靶向細(xì)胞器的納米載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了靶向細(xì)胞器的納米載體，包括肽，其用于將生物學(xué)分子例如核酸遞送至非核細(xì)胞器例如線粒體和葉綠體。本發(fā)明還提供了使用這樣的納米載體的用于非核細(xì)胞器的遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【專利說(shuō)明】靶向細(xì)胞器的納米載體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及用于將生物學(xué)分子例如蛋白質(zhì)和核酸遞送至非核細(xì)胞器的組合物和方法。更特別地，本申請(qǐng)描述了用于線粒體和葉綠體的遺傳轉(zhuǎn)化的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]需要可選的農(nóng)業(yè)分子生物技術(shù)對(duì)全球性的重要食物和工業(yè)作物進(jìn)行遺傳改造，以滿足對(duì)于這些可再生資源的世界性的需求。不幸的是，對(duì)于大多數(shù)被開(kāi)發(fā)用于操作哺乳動(dòng)物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法來(lái)說(shuō)，植物是難以處理的。然而，肽轉(zhuǎn)染技術(shù)為目前新興的可行的植物轉(zhuǎn)染技術(shù)。
[0003]細(xì)胞穿透肽(CPP)為短的陽(yáng)離子肽，其能夠以不依賴于受體的方式跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)極性親水性化合物例如核酸(Veldhoen, S., Recent Developments inPeptide-Based Nucleic Acid Delivery.1nternational Journal of MolecularSciences (2008)9(7):1276-1320)。這樣的細(xì)胞穿透肽的實(shí)例為 HIV_lTat49-57 (RKKRRQRRR) (Vives，Ε.，P.Brodin，和 B.Lebleu，A Truncated HIV-1Tat Protein BasicDomain Rapidly Translocates through the Plasma Membrane and Accumulates inthe Cell Nucleus.J.Biol .Chem.(1997) 272 (25): 16010-16017 ; Wenderj P.A.,等，Thedesign, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellularuptake:Peptoid molecular transporters.Proceedings of the National Academy of Sciences (2000)97 (24):13003—13008)。
[0004]Tat序列包括堿性氨基酸，其允許Tat跨細(xì)胞的外質(zhì)膜轉(zhuǎn)導(dǎo)其自身和連接的負(fù)荷。由于在其肽序列中存在被稱為核定位信號(hào)(NLS)的亞細(xì)胞定位序列，因此Tat-負(fù)荷復(fù)合物在細(xì)胞的核中聚集(Nagahara，H.，等，Transduction of full-length TATfusion proteins into mammalian cells:TAT-p27KipIinduces cell migration.NatMed(1998) 4(12):1449-1452)。
[0005]在蛋白質(zhì)的N-末端上發(fā)現(xiàn)的這樣的亞細(xì)胞定位序列被總體地稱為蛋白質(zhì)分選信號(hào)序列。各蛋白質(zhì)分選信號(hào)序列為不同的肽序列，其將在細(xì)胞溶質(zhì)中翻譯的初生蛋白質(zhì)靶向至細(xì)胞中的特定的亞細(xì)胞位置。蛋白質(zhì)分選信號(hào)包括靶向核的核定位信號(hào)(NLS)，靶向線粒體的線粒體靶向肽(mTP)，和靶向葉綠體的葉綠體運(yùn)輸肽(cTP)，cTP、mTP和NLS通過(guò)易位機(jī)構(gòu)識(shí)別，其有助于包含這些序列的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)跨雙膜輸送至特定的細(xì)胞器(EmanueIsson, 0.,等，Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP andrelated tools.Nat.Protocols(2007)2(4):953-971)。
[0006]有助于有效的細(xì)胞吸收和線粒體聚集的特定結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)已被應(yīng)用于線粒體治療劑和癌癥藥物的開(kāi)發(fā)。例如，已制備了引入移位親脂性陽(yáng)離子(DLC)的合成月太(Fernandez-Carneado, J.,等,Highly Efficient, Nonpeptidic OligoguanidiniumVectors that Selectively Internalize into Mitochondria, Journal of the AmericanChemical Society (2004) 127 (3): 869-874)。此外，已開(kāi)發(fā)了用于減少由線粒體內(nèi)膜中的活性氧類導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激的可穿透細(xì)胞的抗氧化劑肽(Zhao, K.