一種桂花組織的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)方法【技術領域】，尤其涉及一種桂花組織的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理；用解剖刀將莖尖截成1～2mm，接種于含有初代培養(yǎng)基的三角瓶中；等莖尖長成2～3cm的無菌苗，將其切成0.5～1cm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養(yǎng)基的三角瓶中使其增殖；將繼代培養(yǎng)后得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養(yǎng)基中；移栽，得到生根苗。相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點：經(jīng)統(tǒng)計，采用本發(fā)明的方法，桂花從一個莖尖到成苗移栽，只需要四個月左右的時間，這一時間優(yōu)勢是其它繁殖手段不能比擬的。另外本發(fā)明用到的藥品價格相對低廉，從而在很大程度上縮減了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種桂花組織的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)方法【技術領域】，尤其涉及一種桂花組織的培養(yǎng)方法?！颈尘凹夹g】
[0002]桂花又名木犀、九里香，其系木犀科木犀屬植物。桂花既是園林綠化的優(yōu)良樹種及名貴香料，也是傳統(tǒng)的中藥材，在很多方面具有重要的價值。例如，桂花可食用，在食品、制茶和釀酒工業(yè)中，人們將桂花做為糕點、熏茶、糖果和釀酒的配料，來提高食品的質量。再如，桂花作為一種著名的天然芳香植物，其香味異常，是提煉桂花浸膏、桂花香精和香水的重要原料。還如，桂花具有重要的藥用價值。桂花的根或根皮、枝葉、花和果實均可藥用。現(xiàn)代醫(yī)學表明，桂花中含有豐富的黃酮類化合物，具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和鎮(zhèn)痛等功效，對人類腫瘤、衰老、心血管疾病的預防和治療有著重要意義。
[0003]植物組織培養(yǎng)也叫離體培養(yǎng)，是指在無菌條件下，通過將離體的植物細胞、器官、原生質體以及胚胎等，在人工配制的培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)，來獲得完整的再生植株的技術過程。它是20世紀發(fā)展起來的一門新興技術，它具有效率高、生長周期短、繁殖率高、培養(yǎng)條件可控、方便管理和利于工廠生產(chǎn)等優(yōu)點，被廣泛應用于農業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等多種行業(yè)，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
[0004]目前，木犀科植物的組織培養(yǎng)仍處在開始時期，開展研究的植物還不多，而對于屬于木犀科植物的的桂花的組織培養(yǎng)方法的研究更是少之又少。
[0005]因此，確有必要提供一種桂花組織的培養(yǎng)方法，其不僅可以在較短的時間內成功獲得桂花生根苗，而且成本較低。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于:針對現(xiàn)有技術的不足，而提供一種桂花組織的培養(yǎng)方法，其不僅可以在較短的時間內成功獲得桂花生根苗，而且成本較低。
[0007]為了達到上述要求，本發(fā)明采用如下的技術方案:
一種桂花組織的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理；
第二步，初代培養(yǎng)，取消毒后的桂花嫩枝莖尖，先用消毒后的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm，接種于含有初代培養(yǎng)基的三角瓶中，所述初代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上2~4%的蔗糖、5~9g/L的瓊脂粉、1.0~5.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA，所述初代培養(yǎng)基的pH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為1500~20001x，光照時間為12~14h/d，培養(yǎng)25~35d。
[0008]第三步，繼代培養(yǎng)，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養(yǎng)基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上2~4%的蔗糖、1.0~3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA，所述繼代培養(yǎng)基的PH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為2000~25001x，光照時間為12~14h/d，培養(yǎng)25~35d ；
第四步，將繼代培養(yǎng)后得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為基本的1/2MS培養(yǎng)基加上1.0~3.0mg/L的生長素NAA，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為1000~15001x，光照時間為O~4h/d，培養(yǎng)35~45d ;生根培養(yǎng)時，隨著光照時間的縮短，黑暗時間的延長，桂花幼苗的生根率逐漸上升，全黑暗處理的生根率高達88%。這可能是因為黑暗條件抑制了材料本身酚類物質的氧化，減少了醌類物質產(chǎn)生的毒害以及對外植體內源激素的破壞。
[0009]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入5~15mL蒸餾水，煉苗3~5d后除去培養(yǎng)基，將幼苗移栽到溫室的營養(yǎng)土中，澆水，得到生根苗。
[0010]其中，蔗糖的濃度不能太高，也不能太低，過高或過低都不利于桂花莖尖的萌發(fā)。在培養(yǎng)基中，通過使用不同組合植物激素進行處理，可以調節(jié)培養(yǎng)物的生長發(fā)育進程、分化方向和器官發(fā)生。本發(fā)明中，若不使用植物激素，莖尖在體外是不可能萌發(fā)的。但是，莖尖的萌發(fā)率與植物激素的濃度之間存在一個拋物線關系，即植物激素在某個濃度下時莖尖的萌發(fā)率最高，大于或等于這個濃度萌發(fā)率都小于該最高的萌發(fā)率。這說明細胞分裂素和生長素只有達到一定的濃度比才能起到良好的效果。本發(fā)明中，初代培養(yǎng)最適合的培養(yǎng)基是B5+ 2.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7g/L的瓊脂粉，莖尖的萌發(fā)率可達到86.7%。
[0011]作為本發(fā)明桂花組織的培養(yǎng)方法的一種改進，第一步所述消毒滅菌處理是指先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖2~4遍，再在自來水下沖洗I~2h，然后移入超凈工作臺，用
0.1%的HgCl2進行消毒處理2~3min (優(yōu)選為2.5min,時間低于2.5min時污染率增加，高于2.5min時存活率減小)，最后用無菌水沖洗4_6次。
[0012]作為本發(fā)明桂花組織的培養(yǎng)方法的一種改進，第二步中，鑷子采用I~1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
