl.Environ.Microbiol.63:532-536)描述了稱為VIP3的一類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白。VIP3基因編碼大約88kDa的蛋白質(zhì)，由芽孢桿菌(Bacillus)在其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)階段期間生成并分泌。據(jù)報(bào)道，這些毒素不同于形成結(jié)晶的δ-內(nèi)毒素。這些文獻(xiàn)特別提及稱作VIP1A(a)，VIP1A(b)，VIP2A(a)，VIP2A(b)，VIP3A(a)，和VIP3A(b)的毒素。關(guān)于VIP蛋白的作用機(jī)制和截短的討論，還參見(jiàn)Leeetal.,AEMvol.69,no.8(August2003),4648–4657頁(yè)。VIP3A蛋白對(duì)廣譜的鱗翅目害蟲(chóng)(包括FAW，CEW，小地老虎(AgrotisipsilonHufnagel)(黑切根蟲(chóng)(blackcutworm)“BCW”)和煙芽夜蛾(HeliothisvirescensFabricius)(煙草夜蛾“TBW”))有殺蟲(chóng)活性。新近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VIP蛋白質(zhì)對(duì)半翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的某些物種有毒性(Nanasaheb,P.etal,Toxins(Basel)vol.4,no.6(2012年6月),第405-429頁(yè),SattarS.andMaitiM.K.,J.Microbiol.Biotechnol.2011,21:937–946)。因此，VIP類(lèi)蛋白質(zhì)展現(xiàn)出獨(dú)特的殺蟲(chóng)活性譜。其它公開(kāi)，WO98/18932，WO98/33991，WO98/00546和WO99/57282，現(xiàn)在也鑒定了VIP3蛋白質(zhì)類(lèi)別的同源物。為了控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)而持續(xù)使用化學(xué)和生物劑可增加昆蟲(chóng)形成對(duì)此類(lèi)控制措施的抗性的幾率。還有，生物控制劑的高選擇性通常導(dǎo)致每種藥劑僅控制幾種特定的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。盡管ECB抗性轉(zhuǎn)基因玉米取得了成功，抗性昆蟲(chóng)群體形成的可能性威脅到Cry蛋白在ECB控制中的長(zhǎng)期可持續(xù)性，并且因此需要發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)新的Cry或其它類(lèi)型的生物控制劑來(lái)控制ECB和其它害蟲(chóng)。昆蟲(chóng)對(duì)BtCry蛋白的抗性可以通過(guò)幾種機(jī)制形成(Heckel等人，2007，Pigott和Ellar，2007)。已經(jīng)在昆蟲(chóng)內(nèi)鑒定了Cry蛋白的多種受體蛋白類(lèi)別，并且在每種受體類(lèi)別內(nèi)存在多個(gè)實(shí)例。對(duì)特定Cry蛋白的抗性可以，例如，通過(guò)受體蛋白的鈣粘蛋白域的毒素結(jié)合部分內(nèi)的突變而形成。另一種抗性手段可以由加工前毒素的蛋白酶介導(dǎo)。因此，鱗翅目物種中對(duì)Cry毒素的抗性具有復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)，具有至少四種不同的主要抗性基因。DBM(菱紋背蛾)(Tabashnik，1994)，粉紋夜蛾(TrichoplusianiHübner)(卷心菜尺蠖“CL”；Janmaat和Myers2003，2005)和CEW(Tabashniketal.,2008)等物種的鱗翅目昆蟲(chóng)已經(jīng)在田間形成對(duì)Cry蛋白的抗性。因此，開(kāi)發(fā)和部署高效力植物摻入的新型殺蟲(chóng)蛋白(諸如本文公開(kāi)的那些)是有用且必需的。因此，仍然需要發(fā)現(xiàn)對(duì)農(nóng)民提供經(jīng)濟(jì)利益、且環(huán)境上可接受的新型有效害蟲(chóng)控制劑。特別需要針對(duì)廣譜的經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，能有效地控制對(duì)現(xiàn)有昆蟲(chóng)控制劑有抗性或者可能產(chǎn)生抗性的昆蟲(chóng)群體，并且與目前的控制劑相比具有相等或更高的效力的控制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了殺蟲(chóng)VIP毒素，包括本文中稱為DIG-657的蛋白毒素以及DIG-657的變體，編碼這些毒素的核酸，使用毒素控制害蟲(chóng)的方法，在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中生成毒素的方法和表達(dá)毒素的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供了包含編碼選自下組的殺蟲(chóng)蛋白的核酸序列的核酸構(gòu)建體：DIG-657，DIG-657變體和DIG-657片段。公開(kāi)了選自下組的分離的殺蟲(chóng)蛋白：DIG-657，DIG-657變體，DIG-657片段和包含SEQIDNO:2的殘基206至803的殺蟲(chóng)蛋白。還公開(kāi)了包含編碼選自下組的蛋白質(zhì)的核酸序列的植物，植物部分和種子：DIG-657，DIG-657變體和DIG-657片段。還公開(kāi)了用于控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)群體的方法，包括使所述害蟲(chóng)群體中的個(gè)體與殺蟲(chóng)有效量的包含SEQIDNO:2的殘基206至803的多肽接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的DIG-657昆蟲(chóng)毒素多肽，其包含選自下組的核心毒素區(qū)段：(a)包含SEQIDNO:2的殘基206至803的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQIDNO:2的殘基206至803的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:2的殘基206至803的氨基酸序列，但具有多至20個(gè)對(duì)由SEQIDNO:2編碼的毒素的表達(dá)或活性沒(méi)有不利影響的氨基酸取代，缺失或修飾的多肽；或其殺蟲(chóng)活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的DIG-657昆蟲(chóng)毒素多肽，其包含選自下組的DIG-657核心毒素區(qū)段：(a)包含SEQIDNO:2的殘基1至803的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQIDNO:2的殘基1至803的氨基酸序列具有至少95％或96％或97％或98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:2的殘基1至803的氨基酸序列，但具有多至20個(gè)對(duì)由SEQIDNO:1編碼的毒素的表達(dá)或活性沒(méi)有不利影響的氨基酸取代，缺失或修飾的多肽；或其殺蟲(chóng)活性片段；(d)包含與SEQIDNO:2的殘基206至803的氨基酸序列具有至少93％或94％或95％或96％或97％或98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，對(duì)表達(dá)或毒素活性沒(méi)有不利影響。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含DIG-657昆蟲(chóng)毒素的能育植物。本發(fā)明還提供了生成昆蟲(chóng)抗性或昆蟲(chóng)耐受性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將本發(fā)明的核酸分子導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物中，其中核酸分子在轉(zhuǎn)基因植物中能夠以有效量表達(dá)以控制昆蟲(chóng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了控制害蟲(chóng)群體的方法，包括使所述群體與殺蟲(chóng)有效量的DIG-657昆蟲(chóng)毒素接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的DIG-657毒素的分離的核酸分子。鑒于DIG-657毒素的氨基酸序列，可以通過(guò)使用意圖宿主植物優(yōu)選的密碼子逆翻譯氨基酸序列，然后使用備選密碼子精修序列以除去可能造成引起問(wèn)題的序列，并且提供周期性終止密碼子以消除非編碼閱讀框中的長(zhǎng)可讀框序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了DNA構(gòu)建體，其包含與啟動(dòng)子可操作連接的編碼DIG-657昆蟲(chóng)毒素的核苷酸序列，所述啟動(dòng)子不源自Bt，并且能夠在植物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)。本發(fā)明還提供了包含穩(wěn)定整合入其基因組中的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物和保護(hù)植物免受害蟲(chóng)為害的方法，包括將所述構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生成昆蟲(chóng)抗性或昆蟲(chóng)耐受性植物的方法，包括用非轉(zhuǎn)基因植物與轉(zhuǎn)基因植物育種，所述轉(zhuǎn)基因植物包含穩(wěn)定整合到該植物的基因組中的能夠表達(dá)DIG-657毒素的外來(lái)DNA構(gòu)建體，并且通過(guò)分析來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的所述外來(lái)DNA構(gòu)建體的至少一部分來(lái)選擇后代。附圖簡(jiǎn)述圖1是純化的DIG-657的SDS-PAGE的圖像。第1道，分子量標(biāo)志物；第2道，3μg純化的全長(zhǎng)DIG-657；第3道，用胰蛋白酶(1:10DIG-657wt/胰蛋白酶wt)處理純化的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)1小時(shí)后DIG-657的反應(yīng)產(chǎn)物。序列描述SEQIDNO:1編碼全長(zhǎng)DIG-657昆蟲(chóng)毒素的DNA序列。SEQIDNO:2推導(dǎo)的DIG-657蛋白質(zhì)序列。SEQIDNO:3編碼DIG-657變體1的玉米優(yōu)化的DNA序列。SEQIDNO:4具有針對(duì)在熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)中表達(dá)優(yōu)化的密碼子的DIG-657變體2。SEQIDNO:5DIG-657v4，玉米優(yōu)化的高GC含量。SEQIDNO:6DIG-657v5玉米優(yōu)化的高GC含量，從DIG-657的N端截短205AA。SEQIDNO:7SEQIDNO:6的推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列。SEQIDNO:8全長(zhǎng)DIG-657大豆最優(yōu)選的密碼子優(yōu)化形式。SEQIDNO:9截短的DIG-657的大豆最優(yōu)選的密碼子優(yōu)化形式。SEQIDNO:10編碼與全長(zhǎng)DIG-657的大豆最優(yōu)選密碼子優(yōu)化形式融合的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽4(Trap4)的DNA。SEQIDNO:11TraP4DIG-657全長(zhǎng)大豆最優(yōu)選密碼子的推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列。SEQIDNO:12與截短的DIG-657的大豆最優(yōu)選的密碼子優(yōu)化形式融合的Trap4。SEQIDNO:13Trap4DIG-657截短形式的推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了對(duì)多種昆蟲(chóng)目、優(yōu)選鱗翅目昆蟲(chóng)具有功能活性和效果的殺蟲(chóng)蛋白毒素，以及用于遞送毒素的方法?！肮δ芑钚浴?或“對(duì)…有活性”)的意思是：蛋白質(zhì)發(fā)揮口服活性毒素或昆蟲(chóng)控制劑的功能，蛋白質(zhì)具有毒性作用，或能夠破壞或阻止昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)或進(jìn)食。