，等，Cell-permeablePeptide Antioxidants Targeted to Inner Mitochondrial Membrane inhibitMitochondrial Swelling, Oxidative Cell Death, and Reperfusion Injury,J.Biol.Chem.(2004)279(33):34682-34690)。這些肽具有結(jié)構(gòu)模體，其包括交替的賦予抗氧化劑性質(zhì)的合成的芳香殘基和賦予細(xì)胞穿透性質(zhì)的堿性氨基酸。最近，已開(kāi)發(fā)了基于此先前識(shí)別的交替的芳香殘基和堿性殘基的結(jié)構(gòu)模體的線粒體穿透肽(MPP)，并且已將DLC的性質(zhì)引入這些妝之中的特定位置(Horton, K.L.等，Mitochondria-Penetrating Peptides, Chemistry&Biology(2008)15:375-382)。
[0007]某些細(xì)胞器，例如線粒體和葉綠體包含DNA，所述DNA與核基因組不同，其經(jīng)表達(dá)但通常僅繼承自親本之一。線粒體基因通常自母方繼承，且例如在大多數(shù)有花植物中葉綠體并非繼承自父本。由此，這樣的細(xì)胞器已成為遺傳轉(zhuǎn)化的目標(biāo)，特別是在植物中，這是由于任何轉(zhuǎn)化的基因更可能被生物學(xué)地包含于花粉，而非通過(guò)花粉傳播，由此具有較低的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。此外，已將線粒體的機(jī)能障礙與特定的疾病聯(lián)系，直接地施用至線粒體的遺傳治療和其他治療對(duì)于所述疾病可能是有效的治療。
[0008]因此，期望通過(guò)將遺傳物質(zhì)選擇性地引入細(xì)胞器例如線粒體和葉綠體的基因組而將有機(jī)體遺傳轉(zhuǎn)化的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的一個(gè)方面提供了將核酸遞送至細(xì)胞中的非核細(xì)胞器的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體；其中，在存在至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體的情況下，所述至少一種核酸跨細(xì)胞膜移位并且進(jìn)入所述非核細(xì)胞器。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為植物細(xì)胞。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞選自胚性體細(xì)胞、原生質(zhì)體和小孢子。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸為DNA。
[0010]在至少一個(gè)實(shí)施方案中，非核細(xì)胞器為線粒體。根據(jù)這樣的實(shí)施方案，靶向細(xì)胞器的納米載體可以為具有約4至約7的電荷比和約O至約-0.5的親水性的多肽。可選地，在這樣的實(shí)施方案中，靶向細(xì)胞器的納米載體可以為具有選自以下的序列的多肽:
[0011]MFSYLPRYPLRAASARALVRATRPSYRSALLRYQ(SEQ ID NO:1);
[0012]MAAWMRSLFSPLKKLffIRMH(SEQ ID NO:2);
[0013]MKLLffRLILSRKff(SEQ ID NO:3);
[0014]MWffRRSRTNSLRYT(SEQ ID NO:4);和
[0015]MLFRLRRSVRLRGLLA(SEQ ID NO:5)。
[0016]在至少一個(gè)實(shí)施方案中，非核細(xì)胞器為葉綠體。根據(jù)這樣的實(shí)施方案，靶向細(xì)胞器的納米載體可以為具有約2至約4.2的電荷比和約O至約-0.2的親水性的多肽。可選地，在這樣的實(shí)施方案中，靶向細(xì)胞器的納米載體可以為具有選自以下的序列的多肽:
[0017]MGGCVSTPKSCVGAKLR(SEQ ID NO:6);
[0018]MQTLTASSSVSSIQRHRPHPAGRRSSSVTFS(SEQ ID NO:7);
[0019]MKNPPSSFASGFGIR(SEQ ID NO:8);
[0020]MAALIPAIASLPRAQVEKPHPMPVSTRPGLVS(SEQ ID NO:9);和[0021]MSSPPPLFTSCLPASSPSIRRDSTSGSVTSPLR(SEQ ID NO:10)。
[0022]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制造經(jīng)遺傳改造的植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將包含非核細(xì)胞器的植物細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體；其中在存在至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體的情況下，所述至少一種核酸跨所述細(xì)胞的細(xì)胞膜移位并且進(jìn)入所述非核細(xì)胞器，以轉(zhuǎn)染所述非核細(xì)胞器。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞為胚性小孢子。
[0023]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了通過(guò)此處所述的方法制造的經(jīng)遺傳改造的植物細(xì)胞。
