Dse菌株24l-4及其在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了DSE菌株24L-4，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及能明顯促進鐵皮石斛生長的DSE菌株及其在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用。該真菌株能顯著促進鐵皮石斛的生長，利用該菌接種鐵皮石斛組培苗45d后生物量比對照增加了19.4%，接種鐵皮石斛盆栽苗180d后植株生物量比空白對照增加了18.5%，株高增加了15.3%，莖徑增加了6.8%，芽數(shù)增加了22.1%。本發(fā)明的有益效果是：該菌株可應(yīng)用于鐵皮石斛專用微生物菌劑的生產(chǎn)和生物有機肥的開發(fā)，對鐵皮石斛的規(guī)?；a(chǎn)、保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】DSE菌株24L-4及其在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及能促進鐵皮石斛生長的DSE菌株24L-4及其在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophyte, DSE)是植物共生真菌的典型代表之一，其一般特征是菌絲顏色較深、具有明顯橫隔，廣泛存在于健康植物根的表皮、表層甚至維管束組織的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙，能夠在植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙形成“微菌核”等結(jié)構(gòu)特征。劉茂軍等(深色有隔內(nèi)生真菌(DSE)研究進展[J],菌物學(xué)報，2009，28 (6) =888-894)研究報道DSE具有促進宿主礦質(zhì)營養(yǎng)吸收、促進宿主對有機養(yǎng)分的吸收、提高宿主抗逆性、提高宿主的抗病能力等生態(tài)學(xué)功能，可望促進作物生長和提高抗逆能力，減少化學(xué)農(nóng)藥肥料的使用，修復(fù)和 降低環(huán)境污染。
[0003]鐵皮石斛是一種珍稀名貴的藥用和觀賞植物，由于鐵皮石斛的生長除了對氣候和上壤環(huán)境要求較高外，在自然界中其生長還需要共生真菌的參與，人工栽培往往成活率較低，生長緩慢。通過篩選能顯著促進鐵皮石斛生長的DSE真菌，建立“鐵皮石斛-DSE”高效共生體系，提高鐵皮石斛的成活率和產(chǎn)量，可用于鐵皮石斛專用菌肥的開發(fā)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種DSE菌株24L-4及其在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用，能促進鐵皮石斛的生長。
[0005]本發(fā)明所述的DSE菌株24L-4為Devriesia sp.，該菌株已于2014年4月28日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，其地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，其保藏編號為=CGMCC N0.9098。
[0006]該菌株從茶花葉部組織分離獲得，通過觀察其在宿主植物的定殖特征確定其為DSE菌株，菌株命名為24L-4。經(jīng)菌株形態(tài)學(xué)和18S rDNA序列分析，該菌株鑒定為德弗霉菌屬 Devriesia sp.真菌。
[0007]所述DSE真菌菌株24L-4的提純步驟包括:
步驟A:取茶花葉片，清洗殺菌后吸干表面水分后置于玉米粉培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌落長出；步驟B:將葉部組織置于培養(yǎng)皿平板上，于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至葉片組織周圍長出菌絲體，挑取菌絲置于CMMY培養(yǎng)基，得到純化菌株。
[0008]優(yōu)選的，所述玉米粉培養(yǎng)基包括:玉米粉6-10g/L，瓊脂粉7-8g/L。
[0009]優(yōu)選的，CMMY培養(yǎng)基包括:麥芽提取物8_12g/L，酵母浸膏1.5_3g/L，玉米粉瓊脂7-9g/L，瓊脂 7-9g/L。
[0010]所述DSE真菌菌株在促進鐵皮石斛組培苗生長上的應(yīng)用，包括以下步驟:
步驟A,:將供試菌株活化后接種于燕麥培養(yǎng)基中，待菌落長大后備用；
步驟B':選擇長勢一致的無菌鐵皮石斛組培苗移栽至培養(yǎng)皿平板的菌落上，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后將根部培養(yǎng)基洗凈后干燥后稱量干重。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟B'中，培養(yǎng)的條件為:溫度為25 °C，光照強度為160-200 μ molnT2sA光照時間為15_18h，培養(yǎng)時間為40_50d。
[0012]優(yōu)選的，所述燕麥培養(yǎng)基包括:燕麥粉10g/L,瓊脂18g/L，MgSO4.7H201g/L,KH2PO4L 5g/L, NaN03lg/L。
[0013]所述DSE菌株在促進鐵皮石斛盆栽苗生長上的應(yīng)用，包括以下步驟:
步驟A":選取長勢一致的鐵皮石斛苗，移栽至培養(yǎng)杯中，移栽成活后待用；
步驟B":在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基TOB中接入菌絲塊，振蕩培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)物打碎配置成菌液，灌根鐵皮石斛苗。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟A"中，所述培養(yǎng)基質(zhì)為水草。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟B"中馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基包括:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水 1000mL。