當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)、配制的蛋白質(zhì)組合物、可噴霧的蛋白質(zhì)組合物、誘餌基質(zhì)、或其它遞送系統(tǒng)遞送的有效量的本主題發(fā)明毒素與昆蟲(chóng)接觸時(shí)，通常導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡，昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)或增殖被抑制，或昆蟲(chóng)被阻止以給昆蟲(chóng)提供該毒素的來(lái)源(優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物)為食。本發(fā)明的各種功能性蛋白質(zhì)也可以一起或單獨(dú)起作用以增強(qiáng)或改善一種或多種其它毒素蛋白的活性。術(shù)語(yǔ)“毒性的”，“毒性”或“毒素”意在表示主題毒素具有如本文中定義的功能活性。對(duì)于進(jìn)食昆蟲(chóng)的完全致死性是優(yōu)選的，但不是實(shí)現(xiàn)功能活性所必需的。如果昆蟲(chóng)回避毒素或停止進(jìn)食，那么回避在某些應(yīng)用中將是有用的，即使效應(yīng)是亞致死的，或致死是延遲的或間接的。例如，如果期望昆蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)基因植物，則昆蟲(chóng)不愿對(duì)植物為食與對(duì)昆蟲(chóng)的致死毒性同樣有用，因?yàn)樽罱K目標(biāo)是避免昆蟲(chóng)誘導(dǎo)的植物損害。在Bt菌株P(guān)S46L中發(fā)現(xiàn)并分離了編碼DIG-657的核酸。申請(qǐng)人用“分離的”，來(lái)意指核酸分子已經(jīng)從其天然環(huán)境中取出并且已經(jīng)被人工置于不同的環(huán)境中。由于遺傳密碼的冗余性，多種不同的DNA序列可以編碼本文中公開(kāi)的氨基酸序列。一旦知曉了氨基酸序列，創(chuàng)建這些編碼相同或基本相同毒素的備選DNA序列完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。測(cè)定了DIG-657的全長(zhǎng)編碼區(qū)的核酸序列(SEQIDNO:1)，并且從核酸序列推導(dǎo)出了DIG-657的全長(zhǎng)蛋白序列(SEQIDNO:2)。針對(duì)GenomeQuest數(shù)據(jù)庫(kù)“GQ-PatPlatinumprotein”和“GQ-PatGoldPlusprotein”以及GenBank非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢DIG-657蛋白質(zhì)序列。最接近的已知同源物是XMI335(94％同一性，WO2013134523-002)和Vip3Ba(74％同一性，登錄號(hào)AAV70653，Rang等人)。在本文中也描述了DIG-657毒素的昆蟲(chóng)活性變體，并且統(tǒng)稱為DIG-657昆蟲(chóng)毒素或變體，并且包括片段和截短形式?？梢酝ㄟ^(guò)特定DIG-命名法來(lái)標(biāo)識(shí)DIG-657的單個(gè)變體。DIG-657毒素是用于控制鱗翅目害蟲(chóng)的理想候選者。DIG-657及其變體毒素的一個(gè)令人驚奇的性質(zhì)是，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)于抗Cry1F和Cry1A毒素的ECB和DBM群體具有活性。因而，DIG-657毒素是控制和預(yù)防抗性鱗翅目害蟲(chóng)群體的理想候選者。本發(fā)明的DIG-657毒素對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)，優(yōu)選對(duì)DBM，ECB，F(xiàn)AW，CEW，CBW和TBW有活性。預(yù)期對(duì)于CBW、CL、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)(甜菜粘蟲(chóng)(beetarmyworm)“BAW”)，棉紅鈴蟲(chóng)(Pectinophoragossypiella)(粉紅棉鈴蟲(chóng)(pinkbollworm))，CochyleshospesWalsingham(帶狀向日葵蛾(bandedsunflowermoth))和Homoeosomaelectellum(向日葵頭蛾(sunflowerheadmoth))也有殺蟲(chóng)活性。證明在熒光假單胞菌中生成的DIG-657的殺蟲(chóng)活性對(duì)鱗翅目物種有活性，所述鱗翅目物種包括ECB、cry1F抗性ECB(rECB)、DBM、cry1A抗性DBM(rDBM)、CEW、BCW和TBW。還測(cè)試了DIG-657蛋白對(duì)CBW、FAW和Cry1F抗性FAW(rFAW)的活性。此類(lèi)針對(duì)玉米和大豆二者的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的生物活性譜是非常有利的。在生物測(cè)定中測(cè)試了胰蛋白酶截短的毒素(SEQIDNO:7)對(duì)ECB的作用，顯示其與全長(zhǎng)DIG-657的活性近似相等，表明該蛋白質(zhì)N末端的前205個(gè)氨基酸不是生物活性所需要的。全長(zhǎng)DIG-657具有完整的N-末端，當(dāng)用胰蛋白酶(1:10胰蛋白酶/DIG-657)處理時(shí)，蛋白質(zhì)被切割成兩條帶，一條為約65kDa，另一條為約18kDa(圖1)。此外，還有一條小的殘余全長(zhǎng)DIG-657。對(duì)DIG-657的65kDa切割產(chǎn)物的N-端氨基酸分析表明胰蛋白酶切割的位點(diǎn)是(205K/S206)。編碼DIG-657、其變體、截短和片段的核苷酸序列可以通過(guò)常規(guī)手段合成并克隆到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體中，或者可以通過(guò)對(duì)含有該核苷酸序列的其它構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)操作獲得?？梢澡b定DIG-657編碼區(qū)內(nèi)部的獨(dú)特限制性位點(diǎn)，然后可以合成包含DIG-657編碼區(qū)的這些限制性位點(diǎn)之間的序列的DNA片段，每種這樣的片段編碼一種特定的缺失、插入或其它DIG-657變異?？梢詫⑦@些編碼修飾的DIG-657片段的DNA片段在適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)與其它DIG-657編碼區(qū)片段或其它Cry或VIP編碼區(qū)片段連接，以獲得編碼期望的全長(zhǎng)DIG-657蛋白、缺失或變體DIG-657蛋白的編碼區(qū)。例如，可以在第一種DIG-657編碼區(qū)的起始處鑒定適當(dāng)?shù)南拗菩宰R(shí)別位點(diǎn)，并在該DIG-657編碼區(qū)內(nèi)部鑒定第二限制性位點(diǎn)。在這些限制性位點(diǎn)切割此第一DIG-657編碼區(qū)將產(chǎn)生包含第一DIG-657編碼區(qū)的一部分的DNA片段?？梢允褂玫诙€(gè)DNA片段，其側(cè)翼有另一種DIG-657編碼區(qū)或其它VIP3編碼區(qū)所特有的、類(lèi)似定位的相容的限制性位點(diǎn)，與第一DNA限制性片段組合，來(lái)構(gòu)建變體?？苟舅乜贵w.可以使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程制備針對(duì)本文中公開(kāi)的毒素或這些毒素的片段的抗體。此類(lèi)抗體可用于檢測(cè)植物組織中DIG-657毒素和多種其它物質(zhì)的存在。此類(lèi)抗體和抗血清可用于各種檢測(cè)本發(fā)明所請(qǐng)求保護(hù)的DIG-657毒素及其變體或片段的方法。眾所周知，用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的抗體可以用于鑒定多種環(huán)境中抗原的存在。用放射性同位素標(biāo)記的抗體已經(jīng)用于放射性免疫測(cè)定中，以較大的精確性和靈敏性鑒定多種生物流體中抗原的存在。新近，酶標(biāo)記的抗體已經(jīng)在ELISA測(cè)定法中用作放射性標(biāo)記抗體的替代物。此外，對(duì)本發(fā)明的Bt殺蟲(chóng)毒素有免疫反應(yīng)性的抗體可以與固定化物質(zhì)如聚苯乙烯孔或顆粒結(jié)合，并且用于免疫測(cè)定法中以測(cè)定Bt毒素是否存在于測(cè)試樣品中。抗DIG-657抗體也可用于從重組生產(chǎn)系統(tǒng)或天然來(lái)源分離大量的DIG-657毒素。DIG-657的轉(zhuǎn)基因表達(dá).可以以多種方式“應(yīng)用”或提供主題蛋白質(zhì)毒素以接觸靶標(biāo)昆蟲(chóng)。例如，DIG-657毒素可以用作轉(zhuǎn)基因植物中的植物整合的保護(hù)劑(由植物生成和存在于植物中)，并且是本領(lǐng)域中公知的。毒素基因的表達(dá)還可以實(shí)現(xiàn)植物的特定組織(例如根，葉等)的選擇性。這可以通過(guò)使用本領(lǐng)域中公知的組織特異性啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是用編碼主題殺蟲(chóng)蛋白或其變體的基因轉(zhuǎn)化植物。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物由于在轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞中存在控制量的主題殺蟲(chóng)蛋白或其變體而對(duì)昆蟲(chóng)靶標(biāo)害蟲(chóng)的攻擊有抗性。通過(guò)將編碼DIG-657毒素的遺傳物質(zhì)摻入并表達(dá)到由特定昆蟲(chóng)害蟲(chóng)食用的植物的基因組中，成蟲(chóng)或幼蟲(chóng)在食用該食物植物后將死亡。已經(jīng)轉(zhuǎn)化了許多屬于單子葉和雙子葉分類(lèi)的成員。轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)作物以及水果和蔬菜具有商業(yè)意義。此類(lèi)作物包括但不限于玉米，稻，大豆，蕓苔，向日葵，苜蓿，高粱，小麥，棉，花生，番茄，馬鈴薯等。有許多公知的技術(shù)可用于將外來(lái)遺傳物質(zhì)導(dǎo)入單子葉或雙子葉植物細(xì)胞中，以及用于獲得穩(wěn)定保持和表達(dá)導(dǎo)入的基因的能育植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，DIG-657或變體經(jīng)由包含表達(dá)本發(fā)明的毒素的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)口遞送。本發(fā)明提供了生成昆蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將本發(fā)明的核酸分子導(dǎo)入植物中，其中所述毒素在轉(zhuǎn)基因植物中能夠以有效控制昆蟲(chóng)的量表達(dá)。在非限制性例子中，基本克隆策略可以是將全長(zhǎng)或修飾的DIG-657編碼序列亞克隆到植物表達(dá)質(zhì)粒中的NcoI和SacI限制性位點(diǎn)處。所得的植物表達(dá)盒含有在植物表達(dá)元件(例如植物可表達(dá)啟動(dòng)子，3'末端轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸添加決定簇等)控制下的合適的DIG-657編碼區(qū)，利用例如技術(shù)或標(biāo)準(zhǔn)限制性酶片段克隆程序?qū)⑵鋪喛寺〉蕉d體質(zhì)粒中。如果利用技術(shù)，那么可以例如使用LRClonaseTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)將全長(zhǎng)和經(jīng)修飾的基因植物表達(dá)盒重組到二元植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中。當(dāng)質(zhì)粒存在于大腸桿菌和土壤桿菌細(xì)胞中時(shí)，采用含有賦予對(duì)抗生素壯觀霉素的抗性的細(xì)菌基因的二元植物轉(zhuǎn)化載體是方便的。采用含有在期望的宿主植物中有功能的植物可表達(dá)選擇標(biāo)志物基因的二元載體質(zhì)粒也是方便的。植物可表達(dá)的選擇標(biāo)志物基因的例子包括但不限于編碼轉(zhuǎn)座子Tn5的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(aphII)(其賦予對(duì)抗生素卡那霉素，新霉素和G418的抗性)的那些，以及那些編碼對(duì)草甘膦(glyphosate)；潮霉素；甲氨蝶呤；膦絲菌素(雙丙氨膦(bialaphos))，咪唑啉酮，磺酰脲和三唑并嘧啶除草劑，如氯磺隆(chlorosulfuron)，溴苯腈(bromoxynil)，達(dá)拉泮(dalapon)等?