[0024]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制造經(jīng)遺傳改造的植物的方法，所述方法包括使包含非核細(xì)胞器的植物細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向細(xì)胞器的納米載 體；其中，在存在所述至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體的情況下，所述至少一種核酸跨所述細(xì)胞的細(xì)胞膜移位并且進(jìn)入所述非核細(xì)胞器，以轉(zhuǎn)染所述非核細(xì)胞器；并且由包含所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的非核細(xì)胞器的植物細(xì)胞生成植物。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞為胚性小孢子。
[0025]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了通過(guò)此處所述的方法制造的經(jīng)遺傳改造的植物。另一個(gè)方面提供了這樣的經(jīng)遺傳改造的植物的種子，所述種子包含如此處所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的非核細(xì)胞器。
[0026]在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了制造經(jīng)遺傳改造的動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括使包含至少一個(gè)線粒體的動(dòng)物細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向線粒體的納米載體；其中，在存在至少一種靶向線粒體的納米載體的情況下，所述至少一種核酸跨所述細(xì)胞的細(xì)胞膜移位并且進(jìn)入所述至少一個(gè)線粒體，以轉(zhuǎn)染所述至少一個(gè)線粒體。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物細(xì)胞為人類細(xì)胞。
[0027]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了通過(guò)此處所述的方法制造的經(jīng)遺傳改造的動(dòng)物細(xì)胞。
[0028]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了靶向線粒體的納米載體，其中所述靶向線粒體的納米載體為具有線粒體靶向肽(mTP)序列，約4至約7的電荷比和約O至約-0.5的親水性的多肽。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽具有選自以下的序列:
[0029]MFSYLPRYPLRAASARALVRATRPSYRSALLRYQ(SEQ ID NO:1);
[0030]MAAWMRSLFSPLKKLffIRMH(SEQ ID NO:2);
[0031]MKLLffRLILSRKff(SEQ ID NO:3);
[0032]MWffRRSRTNSLRYT(SEQ ID NO:4);和
[0033]MLFRLRRSVRLRGLLA(SEQ ID NO:5)。
[0034]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了靶向葉綠體的納米載體，其中所述靶向葉綠體的納米載體為具有葉綠體運(yùn)輸肽(cTP)序列，約2至約4.2的電荷比和約O至約-0.2的親水性的多肽。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽具有選自以下的序列:
[0035]MGGCVSTPKSCVGAKLR(SEQ ID NO:6);
[0036]MQTLTASSSVSSIQRHRPHPAGRRSSSVTFS(SEQ ID NO:7);
[0037]MKNPPSSFASGFGIR(SEQ ID NO:8);
[0038]MAALIPAIASLPRAQVEKPHPMPVSTRPGLVS(SEQ ID NO:9);和
[0039]MSSPPPLFTSCLPASSPSIRRDSTSGSVTSPLR(SEQ ID NO:10)。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]本發(fā)明的這些特征和其他特征將由以下說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求，以及附圖而變得明顯,其中:
[0041]圖1A為黑小麥原生質(zhì)體的橫截面的共聚焦顯微圖像(Nikon),顯示獲自突光素標(biāo)記的 cTPl(SEQ ID NO:6)的熒光；
[0042]圖1B為黑小麥原生質(zhì)體的橫截面的共聚焦顯微圖像(Nikon),顯示獲自突光素標(biāo)記的cTPl(SEQ ID NO:6)的熒光和葉綠體自發(fā)熒光；
[0043]圖2A為黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon),顯示獲自突光素標(biāo)記的mTP3 (SEQ ID NO:3)的熒光；
[0044]圖2B為黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自MitoTraeker?Orange的突光；
[0045]圖2C為黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon),顯示獲自突光素標(biāo)記的mTP3 (SEQ ID NO:3)的熒光和獲自 MitoTrackerw Orange 的熒光；[0046]圖3A為煙草原生質(zhì)體的橫截面的共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示葉綠體自發(fā)熒光;