[0013]作為本發(fā)明桂花組織的培養(yǎng)方法的一種改進，第二步中，接種前，先對含有初代培養(yǎng)基的三角瓶采用I~1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
[0014]相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點:經(jīng)統(tǒng)計，采用本發(fā)明的方法，桂花從一個莖尖到成苗移栽，只需要四個月左右的時間，這一時間優(yōu)勢是其它繁殖手段不能比擬的。另外本發(fā)明用到的藥品價格相對低廉，從而在很大程度上縮減了生產(chǎn)成本。
【具體實施方式】
[0015]以下結合具體的實施例來對本發(fā)明的內容進一步說明，但是本發(fā)明的保護范圍并不僅僅局限于實施例所描述的內容。
[0016]實施例1
本實施例提供的一種桂花組織的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理:先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖3遍，再在自來水下沖洗1.5h，然后移入超凈工作臺，用0.1%的HgCl2進行消毒處理2min,最后用無菌水沖洗5次。
[0017]第二步,初代培養(yǎng),取消毒后的桂花嫩枝莖尖,先用消毒后的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，其中的鑷子采用1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min。再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm，接種前，先對含有初代培養(yǎng)基的三角瓶采用1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min，然后將該I~2mm的莖尖接種于含有初代培養(yǎng)基的三角瓶中，所述初代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上3%的蔗糖、7g/L的瓊脂粉、3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.05mg/L的生長素NAA，所述初代培養(yǎng)基的pH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為18001x，光照時間為13h/d，培養(yǎng)30d ；15d時檢查存活率和污染率，分別為88.9%和11.1%。30d時檢查萌發(fā)率，為86.7%。
[0018]第三步，繼代培養(yǎng)，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養(yǎng)基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上3%的蔗糖、2.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.05mg/L的生長素NAA，所述繼代培養(yǎng)基的pH為
5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為20001x，光照時間為13h/d，培養(yǎng)30d，統(tǒng)計增殖系數(shù)，為 2.08。
[0019]第四步，將繼代培養(yǎng)后得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為基本的1/2MS培養(yǎng)基加上2.0mg/L的生長素NAA，培養(yǎng)溫度為25 ±2°C，光照強度為12001x，光照時間為Oh/d，即進行全黑處理，培養(yǎng)40d，統(tǒng)計生根率，為88%。
[0020]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入IOmL蒸餾水，煉苗4d后除去培養(yǎng)基，將幼苗移栽到溫室的營養(yǎng)土中，第一澆透水，前3天每天向葉片上噴水5次，后幾天逐漸減少噴水次數(shù)，并觀察生長情況，15d后統(tǒng)計，成活率為82%。
[0021]實施例2
本實施例提供的 一種桂花組織的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取 健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理:先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖2遍，再在自來水下沖洗2h，然后移入超凈工作臺，用0.1%的HgCl2進行消毒處理2.5min,最后用無菌水沖洗4次。
[0022]第二步,初代培養(yǎng),取消毒后的桂花嫩枝莖尖,先用消毒后的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，其中的鑷子采用lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min。再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm,接種前,先對含有初代培養(yǎng)基的三角瓶采用lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min，然后將該I~2mm的莖尖接種于含有初代培養(yǎng)基的三角瓶中，所述初代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上2%的蔗糖、9g/L的瓊脂粉、2.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.03mg/L的生長素NAA，所述初代培養(yǎng)基的pH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為20001x，光照時間為12h/d，培養(yǎng)28d ；15d時檢查存活率和污染率，分別為95.6%和O。28d時檢查萌發(fā)率，為 71.1%。
[0023]第三步，繼代培養(yǎng)，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養(yǎng)基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上2%的蔗糖、3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.03mg/L的生長素NAA，所述繼代培養(yǎng)基的pH為
5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為25001x，光照時間為12h/d，培養(yǎng)35d，統(tǒng)計增殖系數(shù)，為 2.01。
[0024]第四步，將繼代培養(yǎng)后得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為基本的1/2MS培養(yǎng)基加上3.0mg/L的生長素NAA，培養(yǎng)溫度為25 ±2°C，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，光照時間為2h/d，培養(yǎng)45d，統(tǒng)計生根率，為50%。
[0025]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入15mL蒸餾水，煉苗3d后除去培養(yǎng)基，將幼苗移栽到溫室的營養(yǎng)土中，第一澆透水，前3天每天向葉片上噴水5次，后幾天逐漸減少噴水次數(shù)，并觀察生長情況，15d后統(tǒng)計，成活率為78%。
[0026]實施例3
