一種利用全基因組選擇和性控胚胎技術(shù)培育優(yōu)良種公牛的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種采用全基因組選擇和性控胚胎技術(shù)快速定向培育優(yōu)良種公牛的方法，是通過(guò)運(yùn)用全基因組選擇、DHI測(cè)定技術(shù)和后裔測(cè)定技術(shù)選擇優(yōu)秀母牛和公牛分別作為卵母細(xì)胞和精液的供體，通過(guò)超數(shù)排卵、人工授精和胚胎收集過(guò)程從而獲得大量具有相似遺傳背景的優(yōu)秀胚胎，再通過(guò)體外胚胎性別鑒定技術(shù)獲得胚胎的性別特征，選擇雄性胚胎進(jìn)行胚胎移植、基因組育種值測(cè)定、CPI綜合育種值測(cè)定和性狀關(guān)聯(lián)性分析，實(shí)現(xiàn)種公牛的快速繁育和定向培育。
【專利說(shuō)明】一種利用全基因組選擇和性控胚胎技術(shù)培育優(yōu)良種公牛的方法【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種采用全基因組選擇和性控胚胎技術(shù)快速定向培育優(yōu)良種公牛的方法，屬于生物與新醫(yī)藥領(lǐng)域，具體方向是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]基因組選擇(Genomic Selection, GS)技術(shù)是一種基于常規(guī)奶牛遺傳評(píng)估體系驗(yàn)證的資源群體，利用芯片技術(shù)采集資源群體高密度基因組SNP標(biāo)記的分型結(jié)果，以性狀育種值構(gòu)建基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，估計(jì)各個(gè)SNP標(biāo)記活單倍片段基因型的效應(yīng)值的新的分子育種技術(shù)。 它與傳統(tǒng)的種公牛育種技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)在于可以測(cè)定性成熟前的青年個(gè)體，估計(jì)青年個(gè)體的基因組育種值，實(shí)現(xiàn)青年個(gè)體遺傳素質(zhì)的早期預(yù)測(cè)與選擇，顯著縮短育種年限。[0003]性控胚胎技術(shù)是性控技術(shù)的重要組成部分。性控技術(shù)是指通過(guò)人為干預(yù)，使動(dòng)物繁育按照人們所希望的性別繁殖后代的技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化階段，應(yīng)用于牛、 豬、馬等哺乳動(dòng)物。性控技術(shù)利用精子分離技術(shù)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行受精，人為控制性別。目前，在奶牛的育種和繁殖領(lǐng)域，性控技術(shù)的產(chǎn)品主要包括性控精液和性控胚胎。性控精液的生產(chǎn)已完全產(chǎn)業(yè)化和商品化，國(guó)內(nèi)外多數(shù)奶牛育種單位和奶牛場(chǎng)均實(shí)現(xiàn)性控凍精的推廣應(yīng)用。性控胚胎由于自身技術(shù)復(fù)雜和成本高昂，目前在奶牛場(chǎng)推廣應(yīng)用范圍相對(duì)較小。但性控胚胎技術(shù)若應(yīng)用于種質(zhì)奶牛的培育，尤其是種公牛的培育，將具有很大的優(yōu)越性。一方面，通過(guò)超數(shù)排卵，可以最大限度地實(shí)現(xiàn)對(duì)極少數(shù)頂級(jí)母牛遺傳資源的充分利用。另一方面，性控胚胎可實(shí)現(xiàn)對(duì)后代的性別控制，可以根據(jù)育種需要選擇優(yōu)良遺傳背景的雌性或雄性胚胎，人為控制擴(kuò)繁育種核心群或培育優(yōu)良種公牛。[0004]本發(fā)明是將基因組選擇技術(shù)與性控胚胎技術(shù)相結(jié)合形成的一套培育優(yōu)良種公牛的新方法體系。該方法具有以下特點(diǎn):(I)實(shí)現(xiàn)育種的早期性別控制；(2)后代具有可靠的生產(chǎn)性能和遺傳基因背景；(3) —次可獲得多個(gè)同性別的同胞后代，利于提高公牛遺傳評(píng)估的準(zhǔn)確性；(4)與常規(guī)的后裔測(cè)定技術(shù)相比，實(shí)現(xiàn)單性狀及多性狀的定向、精確育種。