；蛘?，通過(guò)土壤桿菌操作領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，對(duì)由候選土壤桿菌分離株制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性消化物指紋定位，進(jìn)行含有DIG-657基因插入物的二元植物轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。經(jīng)由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)化的植物領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，還可以使用Z707S以外的其它土壤桿菌菌株，并且菌株的選擇可以取決于待轉(zhuǎn)化的宿主植物物種的身份。轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis)的昆蟲(chóng)生物測(cè)定法.可以使用表達(dá)經(jīng)修飾的DIG-657蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系在人工食料重疊測(cè)定法中證明針對(duì)敏感昆蟲(chóng)物種的活性。從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因擬南芥品系提取的蛋白質(zhì)可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)量化，并調(diào)整樣品體積以使蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。然后如下所述對(duì)人工食料進(jìn)行生物測(cè)定法。測(cè)定法中應(yīng)包括非轉(zhuǎn)基因擬南芥和/或緩沖液和水作為背景檢查處理。轉(zhuǎn)基因玉米的生物測(cè)定法.植物細(xì)胞中生成的DIG-657毒素和變體的生物活性亦可通過(guò)常規(guī)生物測(cè)定方法證明(參見(jiàn)例如Huang等人，2006)?？梢酝ㄟ^(guò)在受控飼養(yǎng)環(huán)境中將源自生成DIG-657毒素的植物的各種植物組織或組織塊喂給靶標(biāo)昆蟲(chóng)來(lái)測(cè)試功效。或者，可以從源自生成DIG-657毒素的植物的各種植物組織制備蛋白質(zhì)提取物，并將提取的蛋白質(zhì)摻入人工食料生物測(cè)定法中。應(yīng)當(dāng)理解，此類(lèi)喂養(yǎng)測(cè)定法的結(jié)果要與類(lèi)似進(jìn)行的生物測(cè)定法進(jìn)行比較，所述類(lèi)似進(jìn)行的生物測(cè)定法采用來(lái)自不生成DIG-657蛋白或變體的宿主植物的合適對(duì)照組織或其它對(duì)照樣品。DIG-657毒素和殺蟲(chóng)活性變體.除了SEQIDNO:2的全長(zhǎng)DIG-657毒素外，本發(fā)明涵蓋SEQIDNO:2，SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的殺蟲(chóng)活性變體。通過(guò)術(shù)語(yǔ)“變體”，申請(qǐng)人意欲包括某些缺失，取代和插入突變體。DIG-657片段是在SEQIDNO:2中發(fā)現(xiàn)的任何小于全長(zhǎng)DIG-657氨基酸序列且具有殺蟲(chóng)性質(zhì)的蛋白質(zhì)序列。DIG-657變體片段也作為本發(fā)明的一部分涵蓋在內(nèi)，并且定義為DIG-657的含有本文中所述的某些缺失、取代和插入突變體并且具有殺蟲(chóng)活性的片段。在描述包括在本發(fā)明中包括的DIG-657毒素的變體之前，簡(jiǎn)要回顧DIG-657蛋白毒素的構(gòu)造是有用的。通過(guò)進(jìn)行有限數(shù)目的氨基酸缺失、代或添加創(chuàng)建的DIG-657變體.SEQIDNO:2的氨基酸序列的氨基酸缺失、取代和添加可以以順序的方式容易地進(jìn)行，并且可以通過(guò)生物測(cè)定法測(cè)試此類(lèi)變化對(duì)殺蟲(chóng)活性的影響。只要改變的數(shù)目是數(shù)目有限的，此類(lèi)測(cè)試不會(huì)涉及過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明還包括核心毒素區(qū)段的殺蟲(chóng)活性變體(SEQIDNO:2的氨基酸206-803，或其中已經(jīng)進(jìn)行多達(dá)10個(gè)，多達(dá)15個(gè)或多達(dá)20個(gè)獨(dú)立的氨基酸添加，缺失或取代)?？梢酝ㄟ^(guò)進(jìn)行隨機(jī)突變制備變體，或者可以設(shè)計(jì)變體。在設(shè)計(jì)的突變體的情況下，當(dāng)在毒素的關(guān)鍵區(qū)域(負(fù)責(zé)生物活性、或參與決定三維構(gòu)造并且最終負(fù)責(zé)生物活性)中維持氨基酸同一性時(shí)，有高概率生成與天然毒素具有相似活性的變體。如果取代是保守的，保留活性的概率也高。氨基酸可以置于以下類(lèi)別中：非極性，不帶電荷的極性，堿性和酸性。其中一個(gè)類(lèi)別的氨基酸被另一個(gè)相同類(lèi)型的氨基酸替換的保守取代最不可能實(shí)質(zhì)上改變?cè)撟凅w的生物活性。表1提供屬于每個(gè)類(lèi)別的氨基酸的例子的列表。表1本發(fā)明的殺害蟲(chóng)(pesticide)蛋白由與SEQIDNO:1的核苷酸序列充分相同的核苷酸序列編碼，或者所述殺蟲(chóng)蛋白與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列充分相同?！白銐蛳嗤笔侵甘褂帽疚闹兴龅膶?duì)比程序之一使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)與參照序列進(jìn)行比較時(shí)，具有至少約60％或65％序列同一性，約70％或75％序列同一性，約80％或85％序列同一性，約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更大的序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性，氨基酸相似性，閱讀框定位等適當(dāng)?shù)卣{(diào)整這些值以確定由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的同一性百分比，為了最佳比較目的將各序列比對(duì)。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是序列共有的相同位置的數(shù)目(即同一性百分比＝相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)(例如，重疊位置)x100)的函數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列長(zhǎng)度相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算整個(gè)參照序列的同一性百分比。可以使用類(lèi)似于下文描述的技術(shù)在允許或不允許空位的情況下確定兩個(gè)序列之間的百分比同一性。在計(jì)算同一性百分比時(shí)，通常會(huì)計(jì)算精確匹配?？瘴?比對(duì)中在一個(gè)序列中存在殘基但在另一個(gè)序列中不存在殘基的位置)被認(rèn)為是具有不相同殘基的位置。兩個(gè)序列之間的同一性百分比的測(cè)定可以使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA87:2264，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873-5877中修改的。此類(lèi)算法整合在Altschul等人(1990)J.Mol.Bioi.215:403的BLASTN和BLASTX程序中?？梢杂肂LASTN程序，得分＝100，字長(zhǎng)＝12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，來(lái)獲得與本發(fā)明的殺蟲(chóng)樣核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，得分＝50，字長(zhǎng)＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，來(lái)獲得與本發(fā)明的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得帶空位的比對(duì)用于比較目的，可以利用GappedBLAST(在BLAST2.0中)，如Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25:3389中描述的?；蛘撸梢允褂肞SIBlast進(jìn)行迭代搜索，檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)距離關(guān)系。參見(jiàn)Altschul等人(1997)同上。當(dāng)利用BLAST，GappedBLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。也可以通過(guò)檢視人工比對(duì)。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性例子是ClustalW算法(Higgins等人(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW比較序列并比對(duì)氨基酸或DNA序列整體，因此可以提供關(guān)于氨基酸序列整體的序列保守性的數(shù)據(jù)。在幾種商品化的DNA/氨基酸分析軟件包，如VectorNTI程序套件(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)的ALIGNX模塊中使用ClustalW算法。在用ClustalW比對(duì)氨基酸序列后，可以評(píng)估氨基酸同一性百分比?？捎糜诜治鯟lustalW比對(duì)的軟件程序的一個(gè)非限制性例子是GENEDOCTM。GENEDOCTM(KarlNicholas)允許評(píng)估多個(gè)蛋白質(zhì)之間的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS4(1):11-17的算法。將此類(lèi)算法被納入ALIGN程序(版本2.0)中，該程序是GCGWisconsinGenetics軟件包第10版(可從Accelrys，Inc.，SanDiego，CA，USA獲得)的一部分。當(dāng)利用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表，空位長(zhǎng)度罰分12和空位罰分4。除非另有說(shuō)明，序列同一性或相似性會(huì)使用GAP第10版(其使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453的算法)來(lái)確定，使用以下參數(shù)：核苷酸序列的％同一性和％相似性(使用GAP權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣)；氨基酸序列的％同一性或％相似性(使用GAP權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2，以及BLOSUM62評(píng)分程序)。也可以使用等同程序?！暗韧绦颉币庵溉魏芜@樣的序列比較程序，對(duì)于任何兩個(gè)討論的序列，與由GAP第10版產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)相比，該程序產(chǎn)生具有相同核苷酸殘基匹配和相同百分比序列同一性的比對(duì)。蛋白酶敏感性變體.可以將VIP3蛋白(包括DIG-657)從大小約88kDa蛋白水解截短成大小約66kDa的產(chǎn)物。66kDa蛋白包含氨基酸殘基206-803。昆蟲(chóng)腸蛋白酶通常發(fā)揮功能幫助昆蟲(chóng)從食料蛋白質(zhì)獲得需要的氨基酸。了解最充分的昆蟲(chóng)消化蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，其似乎是最常見(jiàn)的類(lèi)型(Englemann和Geraerts(1980)，特別是在鱗翅目昆蟲(chóng)中。鞘翅目昆蟲(chóng)的腸比鱗翅目的腸更為中性至酸性。大多數(shù)鞘翅目幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)，例如科羅拉多馬鈴薯甲蟲(chóng)(Coloradopotatobeetle,CPB)，具有微酸性中腸，并且半胱氨酸蛋白酶提供大部分蛋白水解活性(Wolfson和Murdock，1990)。更精確地，Thie和Houseman(1990)鑒定和鑒定了CPB中的半胱氨酸蛋白酶，組織蛋白酶B樣和組織蛋白酶H樣，以及天冬氨酰蛋白酶，組織蛋白酶D樣。