來源于辣椒疫霉的效應(yīng)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于辣椒疫霉的效應(yīng)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列1的第19-476位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（c）將（a）或（b）所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有效應(yīng)子功能的蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)有效地參與了辣椒疫霉侵染辣椒寄主過程及其誘導(dǎo)植物組織細胞死亡乃至使受害部位產(chǎn)生明顯壞死癥狀的功能。本發(fā)明對于充實植物病原卵菌與寄主互作的分子機制資料信息，以及建立卵菌病害的綜合防治技術(shù)策略都有重要意義。
【專利說明】來源于辣椒疫霉的效應(yīng)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種來源于辣椒疫霉的效應(yīng)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]效應(yīng)子蛋白(effector)是病原物在侵入寄主過程中產(chǎn)生的一類能夠克服寄主防御系統(tǒng)的分子。在侵染過程中，病原物以效應(yīng)子蛋白攻克寄主的防御系統(tǒng)，一方面能夠減弱寄主的抵抗力便于其成功侵入，另一方面還能夠利用寄主的養(yǎng)分用于自身繁殖。許多病原物都能分泌效應(yīng)子蛋白，比如細菌、真菌、卵菌及線蟲中都發(fā)現(xiàn)了此類蛋白。病原物中存在多類效應(yīng)子，包括1?4^，081?斤，5(^，糖類水解酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶以及酯酶等。其中NLP蛋白基因在卵菌、真菌、細菌中普遍存在。該類基因在細菌真菌基因組內(nèi)數(shù)量較少，而在卵菌基因組中數(shù)量眾多，多以基因家族形式存在。據(jù)分析該類蛋白在進化關(guān)系很遠的物種之間均有分布并且同屬種病原菌的NLP基因數(shù)量及結(jié)構(gòu)特性也存在很大差別，由此推理NLP蛋白功能具多樣性特點。不同物種的NLP效應(yīng)子蛋白氨基酸序列高度保守，中間部分具GHRHDffE基序，序列長度在600-800bp之間，編碼氨基酸長度一般為300多個氨基酸。據(jù)報道多種植物受NLP蛋白處理后表現(xiàn)為乙烯產(chǎn)生，MAP激酶活化，植保素合成，PR基因誘導(dǎo)表達，胞質(zhì)Ca2+釋放以及多種雙子葉植物的葉片過敏反應(yīng)等。然而也有報道指明NLP蛋白是植物的感病因子，可誘導(dǎo)植物抗逆基因表達。例如棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)效應(yīng)子基因的表達產(chǎn)物能使棉花、煙草、擬南芥葉片萎蔫，說明效應(yīng)子是棉花與病原物互作過程中重要的誘導(dǎo)因子。但是對兩種細菌Erwinia carotovora subsp.Carotovora和E.carotovora subsp.atroseptica的效應(yīng)子蛋白研究發(fā)現(xiàn),將菌體內(nèi)效應(yīng)子基因敲除后，菌體對馬鈴薯的侵染毒性大大下降。盡管目前研究了這類蛋白對植物的過敏反應(yīng)，但是該類蛋白的功能及在植物中的作用模式還是未知的，更沒有足夠的證據(jù)說明卵菌中效應(yīng)子蛋白是否對疫霉毒性起到重要作用。
[0003]辣椒疫霉(Phytophthora capsici)屬于卵菌綱，是一類區(qū)別于真菌的真核生物。除了引起辣椒疫病還能夠引起多種茄`科及葫蘆科植物疫病。辣椒疫病是一種土傳植物病害，在世界范圍內(nèi)都有分布，且發(fā)病快流行廣，易造成嚴(yán)重損失。傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑大量使用不僅使病原物產(chǎn)生了藥物抗性，而且造成的農(nóng)藥殘留更是嚴(yán)重威脅著人類的生存環(huán)境。因此開展與致病性變異相關(guān)的基因功能分析及其關(guān)鍵基因的研究，對于充實植物病原卵菌與寄主互作的分子機制資料信息，以及建立卵菌病害的綜合防治技術(shù)策略都有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種來源于辣椒疫霉的效應(yīng)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的效應(yīng)子蛋白，具體來源于致病性辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株phycl2,名稱為Phcnlpl,具體為如下Ca)或(b)或(C):
[0006](a)由序列表中序列I的第19-476位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；[0007](b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008](c)將(a)或(b)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有效應(yīng)子功能的蛋白質(zhì)。
[0009]為了便于Phcnlpl蛋白的純化，可在由序列表中序列I的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[0010]表:標(biāo)簽的序列
[0011]
【權(quán)利要求】
1.蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)或(C): Ca)由序列表中序列I的第19-476位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (c)將(a)或(b)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有效應(yīng)子功能的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因；所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)序列表中序列2的第55-1428位所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體。`
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于:所述重組表達載體中，啟動所述基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子為35S啟動子。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述的核酸分子，或權(quán)利要求4-6中任一所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在如下任一中的應(yīng)用: (al)誘導(dǎo)植物組織細胞死亡； (a2)制備用于誘導(dǎo)植物組織細胞死亡的產(chǎn)品。
8.一種用于誘導(dǎo)植物組織細胞死亡的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述的核酸分子，或權(quán)利要求4-6中任一所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述雙子葉植物為煙草。
【文檔編號】A01H5/00GK103724408SQ201410000976
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】馮寶珍, 李培謙 申請人:運城學(xué)院