常規(guī)的后裔測(cè)定技術(shù)評(píng)估的是性狀基因的表型，由于性狀的多基因控制和基因表型易受環(huán)境因素影響，常存在表型值高的個(gè)體不一定能穩(wěn)定遺傳，表型值低的個(gè)體不一定是遺傳素質(zhì)差等問(wèn)題，很難保證性狀選育的穩(wěn)定性，造成一頭世界頂級(jí)的優(yōu)秀種公牛后代伴隨代次的增加，優(yōu)良性狀逐漸平庸。本發(fā)明致力于在基因型上提高性狀的穩(wěn)定性，理論上只要環(huán)境因素適宜，單性狀或多性狀的遺傳素質(zhì)便能得到穩(wěn)定表達(dá)，相對(duì)提高性狀的遺傳力。(5)實(shí)現(xiàn)批量、快速培育種公牛，擴(kuò)大良種資源的推廣應(yīng)用范圍。每次獲得的數(shù)十枚同胞性控雄性胚胎先進(jìn)行部分移植，剩余的遺傳資源以胚胎的形式可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存，待移植后代的性能得到肯定時(shí)，大量的儲(chǔ)備資源可以進(jìn)行快速推廣利用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明是一種結(jié)合全基因組選 擇和性控胚胎技術(shù)快速定向培育優(yōu)良種公牛的方法。
[0006]該發(fā)明提供的方法是通過(guò)運(yùn)用全基因組選擇技術(shù)、DHI測(cè)定技術(shù)和后裔測(cè)定技術(shù)選擇優(yōu)秀親本，從基因水平和實(shí)際生產(chǎn)水平兩方面保證供體卵母細(xì)胞和精液的遺傳潛質(zhì)，通過(guò)超數(shù)排卵、選配、胚胎體內(nèi)發(fā)育和胚胎沖洗收集獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)胚胎，再經(jīng)過(guò)單模板PCR法，對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定，從而獲得性控胚胎。根據(jù)育種需求移植相應(yīng)的性控胚胎，用于育種核心群建設(shè)或種公牛培育工作。
[0007]其中，所述哺乳動(dòng)物為奶牛，胚胎為奶牛胚胎。
[0008]所述胚胎性別的單模板PCR法鑒定體系和親本的選種方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009]本發(fā)明的方法能實(shí)現(xiàn)快速、批量培育優(yōu)秀種公牛，實(shí)現(xiàn)單性狀及多性狀的定向、精確育種，并能顯著提高后代公牛陽(yáng)性率和種公牛育種穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為授精后沖洗收集到的奶牛胚胎。
[0011]圖2 為胚胎性別鑒定電泳圖。M:分子量marker (lkb DNA ladder) ;1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12:檢測(cè)的胚胎樣品編號(hào)。
[0012]圖3為通過(guò)性控胚胎培育的優(yōu)秀種公牛。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下述實(shí)施例中如無(wú) 特殊說(shuō)明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可以從商業(yè)途徑獲得。
[0014]引物合成和DNA序列測(cè)定由invitrogen公司完成。
[0015]PG購(gòu)于上海計(jì)劃生育研究所。
[0016]FSH購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所。
[0017]RNA提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司。
[0018]Pfu DNA擴(kuò)增酶、克隆載體、膠回收試劑盒購(gòu)于Transgen公司。
[0019]克隆載體購(gòu)于Transgen公司。
[0020]全基因選擇芯片IIIumina,20Ila(LD,6909SNP)和 Illumina,2011b(50K,54609SNP)購(gòu)于 Illumina 公司。
[0021]限制性內(nèi)切酶購(gòu)于Takara公司。
[0022]酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第
三版)》。
[0023]實(shí)施例1，親本供體選擇