Gillikin等人(1992)表征了WCR幼蟲(chóng)腸中的蛋白水解活性，并且主要發(fā)現(xiàn)是半胱氨酸蛋白酶。美國(guó)專(zhuān)利No.7,230,167公開(kāi)了歸因于組織蛋白酶G的蛋白酶活性存在于WCR中。昆蟲(chóng)腸蛋白酶的多樣性和不同的活性水平可能影響昆蟲(chóng)對(duì)特定Bt毒素的敏感性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在期望的位置處工程化改造蛋白酶切割位點(diǎn)，以影響某些昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的易感幼蟲(chóng)的中腸內(nèi)的蛋白質(zhì)加工?？梢酝ㄟ^(guò)諸如化學(xué)基因合成或剪接重疊PCR(Horton等人，1989)的方法引入這些蛋白酶切割位點(diǎn)。例如，絲氨酸蛋白酶識(shí)別序列可以任選地插入Cry蛋白結(jié)構(gòu)中的特定位點(diǎn)以影響在易感幼蟲(chóng)的中腸內(nèi)的期望的缺失點(diǎn)處的蛋白質(zhì)加工?？梢砸源祟?lèi)方式利用的絲氨酸蛋白酶包括鱗翅目中腸絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶，胰凝乳蛋白酶，彈性蛋白酶等(Christeller等，1992)。此外，可以工程改造憑經(jīng)驗(yàn)鑒定的缺失位點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)激活，經(jīng)驗(yàn)鑒定是通過(guò)對(duì)用未分級(jí)的幼蟲(chóng)中腸蛋白酶制劑產(chǎn)生的Cry蛋白消化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，或者通過(guò)結(jié)合至刷狀緣膜囊。通過(guò)基因缺失或通過(guò)引入蛋白酶切割位點(diǎn)產(chǎn)生的經(jīng)修飾的Cry或VIP3蛋白對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)，包括ECB，CEW，CBW，BCW，F(xiàn)AW，BAW，巨座玉米螟(Diatraeagrandiosella)，小蔗螟(Diatraeasaccharalis)，豆白隆切根蟲(chóng)(Loxagrotisalbicosta)和其它目標(biāo)害蟲(chóng)具有改善的活性。通過(guò)在期望的加工位點(diǎn)處構(gòu)建合適的識(shí)別序列，可以進(jìn)一步利用鱗翅目和鞘翅目絲氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G樣蛋白酶，鱗翅目和鞘翅目半胱氨酸蛋白酶如組織蛋白酶(B樣，L樣，O樣和K樣蛋白酶)(Koiwa等(2000)和Bown等人(2004))，鱗翅目和鞘翅目金屬蛋白酶如ADAM10(Ochoa-Campuzano等人，(2007))和鱗翅目和鞘翅目天冬氨酸蛋白酶如組織蛋白酶D樣和E樣，胃蛋白酶，胞質(zhì)蛋白酶和凝乳酶，以影響某些昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的易感幼蟲(chóng)的中腸內(nèi)的Cry蛋白加工，并且還可能提供對(duì)非易感性昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的活性。為了允許或消除昆蟲(chóng)、植物或微生物蛋白酶對(duì)較大變體蛋白的蛋白水解切割而在編碼序列中的適當(dāng)位置引入或消除蛋白酶加工位點(diǎn)，由此產(chǎn)生的DIG-657變體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類(lèi)操作的最終結(jié)果理解為具有與完整(全長(zhǎng))毒素蛋白相同或更好活性的毒素片段分子的產(chǎn)生。噴撒施用是另一個(gè)實(shí)例，并且在本領(lǐng)域中也是已知的。主題蛋白質(zhì)可以適當(dāng)?shù)嘏渲朴糜谄谕淖罱K用途，然后噴撒(或以其它方式施用)到植物上和/或植物周?chē)?或待保護(hù)的植物附近——在發(fā)現(xiàn)侵襲前，在發(fā)現(xiàn)靶昆蟲(chóng)后，在之前和之后兩者，等等。例如，也可以使用誘餌顆粒，并且是本領(lǐng)域中已知的。當(dāng)昆蟲(chóng)與有效量的通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)、配制的蛋白質(zhì)組合物、可噴霧蛋白質(zhì)組合物，誘餌基質(zhì)、或其它遞送系統(tǒng)遞送的毒素接觸時(shí)，結(jié)果通常是昆蟲(chóng)的死亡，或昆蟲(chóng)不以向昆蟲(chóng)提供毒素的來(lái)源為食。使用合適的微生物宿主，例如，假單胞菌屬時(shí)，可以將微生物使用于害蟲(chóng)的環(huán)境，在那里它們將增殖并被攝取。結(jié)果導(dǎo)致對(duì)害蟲(chóng)的控制。或者，可以在延長(zhǎng)毒素活性并穩(wěn)定細(xì)胞的條件下處理含有毒素基因的微生物。然后可以將保持毒性活性的處理過(guò)的細(xì)胞施用于靶害蟲(chóng)的環(huán)境。寡核苷酸探針的開(kāi)發(fā).另一種用于鑒定本發(fā)明的毒素和基因的方法是通過(guò)使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測(cè)的核苷酸序列。這些序列可以憑借適當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記物而被檢測(cè)到，或者可以如例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,268,132中所述使其具有內(nèi)在熒光。如本領(lǐng)域中眾所周知的，如果探針?lè)肿雍秃怂針悠吠ㄟ^(guò)在兩個(gè)分子之間形成強(qiáng)堿基配對(duì)鍵而雜交，則可以合理地推定探針和樣品具有實(shí)質(zhì)的序列同源性。優(yōu)選地，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，如例如在Keller和Manak(1993)中所述。探針的檢測(cè)提供了以已知方式測(cè)定是否發(fā)生雜交的方法。此類(lèi)探針?lè)治鎏峁┝髓b定本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明用作探針的核苷酸區(qū)段可以使用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程合成。這些核苷酸序列也可以用作PCR引物來(lái)擴(kuò)增本發(fā)明的基因。核酸雜交.如分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，兩種核酸的相似性可以通過(guò)它們雜交的趨勢(shì)來(lái)表征。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指探針會(huì)以比與其它序列大得可檢測(cè)的程度(例如超過(guò)背景的至少2倍)與其靶序列雜交(退火)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同情況下將是不同的。通過(guò)控制雜交和/或清洗條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))?；蛘撸梢哉{(diào)整嚴(yán)格性條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，使得較低程度的相似性被檢測(cè)到(異源探測(cè))。通常，探針長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)格條件會(huì)是那些條件，其中在pH7.0至pH8.3下鹽濃度小于約1.5MNa離子，通常約0.01至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，并且溫度至少為為約30℃(對(duì)于短探針(例如10至50個(gè)核苷酸))和至少約60℃(對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸))。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格性條件包括在37℃在30％至35％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液的情況下雜交和在1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)在50℃至55℃清洗。示例性中度嚴(yán)格性條件包括在37℃在40％至45％甲酰胺，1.0MNaCl，1％SDS中雜交和在55℃至60℃在0.5X至1XSSC中清洗。示例性的高嚴(yán)格條件包括在37℃在50％甲酰胺，1MNaCl，1％DS中雜交和在60℃至65℃在0.1XSSC中清洗。任選地，清洗緩沖液可以包含約0.1％至約1％SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間通常小于約24小時(shí)，通常約4至12小時(shí)。特異性通常是雜交后清洗的功能，關(guān)鍵因素是最終清洗溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA/DNA雜交體，熱熔點(diǎn)(Tm)是50％的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)的溫度。對(duì)于每1％的錯(cuò)配，Tm降低約1℃；因此，可以調(diào)節(jié)Tm，雜交條件和/或清洗條件以促進(jìn)期望同一性的序列的退火。例如，如果尋找具有>90％同一性的序列，則Tm可以降低10℃。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比在限定的離子強(qiáng)度和pH下特定序列及其互補(bǔ)序列的Tm低約5℃。然而，高度嚴(yán)格條件可以在比Tm低1℃，2℃，3℃或4℃使用雜交和/或清洗；中等嚴(yán)格條件可以利用比Tm低6℃，7℃，8℃，9℃或10℃的雜交和/或清洗，并且低嚴(yán)格性條件可以利用比Tm低11℃，12℃，13℃，14℃，15℃或20℃的雜交和/或清洗。Tm(以℃計(jì))可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定或可以通過(guò)計(jì)算取近似值。對(duì)于DNA-DNA雜交體，可以從Meinkoth和Wahl(1984)的方程對(duì)Tm取近似值：Tm(℃)＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)500/L；其中M是一價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥(niǎo)苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是堿基對(duì)中雜交體的長(zhǎng)度?；蛘撸琓m由下式(Beltz等，1983)描述：Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-600/L，其中[Na+]是鈉離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥(niǎo)苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是堿基對(duì)中雜交體的長(zhǎng)度。使用等式，雜交和清洗組合物和期望的Tm，普通技術(shù)人員將理解，固有描述了雜交和/或清洗溶液的嚴(yán)格性的變化。如果期望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選提高SSC濃度，使得可以使用更高的溫度。關(guān)于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見(jiàn)P.Tijssen(1993,ISBN-10:0444898840,ISBN-13:9780444898845Hardcover)的HybridizationwithNucleicAcidProbesVol.1和Ausubel等人(1995)。也參見(jiàn)Sambrook等人(1989)。實(shí)施例實(shí)施例1編碼DIG-657殺蟲(chóng)毒素的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和在細(xì)菌宿主中的表達(dá)。在熒光假單胞菌(Pf)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，所述表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)工程化以生成由植物優(yōu)化的編碼區(qū)編碼的全長(zhǎng)DIG-657蛋白。限制性內(nèi)切核酸酶和T4DNA連接酶從NewEnglandBioLabs(NEB；Ipswich，MA)獲得，分別用于限制性消化和DNA連接。