[0047]圖3B為煙草原生質(zhì)體的橫截面的共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的 mTP3(SEQ ID NO: 3)的熒光；
[0048]圖3C為煙草原生質(zhì)體的橫截面的共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示獲自MitoTracker* Orange 的熒光；
[0049]圖3D為煙草原生質(zhì)體的橫截面的共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示葉綠體自發(fā)熒光、獲自熒光素標(biāo)記的mTP3 (SEQ ID NO:3)的熒光和獲自MitoTracker? Orange的熒光;
[0050]圖4A為煙草原生質(zhì)體的疊加深度共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示葉綠體自發(fā)熒光;
[0051]圖4B為煙草原生質(zhì)體的疊加深度共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的 cTPl(SEQ ID NO:6)的熒光；
[0052]圖4C為煙草原生質(zhì)體的疊加深度共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示獲自MitoTracker* Orange 的突光；
[0053]圖4D為煙草原生質(zhì)體的疊加深度共聚焦顯微圖像(Olympus)，顯示葉綠體自發(fā)熒光、獲自熒光素標(biāo)記的cTP I (SEQ ID NO: 6)的熒光、和獲自MiloTracker? Orange的熒光；
[0054]圖5A為小孢子的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTP3 (SEQ IDNO:3)的熒光；
[0055]圖5B為小孢子的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTP3 (SEQ ID
NO:3)的熒光和獲自MitoTracker? Orange的熒光；
[0056]圖6A為小孢子的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTPl (SEQ IDNO:1)的熒光；[0057]圖6B為小孢子的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自MitoTracker*Orange的突光;
[0058]圖6C為小孢子的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTPl (SEQ IDNO:1)的熒光和獲自MitoTracker:1" Orange的熒光；
[0059]圖7為MDCK (Madin-Darby犬腎)細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTPl (SEQ ID NO:1)的熒光；
[0060]圖8A為MDCK細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTPl (SEQID NO:1)的熒光；
[0061]圖8B為MDCK細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自MitoTracker? Orange的突光；
[0062]圖8C為MDCK細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTPl (SEQID NO:1)的突光和獲自MitoTracker* Orange的突光；
[0063]圖9A為MDCK細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTP5 (SEQID NO:5)的熒光；
[0064]圖9B為MDCK細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自MitoTracker? Orange的突光；
[0065]圖9C為MDCK細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTP5 (SEQID NO: 5)的突光和獲自MitoTracker4+ Orange的突光；
[0066]圖10為MDCK細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自熒光素標(biāo)記的mTP4(SEQID NO:4)的熒光；
[0067]圖11為報(bào)告基因質(zhì)粒pWMaadAGFP的圖譜；
[0068]圖12為報(bào)告基因質(zhì)粒pWCaadAGFP的圖譜；
[0069]圖13A為在存在mTP4(SEQ ID NO:4)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自綠色熒光蛋白(GFP)的熒光；
[0070]圖13B為在存在mTP4(SEQ ID NO:4)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小
麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自GFP和MkoTradcer? Orange兩者的熒光;
[0071]圖13C為在存在mTP4(SEQ ID NO:4)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon),顯示獲自GFP和MitoTracker? Orange兩者的焚光和葉綠體自發(fā)熒光；
[0072]圖14A為在存在mTP2 (SEQ ID NO: 2)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自GFP的熒光；
