靶向grp78基因rna干擾重組慢病毒載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向GRP78基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建、篩選及其用途。本發(fā)明利用RNA干擾技術(shù)，針對(duì)GRP78基因的不同靶序列，構(gòu)建了四個(gè)能在293細(xì)胞中表達(dá)siRNA的慢病毒真核表達(dá)載體，干擾慢病毒是由pLv?GRP78shRNA、pMD2.G和pSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)獲得。本發(fā)明靶向GRP78基因RNA干擾重組慢病毒載體能高效特異性的抑制GRP78基因表達(dá)，可用于制備治腫瘤相關(guān)性基因藥物。
【專利說(shuō)明】
靶向GRP78基因 RNA干擾重組慢病毒載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及革巴向葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 ( glucose regulated protein 78，GRP78) 基因的RNA干擾重組慢病毒載體及其構(gòu)建，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 ( glucose regulated protein 78，GRP78)，又稱免疫球蛋白 重鏈結(jié)合蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成的質(zhì)量控制、Ca2 +穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中扮演著極其重要的 角色。研究表明，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)缺氧、氨基酸剝奪、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、Ca2 +穩(wěn)態(tài)失調(diào)、膽固醇合 成受限等多種異常情況時(shí)，細(xì)胞將啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ERS)反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)異常的生存環(huán)境，而GRP78在ERS通路中扮演重要角色。同時(shí)，GRP78高表 達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，對(duì)于腫瘤細(xì)胞逃離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和承受高負(fù)荷的生存環(huán)境和蛋白質(zhì)合 成的壓力有著重要的作用。既往研究[2-3]表明，腺苷（adenosine)為一種重要的細(xì)胞代謝 產(chǎn)物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞起著誘導(dǎo)凋亡的作用。且GRP78參與此信號(hào)過(guò)程然而，在上述凋亡通 路中GRP78的具體功能，目前尚知之甚少。 RNA干擾技術(shù)能特異性降解mRNA，沉默靶基因，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)，從而可 用來(lái)進(jìn)行基因功能的研究和藥物靶標(biāo)的研究。RNA干擾機(jī)制研究表明，雙鏈RNA分子首先被 細(xì)胞內(nèi)RNA酶Dicer降解成21-23個(gè)喊基大小的小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNAXsiRNA被認(rèn)為是RNA干擾的主要效應(yīng)物。慢病毒載體作為常用的病毒載體之一，其特 點(diǎn)是免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相細(xì)胞，能自身攜帶片段整合入宿主細(xì)胞基因組， 并在哺乳動(dòng)物各類細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)siRNA，長(zhǎng)期抑制基因表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種靶向GRP78基因的RNA干擾重組病毒載體構(gòu)建、篩選及其用途。
[0004] 本發(fā)明以RNA干擾技術(shù)為主，針對(duì)GRP78基因的不同靶序列，構(gòu)建了四個(gè)能在293T 細(xì)胞中表達(dá)siRNA的慢病毒真核表達(dá)載體pLv-GRP78shRNA，該載體是自身失活的慢病毒載 體，其示意圖譜見(jiàn)圖1，能特異性的抑制GRP78基因表達(dá)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種靶向GRP78基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體，是用于腫瘤GRP78基因相關(guān)性治療 性物質(zhì)，慢病毒是由？1^_61^78此1?熟、？102.6和？3?4乂2載體共轉(zhuǎn)染2931'細(xì)胞培養(yǎng)獲得；其 中，所述的pLv_GRP78shRNA重組載體是在plv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中連接雙鏈DNA片段 構(gòu)建而得，酶切位點(diǎn)是BamHI和EcoRI，所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種：

[0006] 根據(jù)本發(fā)明，所述的靶向GRP78基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包 括步驟如下： a. 根據(jù)GRP78 mRNA序列，設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為所述的61^78_ homo-Ul、GRP78-homo_U2、GRP78-homo_U3 及 GRP78-homo_U4 核酸序列中的一種； b. 然后將所述的雙鏈DNA片段連接到plv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建成pLv-GRP78shRNA重組載體； c. 再將所述的pLv-GRP78shRNA重組載體與pMD2. G和pSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)， 得靶向GRP78基因 RNA干擾的重組慢病毒載體系統(tǒng)。
[0007] 為了對(duì)靶向GRP78基因 RNA干擾的重組慢病毒載體對(duì)GRP78基因的抑制效果進(jìn)行鑒 定，將pLv-GRP78shRNA與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá) 水平，篩選出有效干擾質(zhì)粒。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1為實(shí)施例中慢病毒表達(dá)載體plv-shRNA結(jié)果示意圖。
[0009]圖2 GRP78干擾RNA慢病毒載體瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞48h圖片（熒光、可見(jiàn)光）。其中（a)為 普通光鏡(l〇〇X);(b)為熒光光鏡(100X)。
[0010] 圖3不同干擾序列下的GRP78表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0012] 主要材料:293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;大腸桿菌感受態(tài)DH5 α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；慢病毒載體plv-shRNA購(gòu)自Clontech公司，含有人U6 啟動(dòng)子，編碼綠色熒光蛋白報(bào)告基因；各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及Taq DNA聚合 酶均為美國(guó)NEB公司產(chǎn)品；SYBR Green I q RT-PCR Mixs購(gòu)與上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) 公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibico公司。