使用質(zhì)粒試劑盒(Macherey-NagelInc，Bethlehem，PA)根據(jù)用于低拷貝質(zhì)粒純化的供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒制備。在瓊脂糖Tris-乙酸凝膠電泳后，使用凝膠提取試劑盒(Qiagen，Venio，Limburg)純化DNA片段。使用含有用于克隆的特異性限制性位點(diǎn)的基因特異性引物，從親本Bt菌株P(guān)S46L/DBt11889中擴(kuò)增出編碼DIG-657的基因。然后使用常規(guī)的連接克隆方法將所得的DIG-657聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物克隆到熒光假單胞菌表達(dá)載體pDOW1169中?；究寺〔呗园▽IG-657毒素編碼序列(CDS)(SEQIDNO:1)亞克隆到pDOW1169中的SpeI和SalI限制性位點(diǎn)處，由此將其置于來(lái)自質(zhì)粒pKK223-3(PLPharmacia，Milwaukee，WI)的Ptac啟動(dòng)子和rrnBT1T2終止子的表達(dá)控制下。pDOW1169是一種中等拷貝質(zhì)粒，具有RSF1010復(fù)制起點(diǎn)、pyrF基因、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，后面是可以引入含有蛋白質(zhì)編碼區(qū)的DNA片段的限制酶識(shí)別位點(diǎn)(美國(guó)申請(qǐng)20080193974)。通過(guò)電穿孔將稱為pDOW1169的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DC454(具有突變deltapyrF和lsc::lacIQI的近野生型熒光假單胞菌菌株)或其衍生物中，在SOC-Soy水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中恢復(fù)，并在選擇培養(yǎng)基(缺少尿嘧啶的M9葡萄糖瓊脂，Sambrook等人，同上)上鋪板。微生物操作的細(xì)節(jié)可以在Squires等人，(2004)，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20060008877，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20080193974和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20080058262中獲得，其通過(guò)提及并入本文。首先通過(guò)小提質(zhì)粒DNA的限制性消化篩選菌落。用四種限制酶消化含有DIG-657毒素的所選克隆的質(zhì)粒DNA，并確認(rèn)序列以進(jìn)一步驗(yàn)證插入物的存在。實(shí)施例2在搖瓶中的生長(zhǎng)和表達(dá)分析.通過(guò)搖瓶培養(yǎng)的含有表達(dá)構(gòu)建體(pDOW1169)的熒光假單胞菌菌株來(lái)完成用于表征和昆蟲(chóng)生物測(cè)定法的DIG-657毒素的生成。將DIG-657培養(yǎng)物的甘油儲(chǔ)液(0.5mL)接種到具有9.5％甘油(Teknova目錄號(hào)3D7426，Hollister，CA)的50mL限定的生產(chǎn)培養(yǎng)基中。在30℃震蕩下初始溫育24小時(shí)后添加異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)Ptac啟動(dòng)子表達(dá)DIG-657毒素基因。在誘導(dǎo)時(shí)和誘導(dǎo)后各個(gè)時(shí)間取樣培養(yǎng)物。通過(guò)在600nm的光密度(OD600)測(cè)量細(xì)胞密度。也可以利用適合于熒光假單胞菌生長(zhǎng)的其它培養(yǎng)基，例如，如記載于Huang等人(2007)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20060008877。實(shí)施例3土壤桿菌轉(zhuǎn)化.在二元植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法。限制性核酸內(nèi)切酶和T4DNA連接酶獲自NEB。使用質(zhì)粒制備試劑盒或AXXtraMidi試劑盒(均來(lái)自Macherey-Nagel，Duren，Germany)，依照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒制備。凝膠分離后，使用PCR純化試劑盒或凝膠提取試劑盒(均來(lái)自QiagenVenio，Limburg)純化DNA片段。制備根癌土壤桿菌菌株Z707S(Z707的鏈霉素抗性衍生物；Hepburn等人，1985)的電感受態(tài)細(xì)胞，并使用電穿孔轉(zhuǎn)化(Weigel和Glazebrook，2002)。電穿孔后，向小杯添加1mL酵母提取物蛋白胨(YEP)肉湯(10gm/L酵母提取物，10gm/L蛋白胨和5gm/LNaCl)，并且將細(xì)胞-YEP懸浮液轉(zhuǎn)移至15mL培養(yǎng)管，在28℃在恒定攪拌的水浴中溫育4小時(shí)。將細(xì)胞在含有壯觀霉素(200μg/mL)和鏈霉素(250μg/mL)的YEP+瓊脂(25gm/L)上鋪板，并將板在28℃溫育2-4天。選擇分離良好的單菌落，并如上所述在具有壯觀霉素和鏈霉素的新鮮YEP+瓊脂板上劃線，并在28℃溫育1-3天。從選定的土壤桿菌菌落制備模板質(zhì)粒DNA，使用載體特異性引物進(jìn)行PCR分析，來(lái)分析二元植物轉(zhuǎn)化載體中DIG-657基因插入物的存在。取15mL含壯觀霉素和鏈霉素的YEP中培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)物的4mL等分試樣的細(xì)胞離心沉淀，使用Qiagen(Venlo，Limburg，Netherlands)MiniPreps根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行提取。包括來(lái)自用于土壤桿菌電穿孔轉(zhuǎn)化的二元載體的質(zhì)粒DNA作為對(duì)照。使用來(lái)自Invitrogen(Carlsbad，CA)的TaqDNA聚合酶根據(jù)制造商的說(shuō)明以0.5X濃度完成PCR反應(yīng)。在MJResearchPeltier熱循環(huán)儀中實(shí)施PCR反應(yīng)，其以下述條件編程：步驟1)94℃3分鐘；步驟2)94℃45秒；步驟3)55℃30秒；步驟4)72℃1分鐘(每kb預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度)；步驟5)29次至步驟2；步驟6)72℃10分鐘。循環(huán)后反應(yīng)維持于4℃。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(例如0.7％至1％瓊脂糖，w/v)分析擴(kuò)增產(chǎn)物并通過(guò)溴化乙錠顯現(xiàn)。選擇其PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒對(duì)照相同的菌落。實(shí)施例4DIG-657的生成.通過(guò)離心分離含有表達(dá)構(gòu)建體(pDOW1169)的搖瓶培養(yǎng)的熒光假單胞菌菌株的細(xì)胞，并將所得細(xì)胞離心沉淀在-80℃冷凍。使用EasyLyseTM細(xì)菌蛋白提取溶液(Biotechnologies,Madison,WI)產(chǎn)生來(lái)自冷凍搖瓶細(xì)胞離心沉淀樣品的可溶性和不溶性級(jí)分。將每個(gè)細(xì)胞離心沉淀懸浮于1mLEasyLyseTM溶液中，并在裂解緩沖液中進(jìn)一步以1:4稀釋?zhuān)⒃谑覝卣鹗幭聹赜?0分鐘。將裂解物在4℃以14,000rpm離心20分鐘，并且以可溶性級(jí)分回收上清液。然后將離心沉淀(不溶性級(jí)分)在等體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；11.9mMNa2HPO4,137mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.4)中懸浮。將樣品與含有β-巰基乙醇(Sambrook等人，同上)的2XLaemmli樣品緩沖液以1:1混合，并煮沸5分鐘，然后加載到CriterionBis-Tris12％凝膠(Bio-RadInc.,Hercules,CA)。在推薦的XTMOPS緩沖液中進(jìn)行電泳。根據(jù)制造商的方案用Bio-Safe考馬斯染色(Bio-Rad，Richmond，CA)將凝膠染色，并使用AlphaInnotech成像系統(tǒng)(SanLeandro，CA)成像。實(shí)施例5包含體制備.DIG-657通常位于含有DIG-657基因的熒光假單胞菌細(xì)胞的可溶性級(jí)分中。在一些情況下，如通過(guò)SDS-PAGE和MALDI-MS(基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜術(shù))所證明的，發(fā)現(xiàn)不同比例的DIG-657蛋白位于蛋白包含體(IB)制備物中。為了從此級(jí)分中分離此蛋白質(zhì)，將熒光假單胞菌發(fā)酵離心沉淀物在37℃水浴中融化。將細(xì)胞在裂解緩沖液(50mMTris，pH7.5，200mMNaCl，20mMEDTA二鈉鹽(乙二胺四乙酸)，1％TritonX-100和5mM二硫蘇糖醇(DTT))中重懸至25％w/v；在即將使用前添加5mL/L細(xì)菌蛋白酶抑制劑混合物(P8465Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。用設(shè)置到最低的手持式勻漿器(TissueTearor,BioSpecProducts,Inc.,Bartlesville,OK)懸浮細(xì)胞。將溶菌酶(25mg的Sigma，St.Louis，MO，來(lái)自雞蛋白的L7651)添加到細(xì)胞懸浮液，用金屬刮刀混合，將懸液在室溫溫育1小時(shí)。將懸液在冰上冷卻15分鐘，然后使用Branson(Danbury，CT)Sonifier250(兩個(gè)1分鐘時(shí)段，50％工作循環(huán)，30％輸出)進(jìn)行超聲處理。通過(guò)顯微術(shù)檢查細(xì)胞裂解。如果需要的話，再添加25mg溶菌酶，并重復(fù)溫育和超聲處理步驟。當(dāng)通過(guò)顯微術(shù)確認(rèn)細(xì)胞裂解時(shí)，將裂解物以11,500xg離心25分鐘(4℃)以形成IB離心沉淀，并棄去上清液。將IB沉淀用100mL裂解緩沖液重浮，用手持式混合器勻漿化并如上所述離心。通過(guò)重懸(在50mL裂解緩沖液中)，勻漿化，超聲處理和離心重復(fù)清洗IB離心沉淀，直到上清液變?yōu)闊o(wú)色，并且IB離心沉淀變得堅(jiān)固且顏色變?yōu)榛野?。?duì)于最終清洗，將IB離心沉淀重懸于含有2mMEDTA的無(wú)菌過(guò)濾(0.22μm)蒸餾水中，并離心。將最終離心沉淀重懸于含有2mMEDTA的無(wú)菌過(guò)濾的蒸餾水中，并以1mL等分試樣貯存于-80℃。如下所述對(duì)IB制備物中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析和量化：融化IB離心沉淀的1mL等分試樣，并用無(wú)菌過(guò)濾的蒸餾水以1:20稀釋。然后，將稀釋的樣品用4X還原樣品緩沖液[250mMTris，pH6.8，40％甘油(v/v)，0.4％溴酚藍(lán)(w/v)，8％SDS(w/v)和8％β-巰基乙醇(v/v)]煮沸并上樣到4-20％Tris-甘氨酸，12+2孔凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，用1XTris/甘氨酸/SDS緩沖液(BioRad,Richmond,CA)電泳。以200伏特凝膠電泳60分鐘，然后用考馬斯藍(lán)(在45％甲醇，10％乙酸中的50％G-250/50％R-250)染色，并用含7％乙酸，5％甲醇的蒸餾水脫色。用牛血清清蛋白(BSA)樣品在相同凝膠上電泳以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，將目標(biāo)條帶的密度計(jì)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)進(jìn)行目標(biāo)條帶的定量。實(shí)施例6包含體的溶解.在設(shè)置到最高的Eppendorf型5415C微量離心機(jī)(約14,000xg)上離心6mL包含體懸浮液(含有32mg/mLDIG-657蛋白質(zhì))以沉淀包含體。除去貯存緩沖液上清液，并用50mL錐形管中的25mL100mM碳酸鈉緩沖液(pH11)替換。使用移液管將包含體重懸，并渦旋振蕩以徹底混合。在4℃下將管置于輕輕搖動(dòng)的平臺(tái)上過(guò)夜以提取靶蛋白。將提取物在4℃以30,000xg離心30分鐘，并且使用AmiconUltra-15再生纖維素離心過(guò)濾裝置(30,000分子量截留；Millipore，Billerica，MA)將所得上清液濃縮5倍。