[0073]圖14B為在存在mTP2 (SEQ ID NO: 2)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon),顯示獲自MitoTracker4+ Orange的突光；
[0074]圖14C為在存在mTP2 (SEQ ID NO: 2)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥原生質(zhì)體的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自GFP和MitoTracker? Orange兩者的突光;
[0075]圖15為在存在mTPl (SEQ ID NO:1)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Caco_2細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自GFP和MitoTracker? Orange兩者的熒光；
[0076]圖16為在存在mTPl (SEQ ID NO:1)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的F1112細(xì)胞的共聚焦顯微圖像(Nikon)，顯示獲自GFP和MitoTracker1" Orange兩者的熒光；
[0077]圖17為顯示通過(guò)mRNA水平的定量實(shí)時(shí)PCR而測(cè)量的在存在mTPl (SEQ ID NO:1),mTP2 (SEQ ID NO: 2)、mTP3 (SEQ ID NO: 3)、mTP4 (SEQ ID NO:4)或 mTP5 (SEQ ID NO:5)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥小孢子中GFP的表達(dá)水平(增加倍數(shù)，平均4次重復(fù))與內(nèi)對(duì)照延伸因子Ia(EFla)的表達(dá)水平(增加倍數(shù))的比較的圖；
[0078]圖18為顯示通過(guò)mRNA水平的定量實(shí)時(shí)PCR而測(cè)量的在存在cTPl (SEQ ID NO:6),cTP2 (SEQ ID NO: 7)、cTP3 (SEQ ID NO: 8)、cTP4 (SEQ ID NO:9)或 cTP5 (SEQ ID NO: 10)的情況下用pWCaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥小孢子中GFP的表達(dá)水平(增加倍數(shù)，平均4次重復(fù))與內(nèi)對(duì)照延伸因子Ia(EFla)的表達(dá)水平(增加倍數(shù))的比較的圖；
[0079]圖19為顯示通過(guò)mRNA水平的定量實(shí)時(shí)PCR而測(cè)量的在存在mTPl (SEQ ID NO:1),mTP2 (SEQ ID NO: 2)、mTP3 (SEQ ID NO: 3)、mTP4 (SEQ ID NO:4)或 mTP5 (SEQ ID NO:5)的情況下用pWMaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥原生質(zhì)體中GFP的表達(dá)水平(增加倍數(shù)，平均4次重復(fù))與內(nèi)對(duì)照延伸因子Ia(EFla)的表達(dá)水平(增加倍數(shù))的比較的圖；且
[0080]圖20為顯示通過(guò)mRNA水平的定量實(shí)時(shí)PCR而測(cè)量的在存在cTPl (SEQ ID NO:6)、cTP2 (SEQ ID NO: 7)、cTP3 (SEQ ID NO: 8)、cTP4 (SEQ ID NO:9)或 cTP5 (SEQ ID NO: 10)的情況下用pWCaadA16GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑小麥原生質(zhì)體中GFP的表達(dá)水平(增加倍數(shù)，平均4次重復(fù))與內(nèi)對(duì)照延伸因子Ia(EFla)的表達(dá)水平(增加倍數(shù))的比較的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0081]本發(fā)明的一個(gè)方面提供了將核酸遞送至細(xì)胞中的非核細(xì)胞器的方法。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為植物細(xì)胞，包括但不限于體細(xì)胞、胚性體細(xì)胞、葉肉原生質(zhì)體和小孢子。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為人類細(xì)胞。
[0082]核酸被遞送至細(xì)胞中的亞細(xì)胞非核細(xì)胞器。期望的靶非核細(xì)胞器為包含內(nèi)源性核酸(包括但不限于基因組DNA)且可以由內(nèi)源性核酸表達(dá)一種或多種基因的那些。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞器為葉綠體。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞器為線粒體。