[0013]實(shí)施例1靶向GRP78基因的慢病毒載體構(gòu)建 1.寡聚核酸的設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)靶向GRP78基因(NM_005347)的4個(gè)干擾序列(見(jiàn)表1)，并合成相應(yīng)的單鏈DNA 表1靶向GRP78基因 RNA干擾序列
shRNA寡核苷酸的3 '末端是TTTTT，作為RNA聚合酶ΙΠ 型啟動(dòng)子U6的終止信號(hào)，其5 '和3 ' 末端分別是BamHI和EcoRI的限制性酶切位點(diǎn)，plv-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了 CTCGAG。 各自單鏈DNA合成片段如下：
[0014] 2.寡聚核酸退火 將合成的寡聚核酸分別用無(wú)酶水溶解，濃度為20μΜ。取相應(yīng)正義鏈和反義鏈溶液，按照 如下配比配制退火反應(yīng)體系
在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理：95°C 5min; 85°C 5min; 75°C 5min; 70 °C5 min; 4。。保存。
[0015] 3.pl-shRNA 載體線性化 取2yg plv-shRNA載體，按照如下體系進(jìn)行酶切處理：
37°C酶切1小時(shí)，1.5%瓊脂糖電泳，使用DNA純化試劑盒回收，核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定 回收質(zhì)量。
[0016] 4.plv-GRP78-shRNA 載體的構(gòu)建 利用T4DNA連接酶，按照如下體系進(jìn)行載體連接反應(yīng)：
20 °C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化質(zhì)大抽桿菌感受態(tài)DH5a，挑選陽(yáng)性克隆送去測(cè)序。本步驟得到的產(chǎn) 物是 plv-GRP78-shRNA。
[0017] 實(shí)施例2 RNA干擾慢病毒瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞 將4種干擾慢病毒質(zhì)粒，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。293T細(xì)胞采用含10%FBS的 高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天消化293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接 種至35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種6 X 105個(gè)細(xì)胞;次日用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基分別配制 鈣轉(zhuǎn)試劑和RNA干擾質(zhì)粒，每84μ1培養(yǎng)基內(nèi)加入16μ1鈣轉(zhuǎn)試劑，每100μΙ培養(yǎng)基內(nèi)加入4yg質(zhì) 粒，分別混勻后將鈣轉(zhuǎn)溶液和質(zhì)粒溶液輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，逐滴加入培養(yǎng)皿內(nèi)，在 37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，更換新鮮的含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集 細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。
[0018] 實(shí)施例3總RNA的提取、CDNA的合成及RNA干擾效應(yīng)的RT-PCR檢測(cè) 分別取lyg RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用熒光定量PCR法檢測(cè)GRP78的表達(dá)水平，以beta-actin 作為內(nèi)參，熒光定量PCR所采用的引物序列見(jiàn)表2,采用2-AACT相對(duì)定量方法計(jì)算不同RNA 干擾序列樣品的GRP78表達(dá)水平。篩選出表達(dá)水平最低的RNA干擾序列。檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖3)表 明U4序列的GRP78基因表達(dá)水平最低，說(shuō)明U4序列的RNA干擾效果最好。
[0019] 表2.GRP78和beta-actin引物探針設(shè)計(jì)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種靶向GRP78基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體，是用于腫瘤GRP78基因相關(guān)治療 性物質(zhì)，干擾慢病毒是由卩1^-61^78此1?熟、?1?2.6和?3?4乂2載體共轉(zhuǎn)染2931'細(xì)胞培養(yǎng)獲得； 其中， 所述的pLv_GRP78shRNA重組載體是在pLv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中連接雙鏈DNA片 段構(gòu)建而得，酶切位點(diǎn)是BamHI和EcoRI;所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種： (1) GRP78-homo_Ul寡核昔酸序列1: 正義鏈： 5. GATCCCTTGTTGGTGGCTCGACTCGACTCGAGTCGAGTCGAGCCACCAACAAGTTTTTG3 ' 反義鏈： 5. AATTCAAAAACTTGTTGGTGGCTCGACTCGACTCGAGTCGAGTCGAGCCACCAACAAGG3 ' (2) GRP78-homo_U2寡核苷酸序列2: 正義鏈：GATCCAGATTCAGCAACTGGTTAAAGCTCGAGCTTTAACCAGTTGCTGAATCTTTTTTG 反義鏈：AATTCAAAAAAGATTCAGCAACTGGTTAAAGCTCGAGCTTTAACCAGTTGCTGAATCTG (3) GRP78-homo_U3寡核苷酸序列3: 正義鏈：GATCCGAAATCGAAAGGATGGTTAATCTCGAGATTAACCATCCTTTCGATTTCTTTTTG 反義鏈：AATTCAAAAAGAAATCGAAAGGATGGTTAATCTCGAGATTAACCATCCTTTCGATTTCG (4) GRP78-homo_S4寡核苷酸序列4: 正義鏈：鏈：GATCCGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG 反義鏈：AATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向GRP78基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法， 包括步驟如下： a. 根據(jù)GRP78 mRNA序列，設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為所述的61^78_ homo-Ul、GRP78-homo_U2、GRP78-homo_U3 及 GRP78-homo_U4 核算序列中的一種； b. 然后將所述的雙鏈DNA片段連接到plv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建成pLv-GRP78shRNA重組載體； c. 再將所述的pLv-GRP78shRNA重組載體與pMD2. G和pSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)， 得靶向GRP78基因 RNA干擾的重組慢病毒載體系統(tǒng)。3. 權(quán)利要求1所述的靶向GRP78基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體在制備治療腫瘤相關(guān) 性基因藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/713GK105936917SQ201610254023
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年4月23日
【發(fā)明人】郭佳, 蔣明, 于麗華, 蔣韻, 徐月
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院