然后使用一次性PD-10柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ)將樣品緩沖液變?yōu)?0mMCAPS[3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸]pH10。實(shí)施例7凝膠電泳.將濃縮的提取物在含有5mM二硫蘇糖醇作為還原劑的LDS樣品緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以1:50稀釋?zhuān)⒃?5℃加熱4分鐘，以準(zhǔn)備用于電泳。將樣品加載到4-12％凝膠的一式兩份泳道中，旁邊是0.2至2μg/道的5個(gè)BSA標(biāo)準(zhǔn)品(用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線)。使用MOPSSDS運(yùn)行緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，施加200V電壓，直到跟蹤染料到達(dá)凝膠底部。用在45％甲醇，10％乙酸中的0.2％考馬斯藍(lán)G-250染色凝膠，并且首先用45％甲醇，10％乙酸短暫脫色，然后用7％乙酸，5％甲醇長(zhǎng)時(shí)間脫色，直到背景清除。脫色后，用BioradFluor-SMultiImager掃描凝膠。使用儀器的QuantityOnev.4.5.2軟件獲得背景扣除的染色蛋白條帶的體積，并產(chǎn)生用于計(jì)算儲(chǔ)備溶液中DIG-657蛋白濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)施例8DIG-657純化.如Lee，MK等人(2003)所述，類(lèi)似于VIP3進(jìn)行DIG-657的純化，其中將來(lái)源于用DIG-657基因轉(zhuǎn)化的Pf的細(xì)胞解凍，在0.5ml蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，St.Louis，MO)存在下懸浮于提取緩沖液(10mMTris-HCl，2mMEDTA，2mMDTT)中，超聲處理5次，每次1分鐘，在每個(gè)超聲處理循環(huán)之間在冰上靜止1分鐘。將溶液以20,000xg離心10分鐘，收集上清液并施加到MonoQ離子交換柱(1cm直徑x10cm長(zhǎng))上。通過(guò)在離子交換(MonoQ1010，GEHealthcare，Piscataway，NJ)，疏水層析和尺寸排阻層析上順序進(jìn)行層析來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)純化。最終的制備物顯示了以約90kDa的表觀分子量遷移的單條蛋白質(zhì)條帶。實(shí)施例9樣品制備和生物測(cè)定法.將DIG-657的純化制備物適當(dāng)?shù)卦?0mMCAPS，pH10中稀釋?zhuān)⑶宜猩餃y(cè)定法均包括由該緩沖液構(gòu)成的對(duì)照處理，充當(dāng)死亡率和/或生長(zhǎng)抑制的背景檢查。通過(guò)使用牛血清清蛋白(BSA)的凝膠電泳來(lái)估計(jì)生物測(cè)定法緩沖液中的蛋白濃度，以產(chǎn)生凝膠光密度測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其使用BioRad(Richmond，CA)成像系統(tǒng)(Fluor-SMultiImagerwithQuantityOnesoftwareversion4.5.2)來(lái)測(cè)量。用基于考馬斯藍(lán)的染料染色凝膠基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，并在讀取前脫色。在用1-2日齡的新生鱗翅目幼蟲(chóng)對(duì)人工昆蟲(chóng)食料進(jìn)行的生物測(cè)定法中測(cè)試純化的蛋白質(zhì)的殺蟲(chóng)活性。從昆蟲(chóng)養(yǎng)殖商(BenzonResearchInc.，Carlisle，PA)維持的群落獲得的卵孵化CEW，SBL，DBM，VBC，ECB，F(xiàn)AW和TBW的幼蟲(chóng)。從自專(zhuān)有群落(DowAgroSciencesLLC，Indianapolis，IN)收集的卵孵化rECB和rFAW的幼蟲(chóng)。在特別為昆蟲(chóng)生物測(cè)定法(C-DInternational，Pitman，NJ)設(shè)計(jì)的128孔塑料盤(pán)中進(jìn)行生物測(cè)定法。每個(gè)孔含有2.0mL多物種鱗翅目食料(SouthlandProducts，LakeVillage，AR)。通過(guò)移液管將40μL等分試樣的蛋白質(zhì)樣品遞送到每孔的2.0cm2食料表面(20μL/cm2)。食料濃度作為孔中每平方厘米(cm2)表面積的DIG-657蛋白的量(ng)計(jì)算。使用范圍為9,000至3ng/cm2的9個(gè)劑量濃度，每個(gè)劑量測(cè)試16只幼蟲(chóng)。將處理的盤(pán)保持在通風(fēng)櫥中，直到食料表面上的液體蒸發(fā)或吸收到食料中。在孵化的24-48小時(shí)內(nèi)，用濕潤(rùn)的駱駝毛刷挑出幼蟲(chóng)個(gè)體并且將其放置在經(jīng)處理的食料上，每孔一個(gè)幼蟲(chóng)。然后用透明塑料粘合片密封帶蟲(chóng)的孔，并通風(fēng)以允許氣體交換(C-DInternational，Pitman，NJ)。將生物測(cè)定盤(pán)在受控的環(huán)境條件(28℃，約60％相對(duì)濕度，16:8[光照:黑暗])下保持5天，之后記錄暴露于每種蛋白質(zhì)樣品的昆蟲(chóng)總數(shù)、死亡昆蟲(chóng)的數(shù)目、和存活的昆蟲(chóng)的重量。計(jì)算每種處理的百分死亡率和生長(zhǎng)抑制百分比。使用以下的等式計(jì)算生長(zhǎng)抑制(GI)：GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]其中TWIT是處理中昆蟲(chóng)的總重量，TNIT是處理中昆蟲(chóng)的總數(shù)，TWIBC是背景檢查(緩沖液對(duì)照)中昆蟲(chóng)的總重量，并且TNBBC是背景檢查(緩沖液對(duì)照)中昆蟲(chóng)的總數(shù)。GI50確定為GI值為50％時(shí)食料中DIG-657蛋白的濃度。50％致死濃度(LC50)記錄為食料中50％測(cè)試?yán)ハx(chóng)被殺死時(shí)的DIG-657蛋白濃度。通過(guò)使用經(jīng)由JMPPro,第9.0.3版,軟件(SASInstituteInc.,Cary,NC)的非線性邏輯3參數(shù)來(lái)確定生長(zhǎng)抑制濃度-響應(yīng)曲線。致死濃度-響應(yīng)曲線通過(guò)Probit分析(Finney，1971)合并的死亡率數(shù)據(jù)分析，并使用POLO-PC(LeOraSoftware)進(jìn)行。表2呈現(xiàn)了DIG-657蛋白對(duì)ECB，rECB，TBW，Pseudoplusiaincludes(Walker)(大豆尺蠖，“SBL”)，黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)(Hübner)(velvetbeancaterpillar，“VBC”)，CEW，F(xiàn)AW，rFAW和DBM的生物測(cè)定測(cè)試的結(jié)果。一個(gè)出乎意料且令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，rECB測(cè)試?yán)ハx(chóng)與ECB昆蟲(chóng)的敏感株系對(duì)DIG-657蛋白的作用一樣易感(即使不是更易感)。表2人工食料重疊生物測(cè)定法(ng/cm2)中測(cè)試的純化的DIG-657針對(duì)多種昆蟲(chóng)物種的效力。昆蟲(chóng)LC50(CI95％)(ng/cm2)GI50(CI95％)(ng/cm2)ECB281(166-470)8.6(6.6-11.1)rECB37(17-74)8.1(4.2-15.9)TBW608(311-1,432)12.9(5.9-28.1)SBL80(50-120)5.4(4.3-6.7)VBC66(45-95)18.9(12.2-29.3)CEW>9,00017.5(10.9-28.2)FAW>9,000563(398-796)rFAW～9,0002,651(1,030-6,822)DBM6.3(1.6-11.8)3.7(3.0-4.6)通過(guò)使用新生幼蟲(chóng)的表面污染進(jìn)行棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)生物測(cè)定法。在128個(gè)小室的盤(pán)中進(jìn)行毒性測(cè)試，每個(gè)小室2cm2。用僅緩沖液作為對(duì)照，使用25和2500ng/cm2的濃度測(cè)定死亡百分比(表3)。使用7種不同濃度的純化原毒素進(jìn)行測(cè)定LC50值的測(cè)試，用僅緩沖液作為對(duì)照(表4)。在25℃，16:8光照:黑暗條件條件下7天后評(píng)估死亡率和發(fā)育停滯。“功能死亡率”是獲得的評(píng)分死亡和L1發(fā)育停滯的幼蟲(chóng)。結(jié)果證明了DIG-657對(duì)棉鈴蟲(chóng)的活性。表3用人工食料生物測(cè)定法測(cè)試的針對(duì)棉鈴蟲(chóng)的DIG-657的百分比死亡率。表4用人工食料生物測(cè)定法測(cè)試的針對(duì)棉鈴蟲(chóng)的DIG-657的LC50(ng/cm2)。*()中的數(shù)值是0.95置信限度實(shí)施例10雙子葉植物中DIG-657Bt殺蟲(chóng)蛋白和變體的生成擬南芥轉(zhuǎn)化.使用花浸漬方法轉(zhuǎn)化擬南芥Col-01(Weigel和Glazebrook，2002)。使用選定的土壤桿菌菌落接種1mL至15mLYEP肉湯培養(yǎng)物(含有適于選擇的抗生素)。將培養(yǎng)物在28℃以220rpm恒定攪拌溫育過(guò)夜。使用每種培養(yǎng)物接種含有合適于選擇的抗生素的兩個(gè)500mLYEP肉湯培養(yǎng)物，并將新培養(yǎng)物在28℃在恒定攪拌下溫育過(guò)夜。將細(xì)胞在室溫以約8700xg沉淀10分鐘，并且棄去所得的上清液。將細(xì)胞離心沉淀輕輕地重懸于500mL浸潤(rùn)培養(yǎng)基中，所述浸潤(rùn)培養(yǎng)基含有：1/2XMurashige和Skoog鹽(Sigma-Aldrich)/Gamborg氏B5維生素(GoldBioTechnology，St.Louis，MO)，10％(w/v)蔗糖，0.044μM芐基氨基嘌呤(10μL/L的1mg/mL在DMSO中的儲(chǔ)液)和300μL/LSilwetL-77。將約1個(gè)月齡的植物浸入培養(yǎng)基中15秒，注意確保浸沒(méi)最新生的花序。然后，將植物側(cè)放并覆蓋(透明或不透明)24小時(shí)，用水清洗，并豎立放置。在22℃，以16:8光照:黑暗光周期培養(yǎng)植物。浸漬后約4周，收獲種子。擬南芥生長(zhǎng)和選擇。使新鮮收獲的T1種子在有干燥劑的條件下在室溫干燥至少7天。將種子懸浮在0.1％瓊脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中，然后在4℃分層2天。為了準(zhǔn)備種植，用細(xì)蛭石覆蓋在10.5英寸x21英寸的萌發(fā)盤(pán)(TOPlasticsInc.，Clearwater，MN)中的SunshineMixLP5(SunGroHorticultureInc.，Bellevue，WA)，用霍格蘭(Hoagland)氏溶液(Hoagland和Arnon，1950)地下灌溉，直到濕潤(rùn)，然后排干24小時(shí)。將分層的種子播種到蛭石上并用濕度罩(KORDProducts，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋7天。使種子發(fā)芽，并在Conviron(CMP4030或CMP3244型；ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中，在長(zhǎng)日照條件(16:8光照:黑暗光周期)、120-150μmol/m2sec的光強(qiáng)度、恒定的溫度(22℃)和濕度(40-50％)下種植植物。最初用霍格蘭氏溶液澆灌植物，隨后用去離子水澆灌，以保持土壤潤(rùn)而不濕。在播種后5-6天除去罩，并用化學(xué)選擇劑噴霧植物以殺死未轉(zhuǎn)化的種子萌發(fā)出的植物。例如，如果二元植物轉(zhuǎn)化載體所提供的植物表達(dá)選擇標(biāo)志物基因是pat或bar基因(Wehrmann等人，1996)，可以通過(guò)用1000XFinale溶液(5.78％草銨膦(glufosinateammonium)，F(xiàn)arnamCompaniesInc.，Phoenix，AZ.)噴霧來(lái)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物。隨后以5-7天的間隔進(jìn)行兩次噴霧。在最后一次噴霧后7-10天鑒定存活者(活躍生長(zhǎng)的植物)，并移植到備有SunshineMixLP5的盆中。用濕度罩將移植的植物覆蓋3-4天，并在上文提及的生長(zhǎng)條件下置于Conviron中。