[0016]優(yōu)選的，所述 步驟B"中灌根條件為每杯鐵皮石斛灌根25_35mL菌液，每隔10_15d灌根一次，共灌根2-3次。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:該菌株可應(yīng)用于鐵皮石斛專用微生物菌劑和生物有機肥的開發(fā)，對促進鐵皮石斛的規(guī)模化生產(chǎn)和保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明中菌株24L-4的菌落形態(tài)。
[0019]圖2是本發(fā)明中鐵皮石斛組培苗接種菌株24L-4培育90天后長勢對照。
[0020]圖3是本發(fā)明中在鐵皮石斛根部觀察到菌株24L-4的DSE微菌核定殖特征。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進一步的詳細(xì)說明。
[0022]實施例1 本發(fā)明菌株的分離。
[0023]取茶花葉片，用自來水沖洗表面的灰層及附著物，涼干表面水份，將葉片剪成邊長約為0.5-1.2cm的正方片，在超凈工作臺上先用70%酒精浸10_20s，再用I %次氯酸鈉浸l-2min,無菌水洗3-5次，用滅菌濾紙吸干表面水分后置于玉米粉培養(yǎng)基(玉米粉6_10g/L，瓊脂粉7-8g/L)上培養(yǎng)。90mm的培養(yǎng)皿接4_8片組織片，于22_28°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至葉片組織周圍長出菌絲體，挑取菌絲置于CMMY培養(yǎng)基(麥芽提取物8-12g/L，酵母浸膏
1.5-3g/L，玉米粉瓊脂7-9g/L，瓊脂7-9g/L)上，獲得純化菌株。
[0024]實施例2
本發(fā)明菌株的形態(tài)學(xué)特征。
[0025]將菌株接種于CMMY培養(yǎng)基上，23°C培養(yǎng)3周后觀察其形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果見圖1。
[0026]實施例3
本發(fā)明菌株的18S rDNA序列分析。
[0027]菌株培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基TOB，在28°C、120r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)10-15d后，過濾收集菌絲。菌絲體總DNA采用Saghai et al.的CTAB法提取。18S rDNA區(qū)域PCR擴增分別采用White et al.的通用引物NS1/NS4進行擴增。PCR反應(yīng)體系為:TIANgel—管便捷式 MasterMix(成分:10mM Tris-HCl ρΗ8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2,250uM dNTPeach、0.05U Polymerase/μ L、ddH20) 9 μ L，20umol/L 正反引物各 lyL，模板DNAl μ L，用超純水定容至25 μ L。PCR反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR擴增產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成，測序結(jié)果在GenBank登錄和比對分析。
[0028]菌株24L-4的18S rDNA部分區(qū)域的核苷酸序列:
【權(quán)利要求】
1.DSE 菌株 24L-4，其保藏編號為:CGMCC N0.9098。
2.權(quán)利要求1所述DSE菌株在促進鐵皮石斛組培苗生長上的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述DSE菌株在促進鐵皮石斛盆栽苗生長上的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: 步驟A,:將供試菌株活化后接種于燕麥培養(yǎng)基中，待菌落長大后備用； 步驟B':選擇長勢一致的無菌鐵皮石斛組培苗移栽至培養(yǎng)皿平板的菌落上，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后將根部培養(yǎng)基洗凈后干燥后稱量干重。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟Ai中燕麥培養(yǎng)基包括:燕麥粉10g/L，瓊脂 18 g/L，MgSO4.7H20 I g/L，KH2PO4 1.5 g/L，NaNO3 I g/L。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟B'中培養(yǎng)條件為:溫度為25°C，光照強度為160-200ymol nT2S-2，光照時間為15_18h/d，培養(yǎng)時間為40_50d。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: 步驟A":選取長勢一致的鐵皮石斛苗，移栽至培養(yǎng)杯中，移栽定殖后澆菌液； 步驟B":在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基TOB中接入菌絲塊，振蕩培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)物打碎配置成菌液，灌根鐵皮石斛苗。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟A"中，所述培養(yǎng)基質(zhì)為水草。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟B"中，馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基包括:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL。
10.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟B"中灌根條件為每杯鐵皮石斛灌根25-35mL菌液，每隔10_15d灌根一次，共灌根2_3次。
【文檔編號】A01H4/00GK103981102SQ201410220965
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】謝玲, 覃麗萍, 張雯龍, 秦碧霞, 藍桃菊 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所