[0083]將細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體。期望地，核酸可以在非核細(xì)胞器中表達(dá)或可以轉(zhuǎn)化所述非核細(xì)胞器的基因組。核酸可以為RNA或DNA，并且可以為天然存在的核酸或?yàn)槿斯ず怂?。此處使用的術(shù)語(yǔ)“人工核酸”意圖指已經(jīng)人工地或合成地制造或改變的核酸(RNA或DNA)。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，核酸包含DNA。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，核酸包含可在祀非核細(xì)胞器中表達(dá)的一種或多種基因。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，核酸包含質(zhì)粒、人工染色體、或基因構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道適合的核酸，以及選擇和制備這樣的核酸的方法。
[0084]在至少一個(gè)實(shí)施方案中，核酸還包含標(biāo)記基因。此處使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記基因”意圖指當(dāng)被表達(dá)時(shí)編碼其存在可以被檢測(cè)和/或測(cè)量的基因產(chǎn)物的基因。標(biāo)記基因是本領(lǐng)域公知的，并且包括但不限于編碼其存在可以通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)方式檢測(cè)和測(cè)量的蛋白質(zhì)的基因，以及編碼可以通過(guò)它們的物理性質(zhì)檢測(cè)和/或測(cè)量的蛋白質(zhì)的基因。編碼其存在可以通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)方式檢測(cè)和測(cè)量的蛋白質(zhì)的基因包括但不限于編碼酶的基因及類似基因，和其表達(dá)與抗生素抗性有關(guān)的基因。編碼可以通過(guò)它們的物理性質(zhì)檢測(cè)和/或測(cè)量的蛋白質(zhì)的基因包括但不限于編碼可以通過(guò)熒光檢測(cè)的蛋白質(zhì)例如維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea victoria)綠色突光蛋白(GFP)及類似蛋白的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，標(biāo)記基因可以用于選擇穩(wěn)定地表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞。例如，當(dāng)標(biāo)記基因?yàn)榕c對(duì)抗生素的抗性有關(guān)的基因時(shí)，可以通過(guò)在存在對(duì)于不存在所述標(biāo)記基因的表達(dá)的細(xì)胞而言為致死性的量的抗生素的情況下使細(xì)胞生長(zhǎng)而選擇表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞。
[0085]在至少一個(gè)實(shí)施方案中，靶向細(xì)胞器的納米載體為多肽，其能夠靶向一種或多種亞細(xì)胞非核細(xì)胞器。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，納米載體多肽包括N-末端蛋白質(zhì)分選信號(hào)序列。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，納米載體多肽包括N-末端蛋白質(zhì)分選信號(hào)序列，其對(duì)于如上所述的亞細(xì)胞非核細(xì)胞器為特異性的。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，N-末端蛋白質(zhì)分選信號(hào)序列為葉綠體運(yùn)輸肽(cTP)序列。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，N-末端蛋白質(zhì)分選信號(hào)序列為線粒體靶向肽(mTP)序列。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，N-末端蛋白質(zhì)分選信號(hào)序列為在至少一種植物的至少一種蛋白中天然發(fā)現(xiàn)的序列。[0086]不期望受理論的限制，目前認(rèn)為靶向細(xì)胞器的納米載體與非核細(xì)胞器的膜相互作用，從而促進(jìn)核酸進(jìn)入非核細(xì)胞器。靶向細(xì)胞器的納米載體自身可以進(jìn)入或可以不進(jìn)入非核細(xì)胞器，且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解這樣的靶向細(xì)胞器的納米載體自身進(jìn)入非核細(xì)胞器并非為了在存在靶向細(xì)胞器的納米載體的情況下核酸進(jìn)入非核細(xì)胞器的必要條件。
[0087]在至少一個(gè)實(shí)施方案中，靶向細(xì)胞器的納米載體多肽還具有細(xì)胞穿透性質(zhì)。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含不多于100個(gè)氨基酸殘基。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含不多于35個(gè)氨基酸殘基。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含約5至約35個(gè)氨基酸殘基。
[0088]此處使用的關(guān)于多肽的術(shù)語(yǔ)“凈陽(yáng)離子電荷”定義為使用下式在pH7.0下計(jì)算的肽的凈電荷Z:
[0089]
【權(quán)利要求】