雙子葉植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，當(dāng)使用其它植物可表達(dá)的選擇標(biāo)志物基因(例如除草劑耐受性基因)時(shí)，可以使用其他選擇轉(zhuǎn)化植物的方法。實(shí)施例11包含DIG-657的轉(zhuǎn)基因大豆(Glycinemax).，按照本領(lǐng)域已知的方式，包括例如通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生10至20株攜帶包含DIG-657的核酸的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因T0大豆植物。將成熟的大豆種子用氯氣滅菌過(guò)夜，歷時(shí)16小時(shí)。在用氯氣滅菌后，將種子置于LAMINARTM流動(dòng)罩中的敞口容器中以驅(qū)除氯氣。接著，使用黑箱，在24℃在黑暗中將滅菌的種子用無(wú)菌H2O吸水16小時(shí)。分割種子大豆的制備。包含部分胚軸的分割大豆種子規(guī)程需要準(zhǔn)備大豆種子材料，使用固定到解剖刀上的#10刀片沿著種臍縱向切割大豆種子材料，以分離和除去種皮，并將種子分割成兩個(gè)子葉段。小心地除去部分胚軸，其中約1/2-1/3的胚軸保持附著于子葉的節(jié)端。接種。然后，將包含部胚軸的一部分的分割大豆種子浸入含有根癌土壤桿菌的溶液中約30分鐘，根癌土壤桿菌是包含DIG-657的二元質(zhì)粒的根癌土壤桿菌(例如菌株EHA101或EHA105)。在浸沒(méi)包含胚軸的子葉前，將根癌土壤桿菌溶液稀釋至λ＝0.6OD650的終濃度。共培養(yǎng)。接種后，讓分割的大豆種子在覆蓋有濾紙的培養(yǎng)皿中與根癌土壤桿菌菌株在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(Wang,Kan.AgrobacteriumProtocols.2.1.NewJersey:HumanaPress,2006.Print.)上共培養(yǎng)5天。芽誘導(dǎo)。在共培養(yǎng)5天后，在由B5鹽，B5維生素，28mg/L亞鐵，38mg/LNa2EDTA，30g/L蔗糖，0.6g/LMES，1.11mg/LBAP，100mg/LTimentinTM，200mg/L頭孢噻肟和50mg/L萬(wàn)古霉素組成的液體芽誘導(dǎo)(SI)培養(yǎng)基(pH5.7)中清洗分割的大豆種子。然后，在由B5鹽，B5維生素，7g/LNoble瓊脂，28mg/L亞鐵，38mg/LNa2EDTA，30g/L蔗糖，0.6g/LMES，1.11mg/LBAP，50mg/LTIMENTINTM，200mg/L頭孢噻肟，50mg/L萬(wàn)古霉素組成的芽誘導(dǎo)I(SII)培養(yǎng)基(pH5.7)上培養(yǎng)分割的大豆種子，使子葉的平坦面向上且將子葉的結(jié)節(jié)端包埋到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)2周后，將來(lái)自經(jīng)轉(zhuǎn)化的分割大豆種子的外植體轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)充有6mg/L草丁膦的SII培養(yǎng)基的芽誘導(dǎo)II(SIII)培養(yǎng)基。芽伸長(zhǎng)。在SIII培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，從外植體中取出子葉，并通過(guò)在子葉的基部處進(jìn)行切割來(lái)切出含有胚軸的平齊芽墊(flushshootpad)。將來(lái)自子葉的分離的芽墊轉(zhuǎn)移至芽伸長(zhǎng)(SE)培養(yǎng)基。SE培養(yǎng)基由MS鹽，28mg/L亞鐵，38mg/LNa2EDTA，30g/L蔗糖和0.6g/LMES，50mg/L天冬酰胺，100mg/LL-焦谷氨酸，0.1mg/LIAA，0.5mg/LGA3,1mg/L玉米素核苷，50mg/LTIMENTINTM，200mg/L頭孢噻肟，50mg/L萬(wàn)古霉素，6mg/L草丁膦，7g/LNoble瓊脂(pH5.7)。每2周將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的SE培養(yǎng)基中。在24℃在CONVIRONTM生長(zhǎng)室中以80-90μmol/m2sec的光強(qiáng)度以18小時(shí)光周期培養(yǎng)培養(yǎng)物。生根。通過(guò)在子葉芽墊的基部處切割伸長(zhǎng)的芽來(lái)分離從子葉芽墊形成的伸長(zhǎng)的芽，并將伸長(zhǎng)的芽浸入1mg/LIBA(吲哚3-丁酸)中1-3分鐘促進(jìn)生根。接著，將伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)移到植物盤(pán)中的生根培養(yǎng)基(MS鹽，B5維生素，28mg/L亞鐵，38mg/LNa2EDTA，20g/L蔗糖和0.59g/LMES，50mg/L天冬酰胺，100mg/LL-焦谷氨酸7g/LNoble瓊脂，pH5.6)。培養(yǎng)。在24℃，18小時(shí)光周期在CONVIRONTM生長(zhǎng)室中培養(yǎng)1-2周后，將已經(jīng)形成根的芽轉(zhuǎn)移到覆蓋的圣代杯中的土壤混合物，并在恒定溫度(22℃)和濕度(40-50％)下在長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下以120-150μmol/m2sec的光強(qiáng)度置于CONVIRONTM生長(zhǎng)室(CMP4030和CMP3244型，ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中用于馴化小植物。將生根的小植物在圣代杯中馴化幾周，之后將它們轉(zhuǎn)移到溫室中以進(jìn)一步馴化和建立強(qiáng)健的轉(zhuǎn)基因大豆植物。將轉(zhuǎn)基因品系的發(fā)育和形態(tài)學(xué)特征與非轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行比較。比較植物根，枝條，葉和繁殖特征。在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)化植物的根長(zhǎng)度和生長(zhǎng)模式中沒(méi)有觀察到的差異。植物枝條特征，例如高度，葉數(shù)目和大小，開(kāi)花時(shí)間，花大小和外觀是相似的。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)在體外和在溫室中的土壤中培養(yǎng)時(shí)，在轉(zhuǎn)基因品系與沒(méi)有DIG蛋白表達(dá)的那些品系之間沒(méi)有可觀察到的形態(tài)學(xué)差異。實(shí)施例12在單子葉植物中生成DIG-657Bt殺蟲(chóng)蛋白和變體。土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化.將來(lái)自HighII或B-104F1雜交的種子(Armstrong等人，1991)種植到5加侖盆中，該盆含有95％Metro-Mix360無(wú)土生長(zhǎng)培養(yǎng)基(SunGroHorticulture，Bellevue，WA)和5％粘土/壤土的混合物。在溫室中種植植物，使用高壓鈉和金屬鹵化物燈的組合，光周期為16:8小時(shí)光照:黑暗。為了獲得用于轉(zhuǎn)化的未成熟F2胚，進(jìn)行受控的近緣授粉。在授粉后8-10天，當(dāng)胚的大小為約1.0至2.0mm時(shí)分離未成熟的胚。感染和共培養(yǎng).如下對(duì)玉米穗表面滅菌：用洗潔精擦洗，浸入70％乙醇中2分鐘，然后浸入20％商業(yè)漂白劑(0.1％次氯酸鈉)中30分鐘，之后用無(wú)菌水漂洗。如下制備含有超二元載體的土壤桿菌細(xì)胞的懸液：取1-2環(huán)在含有100mg/L壯觀霉素，10mg/L四環(huán)素和250mg/L鏈霉素的YEP固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2-3天后的細(xì)菌，轉(zhuǎn)移到5mL液體感染培養(yǎng)基(LS基本培養(yǎng)基(Linsmaier和Skoog，1965)，N6維生素(Chu等，1975)，1.5mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，68.5gm/L蔗糖，36.0gm/L葡萄糖，6mML-脯氨酸，pH5.2)中。渦旋振蕩溶液直到得到均勻的懸浮液，將濃度調(diào)節(jié)至最終密度約200Klett單位(使用具有紫色濾器的Klett-Summerson比色計(jì))或550nm的光密度約0.4。將未成熟的胚直接分離到含有2mL感染培養(yǎng)基的微量離心管中。除去培養(yǎng)基并替換為1mL密度200Klett單位的土壤桿菌溶液，并且將土壤桿菌和胚溶液在室溫溫育5分鐘，然后轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，(含有N6維生素，1.5mg/L2,4-D，30.0gm/L蔗糖，6mML-脯氨酸，0.85mg/LAgNO3，100μM乙酰丁香酮和3.0gm/LGellan膠(PhytoTechnologyLaboratories.，Lenexa，KS)，pH5.8)，25℃黑暗條件下歷時(shí)5天。共培養(yǎng)后，將胚轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基，之后在約8周的過(guò)程里獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的分離株。為了選擇出轉(zhuǎn)化了含有植物可表達(dá)pat或bar選擇標(biāo)志物基因的超二元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的玉米組織，使用含有雙丙氨磷(Bialaphos)(GoldBioTechnology，St.Louis，MO)的基于LS的培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具有1XN6維生素，1.5mg/L2,4-D，0.5gm/LMES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸一水合物；PhytoTechnologyLaboratories.，Lenexa，KS)，30.0gm/L蔗糖，6mML-脯氨酸，1.0mg/LAgNO3，250mg/L頭孢噻肟，2.5gm/LGellan膠，pH5.7)。將胚轉(zhuǎn)移至含有3mg/L雙丙氨磷的選擇培養(yǎng)基，直到獲得生胚的分離株。通過(guò)每隔2周轉(zhuǎn)移到新鮮選擇培養(yǎng)基來(lái)積累回收的分離株，用于再生和進(jìn)一步分析。玉米轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，轉(zhuǎn)化植物的其它選擇方法在使用其它植物可表達(dá)選擇標(biāo)志物基因(例如，例如除草劑耐受性基因)時(shí)是可用的。將包含在質(zhì)粒pDAB114534和pDAB114535中的DIG-657的兩種不同構(gòu)建體(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)(表5)轉(zhuǎn)化到玉米中。再生T0植物，并測(cè)試其控制目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的能力。構(gòu)建體pDAB115782是含有YFP(黃色熒光蛋白)基因的質(zhì)粒，作為用非殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化的植物的陰性對(duì)照。表5描述含有轉(zhuǎn)化到玉米植物中的不同DIG-657構(gòu)建體的質(zhì)粒。從V5T0轉(zhuǎn)基因植物的V3或V4葉中一式兩份采集1.0X0.5平方英寸葉切片。對(duì)于每個(gè)測(cè)試，首先取樣野生型植物葉組織，以防止葉邊緣上的Bt毒素的交叉污染，然后采樣轉(zhuǎn)化的植物。在每個(gè)生物測(cè)定法盤(pán)孔(32孔盤(pán)和蓋，CDInternational，Pitman，NJ)中，將1片葉切片置于2％水-瓊脂(FisherScientific，F(xiàn)airLawn，NJ)上，并且對(duì)每個(gè)昆蟲(chóng)物種、每個(gè)事件和每個(gè)構(gòu)建體重復(fù)2次。用10個(gè)ECB或Diatraeasaccharalis(Fabricius)(甘蔗螟(SugarcaneBorer)“SCB”)新生蟲(chóng)(24-48小時(shí)齡)侵染每個(gè)孔，并用塑料的帶孔蓋密封以允許空氣交換。將盤(pán)置于28℃(16:8小時(shí)光照:黑暗，40％RH)，并且在3天后，對(duì)它們的百分比葉損傷分級(jí)。當(dāng)通過(guò)使用Pro9.0.1(2010SASInstituteInc.,Cary,NC)，方差均勻時(shí)，用ANOVA和用Tukey-Kramer檢驗(yàn)的平均分離分析百分比葉損傷數(shù)據(jù)。