[0024]按照一定的育種參數(shù)要求如綜合育種性能在全世界排名前十名，根據(jù)父本的CPI / GCPI育種值、TPI / GTPI育種值和LPI / GLPI育種值，選擇合適的精液供體。母本的選擇根據(jù)母牛的DHI測(cè)定和線性鑒定結(jié)果，選擇頭胎305天產(chǎn)奶量> 12噸，乳蛋白率^3.2%,乳脂肪>3.6%，體型分> 85的高產(chǎn)奶牛，按照育種目標(biāo)側(cè)重點(diǎn)的異同，進(jìn)行單性狀排名，根據(jù)需要選擇排名靠前的若干牛只進(jìn)行全基因組檢測(cè)，根據(jù)基因組檢測(cè)和實(shí)際生產(chǎn)性能選擇優(yōu)秀的個(gè)體，作為卵母細(xì)胞的供體。[0025]實(shí)施例2，制作優(yōu)良性控胚胎[0026](一 )超數(shù)排卵:供體母牛經(jīng)兩次PG同期發(fā)情處理，于第二次同期發(fā)情后9-13天開始超排，于第二次發(fā)情后8-12小時(shí)進(jìn)行人工授精。FSH超排總劑量為8.4-8.8毫克(根據(jù)月齡、體重等確定不同劑量)，連續(xù)肌注4天，每天早晚各一次，劑量依次遞減，超排第三天早晚各肌注PG—次。[0027]( 二)發(fā)情鑒定:發(fā)情鑒定采用外部觀察和直腸觸摸卵泡相結(jié)合，以直腸檢查卵泡發(fā)良程度為主要依據(jù)。直腸觸摸子宮、卵巢，判斷其長(zhǎng)短、粗細(xì)、質(zhì)地。順序是:手戴乳膠手套，涂以滑潤(rùn)劑，五指并攏伸入肛門，清除宿糞后，手掌伸平，掌心向下，在骨盆底的正中有一長(zhǎng)而稍扁的棒狀物為子宮頸。順著子宮頸向前伸進(jìn)，可摸到子宮角間溝，溝的兩旁各有一條向前彎曲的圓筒狀物，是左右子宮角，沿著子宮角大彎向下側(cè)面摸，可摸到扁圓、柔軟而有彈性的卵巢。用手指觸摸卵巢表面的卵泡發(fā)育程度，以確定是否輸精。[0028](三)人工輸精:[0029](I)精液解凍:用長(zhǎng)柄鑷子從貯藏罐中取出細(xì)管后，直接放入38°C _40°C溫水中解凍，全部融化后取出，擦干水，用專用剪刀剪開細(xì)管，套上外套管備用。[0030](2)人工輸精:采用直腸把握輸精法。輸精前應(yīng)先將待配母牛保定于配種架中， 用溫肥皂水將陰門附近的糞便、污物沖洗干凈，然后用溫水沖洗，用衛(wèi)生紙擦干。輸精員將手指甲剪短磨光，手臂套上乳膠手套，涂上一層潤(rùn)滑劑，五指并攏成錐形，插入直腸，排出糞便。隔著直腸壁握住子宮頸管。左手臂稍微下壓，使陰門開張。右手持輸精槍，由陰門緩緩插入，開始先稍向上斜插，避開尿道口，然后再向下平插至子宮頸口，將輸精管前端深入子宮頸口內(nèi)3cm-4cm(約2_3個(gè)皺壁)，將輸精槍稍微后拉即可輸精，輸精后緩慢拔出輸精管 (槍)。[0031](四)胚胎收集[0032]對(duì)配種或授精后的供體母畜，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間就要進(jìn)行胚胎的收集。其具體操作方法是用配制好的沖卵液，借助特制的沖卵裝置，把位于子宮或輸卵管的胚胎沖洗出來(lái)，也稱沖卵。之后，再進(jìn)行胚胎質(zhì)量檢查。沖胚胎的時(shí)間一般在配種或授精后6~7天進(jìn)行，這時(shí)的胚胎已發(fā)育到32細(xì)胞期以上。[0033]沖卵方法為非手術(shù)法，先將沖卵管導(dǎo)入子宮角的適當(dāng)位置，借助沖卵管外層的氣球，固定沖卵管的位置并封閉沖卵部位，防止沖卵液流入生殖道。沖洗時(shí)，先將沖卵液注入子宮角封閉部位，經(jīng)沖洗后再導(dǎo)出，反復(fù)進(jìn)行。[0034]實(shí)施例3，胚胎性別鑒定與凍存[0035]收集到的優(yōu)良胚胎(見附圖1)，分別在顯微操作儀下從胚胎內(nèi)獲取單細(xì)胞標(biāo)本， 放入標(biāo)記好的PCR排管內(nèi)，加入20微升含蛋白激酶K的裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，裂解程序?yàn)樗?55°C，5min,之后水浴95°C，5min。取好標(biāo)本后的胚胎進(jìn)行正常冷凍程序凍存，封存于細(xì)管內(nèi)，最終在液氮里長(zhǎng)期保存待用。[0036]在牛的Y染色體上找到一段性別鑒定片段，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)性別鑒定引物一對(duì)如下:上游引物:5’-ctagctcgagatgttcagagtattgaacgacgatgt-3’，下游引物 1:5’_ga tcgcggccgcttcaatattgaaaataagcac-3’ ),目的片段長(zhǎng)度為 690bp (附圖 2)。[0037]PCR擴(kuò)增條件40個(gè)循環(huán)，退火溫度為65°C，DNA聚合酶為pfu DNA聚合酶，反應(yīng)體系20微升，擴(kuò)增程序詳見pfu DNA聚合酶說(shuō)明書。電泳條件為2%的瓊脂糖凝膠，80U，35min。通過(guò)單細(xì)胞PCR擴(kuò)增法獲得的性別鑒定Y染色體陽(yáng)性率為47.8%，性別鑒定的準(zhǔn)確度為95%。(受單細(xì)胞樣品DNA含量少的條件所限，約有2%的樣品由于假陰性誤判為雌性胚胎)