本實施例提供的一種桂花組織的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理:先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖4遍，再在自來水下沖洗lh，然后移入超凈工作臺，用0.1%的HgCl2進行消毒處理3min,最后用無菌水沖洗6次。
[0027]第二步,初代培養(yǎng),取消毒后的桂花嫩枝莖尖,先用消毒后的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，其中的鑷子采用1.05kg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌17min。再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm，接種前，先對含有初代培養(yǎng)基的三角瓶采用1.05kg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌17min，然后將該I~2mm的莖尖接種于含有初代培養(yǎng)基的三角瓶中，所述初代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上4%的蔗糖、9g/L的瓊脂粉、4.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.1mg/L的生長素NAA，所述初代培養(yǎng)基的pH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為15001x，光照時間為14h/d，培養(yǎng)32d ；15d時檢查存活率和污染率，分別為68.9%和O。32d時檢查萌發(fā)率，為72.5%。
[0028]第三步，繼代培養(yǎng)，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養(yǎng)基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上4%的蔗糖、1.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.lmg/L的生長素NAA，所述繼代培養(yǎng)基的pH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為22001x，光照時間為14h/d，培養(yǎng)25d，統(tǒng)計增殖系數(shù)，為 1.92。
[0029]第四步，將繼代培養(yǎng)后得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為基本的1/2MS培養(yǎng)基加上1.0mg/L的生長素NAA，培養(yǎng)溫度為25 ±2°C，光照強度為15001x，光照時間為4h/d，培養(yǎng)35d，統(tǒng)計生根率，為44%。
[0030]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入15mL蒸餾水，煉苗6d后除去培養(yǎng)基，將幼苗移栽到溫室的營養(yǎng)土中，第一澆透水，前3天每天向葉片上噴水5次，后幾天逐漸減少噴水次數(shù)，并觀察生長情況，15d后統(tǒng)計，成活率為75%。
[0031]需要說明的是，根據(jù)上述說明書的揭示和闡述，本發(fā)明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的【具體實施方式】，對本發(fā)明的一些等同修改和變更也應當在本發(fā)明的權利要求的保護范圍內。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構成任何限制。
【權利要求】
1.一種桂花組織的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理； 第二步，初代培養(yǎng)，取消毒后的桂花嫩枝莖尖，先用消毒后的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，再用解剖刀將該莖尖截成1~2mm，接種于含有初代培養(yǎng)基的三角瓶中，所述初代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上2~4%的蔗糖、5~9g/L的瓊脂粉、1.0~5.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA，所述初代培養(yǎng)基的pH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為1500~20001x，光照時間為12~14h/d，培養(yǎng)25~35d ； 第三步，繼代培養(yǎng)，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~1cm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養(yǎng)基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養(yǎng)基為基本的B5培養(yǎng)基加上2~4%的鹿糖、1.0~3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA,所述繼代培養(yǎng)基的pH為5.8，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為2000~25001x，光照時間為12~14h/d，培養(yǎng)25~35d ； 第四步，將繼代培養(yǎng)后得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為基本的1/2MS培養(yǎng)基加上1.0~3.0mg/L的生長素NAA，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度為1000~15001x，光照時間為O~4h/d，培養(yǎng)35~45d ； 第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入5~15mL蒸餾水，煉苗3~5d后除去培養(yǎng)基，將幼苗移栽到溫室的營養(yǎng)土中，澆水，得到生根苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的桂花組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:第一步所述消毒滅菌處理是指先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖2~4遍，再在自來水下沖洗1~2h，然后移入超凈工作臺，用0.1%的HgCl2進行消毒處理2~3min,最后用無菌水沖洗4_6次。
3.根據(jù)權利要求1所述的桂花組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:第二步中，鑷子采用I~1.1 kg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
4.根據(jù)權利要求3所述的桂花組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:第二步中，接種前，先對含有初代培養(yǎng)基的三角瓶采用1~1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
【文檔編號】A01H4/00GK103798147SQ201410079651
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權日:2014年3月6日
【發(fā)明者】劉秀紅 申請人:梅州市狀元紅生態(tài)發(fā)展有限公司