表6中顯示了在轉(zhuǎn)基因植物材料上觀察到的由每種昆蟲(chóng)物種所致的葉損傷的水平。表6由以來(lái)自構(gòu)建體114534，114535或115782的T0玉米葉組織為食的ECBorSCB幼蟲(chóng)引起的平均百分比葉損傷*標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)與YFP陰性對(duì)照構(gòu)建體(115782)相比，構(gòu)建體114534和114535兩者均導(dǎo)致更小的均值損傷。與表達(dá)截短的DIG-657蛋白的構(gòu)建體114535相比，表達(dá)全長(zhǎng)DIG-657蛋白的構(gòu)建體114534表現(xiàn)出更大的昆蟲(chóng)活性。實(shí)施例13再生和種子生產(chǎn).為了再生，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到“28”誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS鹽和維生素，30gm/L蔗糖，5mg/L芐基氨基嘌呤，0.25mg/L2,4-D，3mg/L雙丙氨膦，250mg/L雙丙氨磷，250mg/L頭孢噻肟，2.5gm/L結(jié)冷膠，pH5.7)，在低光照條件(14μEm-2s-1)下1周，然后在高光照條件(約89μEm-2s-1)1周。隨后，將組織轉(zhuǎn)移至“36”再生培養(yǎng)基(與缺少植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同)。將3-5cm長(zhǎng)的小植株轉(zhuǎn)移到含有SHGA培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt鹽和維生素(1972)；PhytoTechnologyLaboratories.，Lenexa，KS)，1.0gm/L肌醇，10gm/L蔗糖和2.0gm/LGellan膠，pH5.8)的玻璃培養(yǎng)管，以允許芽和根的進(jìn)一步生長(zhǎng)和發(fā)育。將植物移植到如本文早先描述的相同的土壤混合物中，并在溫室中培養(yǎng)至開(kāi)花。進(jìn)行用于種子生產(chǎn)的受控授粉。實(shí)施例14用于DIG-657Bt殺蟲(chóng)蛋白的編碼序列的植物優(yōu)化形式的設(shè)計(jì).設(shè)計(jì)并合成具有植物密碼子偏好的DNA序列，以在轉(zhuǎn)基因單子葉植物和雙子葉植物中產(chǎn)生DIG-657蛋白。從自GenBank中保存的序列獲得的706種蛋白質(zhì)編碼序列(CD)計(jì)算玉米(玉蜀黍)的密碼子選擇表。從網(wǎng)站http://www.kazusa.or.jp/codon/的數(shù)據(jù)下載煙草(煙草(Nicotianatabacum)，1268種CD)，蕓苔(歐洲油菜(Brassicanapus)，530種CD)，棉(陸地棉(Gossypiumhirsutum)，197種CD)和大豆(大豆；約1000種CD)的密碼子選擇表。在省略掉任一植物類(lèi)型中的使用占某一氨基酸的總密碼子使用小于約10％的冗余密碼子后，計(jì)算出一個(gè)偏倚的密碼子集，其包括玉米數(shù)據(jù)集和雙子葉數(shù)據(jù)集兩者共有的高使用密碼子，這些密碼子具有合適的加權(quán)平均相對(duì)量。為了得到編碼DIG-657蛋白的植物優(yōu)化序列，對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的DIG-657DNA序列進(jìn)行密碼子取代，使得所得的DNA序列具有上述植物優(yōu)化的密碼子偏好表的總體密碼子組成。對(duì)該序列進(jìn)一步精修以消除不想要的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)、潛在的植物內(nèi)含子剪接位點(diǎn)、長(zhǎng)段的A/T或C/G殘基、和其它可能干擾植物細(xì)胞中的編碼區(qū)的RNA穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄，或翻譯的基序。進(jìn)行其它變化以引入期望的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，并且消除長(zhǎng)的內(nèi)部可讀框(除了+1外的框)。這些變化均在保留植物偏愛(ài)的密碼子組成的約束下進(jìn)行。設(shè)計(jì)出來(lái)的序列由商業(yè)供應(yīng)商(DNA2.0,MenloPark,CA)合成。其他關(guān)于生成合成基因的指導(dǎo)可以參見(jiàn)例如WO97/13402和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,380,831。SEQIDNO:3中給出了一種編碼DIG-657變體1的玉米優(yōu)化的DNA序列。SEQIDNO:4中給出了一種編碼DIG-657變體2的熒光假單胞菌優(yōu)化的DNA序列。SEQIDNO:5中給出了一種編碼DIG-657的玉米優(yōu)化的高GCDNA序列。SEQIDNO:6中給出了一種編碼來(lái)自N-末端的截短204aa的DIG-657基因的玉米優(yōu)化的高GCDNA序列。編碼全長(zhǎng)DIG-657的雙子葉優(yōu)化的DNA序列作為SEQIDNO:8公開(kāi)。編碼截短的DIG-657的雙子葉優(yōu)化的DNA序列作為SEQIDNO:9公開(kāi)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，同上)進(jìn)行Southern印跡上固定化DNA與放射性標(biāo)記的基因特異性探針的雜交。用于標(biāo)記多核苷酸探針的放射性同位素包括32P，33P，14C或3H。將放射性同位素?fù)饺攵嗪塑账崽结樂(lè)肿油ㄟ^(guò)分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法中的任一種完成。(參見(jiàn)例如Sambrook等人，同上)。通常，雜交和隨后的清洗在容許檢出與要求保護(hù)的毒素編碼基因具有同源性的靶序列的嚴(yán)格條件下實(shí)施。對(duì)于雙鏈DNA基因探針，在6XSSPE、5X登哈特氏溶液、0.1％SDS，0.1mg/mL變性DNA中，在比于DNA雜交體的Tm的低20℃至25℃的溫度下雜交過(guò)夜[20XSSPE為3MNaCl，0.2MNaHPO4，和0.02MEDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)；100X登哈特氏溶液(20gm/L聚乙烯吡咯烷酮，20gm/LFicoll型400和20gm/LBSA-級(jí)份V)]。清洗通常如下實(shí)施：a.在1XSSPE，0.1％SDS中，室溫，15分鐘，兩次(低嚴(yán)格性清洗)。b.在0.2XSSPE，0.1％SDS中，比Tm低的20℃的溫度，15分鐘，一次(中等嚴(yán)格性清洗)。對(duì)于寡核苷酸探針，可以在6XSSPE、5X登哈特氏溶液、0.1％SDS，0.1mg/mL變性DNA中，在比雜交體的Tm低10℃至20℃的溫度進(jìn)行雜交過(guò)夜。寡核苷酸探針的Tm可以通過(guò)以下公式(Suggs等，1981)求出。Tm(℃)＝2(T/A堿基對(duì)的數(shù)目)+4(G/C堿基對(duì)的數(shù)目)通常如下實(shí)施清洗：a.在1XSSPE，0.1％SDS中，室溫，15分鐘，兩次(低嚴(yán)格性清洗)。。b.在1XSSPE，0.1％SDS中，在雜交溫度下，15分鐘，一次(中等嚴(yán)格性清洗)?？梢酝ㄟ^(guò)除了放射性標(biāo)記之外的手段使得用于雜交的探針?lè)肿右约疤结樅桶蟹肿又g形成的雜交分子可檢測(cè)。這些替代方法意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中已經(jīng)詳細(xì)描述了具體實(shí)施方案作為示例，但本公開(kāi)內(nèi)容的各種修改和備選形式是容易作出的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本公開(kāi)不旨在限于所公開(kāi)的特定形式。相反，本公開(kāi)將覆蓋落入由所附權(quán)利要求書(shū)及其法律等同物限定的本公開(kāi)的范圍內(nèi)的所有修改，等同方案和備選方式。序列表<110>美國(guó)陶氏益農(nóng)公司Armstrong,JannaM.Etter,AudreyJ.Frey,MeghanL.Gandra,PremchandLetherer,TedLin,GaofengMadduri,KrishnaM.Mowery,HaleyR.Narva,KennethE.Sheets,JoelJ.Tan,SekYee<120>可用于控制昆蟲(chóng)有害生物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)殺蟲(chóng)蛋白<130>74948<160>13<170>PatentInversion3.5<210>1<211>2412<212>DNA<213>Bacillusthuringiensis<400>1atggtacaaaaatggatgcaaaggatgataattgtggataataataaattaaatgtaaga60gctttaccaagctttattgattattttaacggtatttatggatttgccactggtatcaaa120gatattatgggaatgatttttaaaacagatacaggtggtagtaatttaacattagatgag180attttaaagaatcaaaatttactaaatgatatctcaggtaagctcgatggaattaatgga240gatttaggggatcttattgcacaagggaacttgaattcagaattagctaaggaattgcta300aaaatctctaatgagcagaatcaaatgttaaatcatgttaatgctcaacttaatgcaatc360aattcaacacttaatatatatcttccaaaaattacatctatgttaaatgaggtgatgaag420caaaaccatgttttaagtctacaaatagaatttcttagtaagcaattgcaggaaatttca480gataaacttgatattatcaacttaaacgtattgattaactctacattaacagagattact540cctgcttatcaacgtattaaatatgtaaacgaaaaatttgatgaattgacttctactgta600gagaaaaatccaaaatcatatcaagataacgttactaaagaagttattgaaaacttaaat660gagctaactgagttggcgaaaagtgttaccaaaaatgatatggatagttttgaattttat720cttcaaactttccatgatgtaatgactggaaataatttattcggccgctcagcattaaaa780actgcttcagaattaattacaaaagaaaatgtcacgacaaggggaagtgagataggaaaa840gtttataatttcttaattgttttaacttctttacaagcaaaagcttttctcactttaact900gcatgtcgaaagttattaggtttaacagatatcgattatactcaaattatgaatcatcat960atagatggtcaaaaaagagaatttcgtattaatattcttccaacactttctaataatttt1020tctaatcctagttattcaaaaaatagaggaagtgatatcgatgatccaattgttgtgtta1080gaagcagcacctggatatgccttaataggatttgaaattctaaacgatccacttccaatt1140ttaaaaggatatcaggctaggttaaaaccaaattatcaagttgacagggagtcgatgtca1200gaaacgatttatggggacattcataaattattttgcccaaaacagctggagcaaaaatat1260tatattaaagatattgaatttcctgagggctatgtaattactaaaatcgtttttgaaaaa1320aggctaaatcaattggggtatgaggtaacagcaaatttttatgacccgtctacaggaagt1380atcgatttaaataaggttaaagtagaatcttggaaggaaaagtcttgcgaggaggattcc1440tgcgaagatgagtatagtattataaaggccgaaacggatggcatttatatgccattaggc1500gtagtaagtgagacttttttaacccctatttatggttttggattaacagttgacgaaaaa1560aatcaaaaaataactttaacaggtaaatcctatttacgtgaatccttactagaaacagac1620ttacttaacaatgaaacatatttaattgcttcaccagacggttatattagtagtattgta1680gaaaactggaatataacatcagataatactgggtcttggagagcaaataataataat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