[0038]通過(guò)對(duì)目的片段的PCR擴(kuò)增、電泳分離、克隆載體連接和測(cè)序，證實(shí)該片段在雄性胚胎細(xì)胞中為陽(yáng)性、雌性胚胎細(xì)胞中為陰性。目的片段回收、質(zhì)粒雙酶切、克隆載體構(gòu)建、PCR擴(kuò)增和電泳等一系列過(guò)程(方法詳見《分子克隆(第三版)》)。
[0039]實(shí)施例4，性控胚胎移植
[0040](一 )受體牛處理
[0041]使用前列腺素(PGF2CI) —次肌注，誘導(dǎo)發(fā)情。給處于情期8~15d且直腸檢查黃體的受體牛一次注射PGF2 α。
[0042]( 二 )發(fā)情觀察
[0043]根據(jù)母牛接受爬跨確認(rèn)為發(fā)情、早、晚各觀察30min發(fā)清情況。對(duì)發(fā)情牛需做直腸檢查，以確認(rèn)卵泡，次日上午或晚上做直腸檢查確定是否排政若在發(fā)情后36h以后排卵的牛不能用作受體牛。
[0044](三)胚胎移植
[0045](I)受體牛檢查:移植前直檢黃體，其直徑在11~15mm以上，黃體的手感性好，質(zhì)地軟而充實(shí)。
[0046](2)受體牛的準(zhǔn)備:將受體牛保定，清除糞便，肌注2%靜松靈Iml或用2%的普魯卡因3ml在I~2尾椎間硬膜外麻醉。清洗外陰，用高錳酸鉀水沖洗消毒，用滅菌紙擦干，最后經(jīng)酒精棉球消毒。
[0047](3)器械準(zhǔn)備:先將移植槍、搶頭及金屬保護(hù)外套消毒。
[0048](4)胚胎解凍:胚胎細(xì)管從液氮內(nèi)環(huán)狀保護(hù)外套內(nèi)取出后，空氣中停留5秒鐘，放置在35-38°C溫水內(nèi)水浴20秒。用紙擦干細(xì)管以便于抓牢細(xì)管從而將插頭從細(xì)管上擰下。保留標(biāo)簽用于識(shí)別胚胎信息。胚胎細(xì)管放入移植槍內(nèi)，戴好外套。
[0049](5)胚胎移植術(shù)者用左手扒開外陰，右手持移植器插入陰道，然后左手伸進(jìn)直腸，移植器到達(dá)子宮頸口時(shí)，右手用力將移植槍捅破外套填片，插入子宮頸。左手在直腸內(nèi)誘導(dǎo)使槍頭輕輕穩(wěn)妥地插入黃體例子宮角至大彎處，持移植器的右手推出胚胎，緩慢旋轉(zhuǎn)地抽出移植槍。
[0050](6)妊娠診斷:采用直腸檢查法，在移植后2個(gè)月開始檢查。
[0051]實(shí)施例5批量定向選育優(yōu)良種公牛
[0052](一 )移植的雄性胚胎，犢牛出生后做好牛號(hào)標(biāo)記和飼養(yǎng)管理。移植性控胚胎58枚，妊娠27頭，成活23頭，均為雄性，性控胚胎的妊娠率達(dá)到46.5%，成活率達(dá)到39.6%。
[0053]( 二)犢牛生長(zhǎng)到6月齡時(shí)，選擇生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良個(gè)體，采血獲取DNA樣品，利用基因組檢測(cè)芯片 Illumina，2011a(LD，6909SNP)或 Illumina，2011b (50K，54609SNP)進(jìn)行基因組檢測(cè)。
[0054](三)按照檢測(cè)結(jié)果對(duì)公牛進(jìn)行排序，在18-24月齡選擇GCPI育種值達(dá)到國(guó)家良種補(bǔ)貼標(biāo)準(zhǔn)的公牛進(jìn)行精液生產(chǎn)，一方面可以提前2-3年實(shí)現(xiàn)凍精的提前銷售，另一方面取少數(shù)凍精進(jìn)行后裔測(cè)定工作，30月齡時(shí)完成體型鑒定工作，5歲時(shí)通過(guò)后裔測(cè)定值，計(jì)算出常規(guī)育種方法獲得的CPI綜合育種值。[0055](四)通過(guò)對(duì)公牛基因組育種值和CPI育種值的關(guān)聯(lián)性分析，確定兩個(gè)育種值之間各性狀變量之間的相關(guān)性，選擇獲取優(yōu)良種公牛(附圖3)。