1.一種將核酸遞送至細(xì)胞中的非核細(xì)胞器的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體，其中，在存在所述至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體的情況下，所述至少一種核酸跨所述細(xì)胞的細(xì)胞膜移位并且進(jìn)入所述非核細(xì)胞器。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸為DNA。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞為植物細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非核細(xì)胞器為線粒體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述靶向細(xì)胞器的納米載體為具有約4至約7的電荷比和約O至約-0.5的親水性的多肽。
7.如權(quán)利要 求6所述的方法，其中所述靶向細(xì)胞器的納米載體為具有選自以下的序列的多肽:
MFSYLPRYPLRAASARALVRATRPSYRSALLRYQ(SEQ ID NO:1);
MAAWMRSLFSPLKKLffIRMH(SEQ ID NO:2);
MKLLffRLILSRKff(SEQ ID NO:3);
MWffRRSRTNSLRYT(SEQ ID NO:4);和
MLFRLRRSVRLRGLLA(SEQ ID NO:5)。
8.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非核細(xì)胞器是葉綠體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述靶向細(xì)胞器的納米載體為具有約2至約4.2的電荷比和約O至約-0.2的親水性的多肽。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述靶向細(xì)胞器的納米載體為具有選自以下的序列的多肽:
MGGCVSTPKSCVGAKLR(SEQ ID NO:6);
MQTLTASSSVSSIQRHRPHPAGRRSSSVTFS(SEQ ID NO:7);
MKNPPSSFASGFGIR(SEQ ID NO:8);
MAALIPAIASLPRAQVEKPHPMPVSTRPGLVS(SEQ ID NO:9);和
MSSPPPLFTSCLPASSPSIRRDSTSGSVTSPLR(SEQ ID NO:10)。
11.一種制造經(jīng)遺傳改造的植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將包含非核細(xì)胞器的植物細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體，其中，在存在所述至少一種靶向細(xì)胞器的納米載體的情況下，所述至少一種核酸跨所述細(xì)胞的細(xì)胞膜移位并且進(jìn)入所述非核細(xì)胞器，以轉(zhuǎn)染所述非核細(xì)胞器。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物細(xì)胞為胚性小孢子。
13.通過(guò)如權(quán)利要求11或12所述的方法制造的經(jīng)遺傳改造的植物細(xì)胞。
14.一種制造經(jīng)遺傳改造的植物的方法，所述方法包括: 通過(guò)如權(quán)利要求11或12所述的方法制造經(jīng)遺傳改造的植物細(xì)胞；和由所述經(jīng)遺傳改造的植物細(xì)胞產(chǎn)生植物。
15.通過(guò)如權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生的經(jīng)遺傳改造的植物。
16.—種制造經(jīng)遺傳改造的動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括使包含至少一個(gè)線粒體的動(dòng)物細(xì)胞暴露于組合物，所述組合物包含至少一種核酸和至少一種靶向線粒體的納米載體，其中，在存在所述至少一種靶向線粒體的納米載體的情況下，所述至少一種核酸跨所述細(xì)胞的細(xì)胞膜移位并且進(jìn)入所述至少一個(gè)線粒體，以轉(zhuǎn)染所述至少一個(gè)線粒體。
17.—種祀向線粒體的納米載體,其中,所述祀向線粒體的納米載體為具有祀向線粒體的肽序列、約4至約7的電荷比和約O至約-0.5的親水性的多肽。
18.如權(quán)利要求17所述的靶向線粒體的納米載體，其中所述多肽具有選自以下的序列:
MFSYLPRYPLRAASARALVRATRPSYRSALLRYQ(SEQ ID NO:1);
MAAWMRSLFSPLKKLffIRMH(SEQ ID NO:2);
MKLLffRLILSRKff(SEQ ID NO:3);
MWffRRSRTNSLRYT(SEQ ID NO:4);和
MLFRLRRSVRLRGLLA(SEQ ID NO:5)。
19.一種祀向葉綠體的納米載體,其中所述祀向葉綠體的納米載體為具有葉綠體運(yùn)輸肽序列、約2至約4.2的電荷比和約O至約-0.2的親水性的多肽。
20.如權(quán)利要求19所述的靶向葉綠體的納米載體，其中所述多肽具有選自以下的序列:
MGGCVSTPKSCVGAKLR(SEQ ID NO:6);
MQTLTASSSVSSIQRHRPHPAGRRSSSVTFS(SEQ ID NO:7);
MKNPPSSFASGFGIR(SEQ ID NO:8);
MAALIPAIASLPRAQVEKPHPMPVSTRPGLVS(SEQ ID NO:9);和
MSSPPPLFTSCLPASSPSIRRDSTSGSVTSPLR(SEQ ID NO:10)。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK103930552SQ201280038722
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月4日
【發(fā)明者】F·歐德斯, T·麥克米倫 申請(qǐng)人:加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部