[0056](五)根據(jù)育種需要，選擇育種需求性狀變量相關(guān)系數(shù)最高的胚胎后代組合做為育種突破口，移植大量的備用胚胎資源，同時(shí)引進(jìn)和更新基因型 庫(kù)，從而在5-10年的短時(shí)間內(nèi)形成種公牛穩(wěn)定和定向的選育體系。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明提供一種采用全基因組選擇和性控胚胎技術(shù)快速定向培育優(yōu)良種公牛的方法，是通過(guò)運(yùn)用全基因組選擇、DHI測(cè)定技術(shù)和后裔測(cè)定技術(shù)選擇優(yōu)秀母牛和公牛分別作為卵母細(xì)胞和精液的供體，通過(guò)超數(shù)排卵、人工授精和胚胎收集過(guò)程從而獲得大量具有相似遺傳背景的優(yōu)秀胚胎，再通過(guò)體外胚胎性別鑒定技術(shù)獲得胚胎的性別特征，選擇雄性胚胎進(jìn)行胚胎移植、基因組育種值測(cè)定、CPI綜合育種值測(cè)定和性狀關(guān)聯(lián)性分析，實(shí)現(xiàn)種公牛的快速繁育和定向培育。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于實(shí)現(xiàn)種公牛早期培育的性別控制。采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物方法對(duì)早期胚胎進(jìn)行性別控制，具體方法為:人工受精6-7天后，在體內(nèi)發(fā)育到32細(xì)胞期(桑葚胚)和64細(xì)胞期(囊胚)的胚胎，通過(guò)體內(nèi)沖洗獲得含有大量胚胎的懸液，在無(wú)菌條件下通過(guò)體視顯微鏡收集發(fā)育良好的胚胎，再通過(guò)顯微操作儀從胚胎的胚團(tuán)細(xì)胞內(nèi)吸取I個(gè)細(xì)胞用做分子生物學(xué)檢測(cè)胚胎性別的原料，對(duì)應(yīng)的胚胎編號(hào)后進(jìn)行胚胎的細(xì)管分裝和凍存工作。運(yùn)用單模板PCR法對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于胚胎后代具有來(lái)自生產(chǎn)和遺傳兩方面可靠的遺傳潛質(zhì)。胚胎的父本和(或)母本通過(guò)全基因組檢測(cè)、生產(chǎn)性能測(cè)定、后裔測(cè)定和線性鑒定，實(shí)現(xiàn)了對(duì)親本自身遺傳素質(zhì)和生產(chǎn)性能的雙重肯定，保證胚胎后代具有較高的選育起點(diǎn)。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于提高了公牛遺傳評(píng)估的準(zhǔn)確性。來(lái)自同胞后代的遺傳背景相似，可以通過(guò)同胞公牛之間的橫向?qū)Ρ?，提高良種公牛選育的準(zhǔn)確性。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于實(shí)現(xiàn)種公牛單性狀及多性狀的定向、精確選育。常規(guī)的后裔測(cè)定技術(shù)評(píng)估的是性狀基因的表型，由于性狀的多基因控制和基因表型易受環(huán)境因素影響，常存在表型值高的個(gè)體不一定能穩(wěn)定遺傳，表型值低的個(gè)體不一定是遺傳素質(zhì)差等問(wèn)題，很難保證性狀選育的穩(wěn)定性，造成一頭世界頂級(jí)的優(yōu)秀種公牛后代隨代次的增加，優(yōu)良性狀逐漸平庸。本發(fā)明致力于在基因型上提高性狀的穩(wěn)定性，理論上只要環(huán)境因素適宜，單性狀或多性狀的遺傳素質(zhì)便能得到穩(wěn)定表達(dá)，相對(duì)提高性狀的遺傳力。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于批量培育優(yōu)秀種公牛，擴(kuò)大良種資源的推廣應(yīng)用范圍。每次獲得的幾十枚具有相同親本的性控雄性胚胎只進(jìn)行部分移植，剩余的遺傳資源以胚胎的形式可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存，待移植后代的性能得到肯定時(shí)，大量的儲(chǔ)備資源可以進(jìn)行快速推廣利用。
【文檔編號(hào)】A61D19/04GK103598146SQ201310485054
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】馬毅, 姚強(qiáng), 趙慶彬 申請(qǐng)人:天津市奶牛發(fā)展中心