專利名稱：一種金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA及其編碼基因和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA及其編碼基因和應用。
背景技術(shù)：
隨著礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用、工業(yè)發(fā)展，重金屬對環(huán)境造成的污染日趨嚴重，土壤重金屬污染已經(jīng)成為一個危害全球環(huán)境質(zhì)量的問題。土壤重金屬會影響植物的生長發(fā)育，降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。此外，受土壤重金屬污染的作物在植物體中積累，并通過食物鏈富集到人體和動物體中，危害人畜健康，引發(fā)癌癥和其他疾病等。治理重金屬污染刻不容緩，各種修復技術(shù)和措施正在研究和應用中。各國政府和科學家著力通過兩個途徑解決這一問題一為利用物理的，化學的方法試圖清除土壤或水體的重金屬污染二為利用現(xiàn)代生物技術(shù)清除污染。自從20世紀80年代以來，生物修復技術(shù)因其具有處理費用低、對環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點，越來越受到廣大科技人員的廣泛關(guān)注。生物修復一般分為植物修復、動物修復和微生物修復三種類型，其中植物修復和微生物修復是研究的熱點。微生物修復就是利用微生物將環(huán)境中的污染物降解或轉(zhuǎn)化為其他無害物質(zhì)的過程。近年來，基于微生物對重金屬的作用機理，以修復有毒有害金屬污染或回收有經(jīng)濟價值重金屬為目的的生物處理技術(shù)日趨成熟。植物修復指利用植物去治理水體、土壤和底泥等介質(zhì)中的污染的技術(shù)。然而用于重金屬污染修復的生物往往會受到重金屬的毒害，生長緩慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金屬對植物和微生物的毒害作用是生物修復的主要限制因素。解決生物修復中重金屬對生物的毒害作用的根本途徑在于研究耐受重金屬的分子生物學機制，克隆對重金屬耐受的關(guān)鍵基因，通過基因工程手段獲得用于生物修復中性能優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因工程生物。由于技術(shù)上的原因，直到最近，對微生物基因資源的利用主要局限于可培養(yǎng)微生物。然而，已培養(yǎng)微生物僅占自然界中微生物的不到1%，因此各種生境中的微生物宏基因組是一個巨大而未發(fā)掘的基因資源庫。極端環(huán)境具有豐富的微生物資源，當中許多與逆境和關(guān)鍵生命過程相關(guān)的基因在長期的適應進化中獲得了更強的耐性潛能，發(fā)掘這些抗性基因已成為國際重要的研究熱點。酸性礦山廢水(AMD)是極端生境微生物學研究的重要系統(tǒng)。 AMD來源于采礦活動使含硫礦物(主要為黃鐵礦，F(xiàn)eS2)暴露于空氣和水中，在微生物催化作用下迅速氧化產(chǎn)酸所致，其PH值一般在廣4左右，而且富含硫酸鹽以及Pb、Zn、Cu、Cd和 Ni等重金屬，是采礦業(yè)面臨的最嚴重環(huán)境問題之一。在AMD中生存的原核微生物在長期的進化過程中逐漸形成了一些獨特機制，以應對低PH值、高鹽度以及高重金屬等多種極端環(huán)境協(xié)迫。因此，AMD生境成為極具特色和豐富的抗逆基因庫。鎘是一種有毒的重金屬元素，同時也是一種強烈的致癌物。能直接和間接造成遺傳毒性，引起DNA鏈的斷裂、DNA-蛋白交聯(lián)、氧化DNA損傷和染色體畸形等，其中鎘造成的 DNA損傷作用，目前受到廣泛關(guān)注，而損傷后的DNA無法及時修復，則可能引成正常細胞向癌細胞演變，這可能是鎘致癌的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，鎘對DNA的毒害作用是通過抑制DNA 修復系統(tǒng)的活性而實現(xiàn)的。細胞DNA受到損傷后，為了確保細胞精確的傳遞基因組給子代細胞，在長期的進化過程中，細胞發(fā)展出了一套保證細胞周期中DNA復制和染色體分配的檢查機制，通常稱為細胞周期檢查點。細胞周期的檢查點反應是一種細胞對于DNA受到損傷后，細胞周期阻滯從而使細胞獲得修復并存活的一個重要的機制。細胞檢查點反應能減少由于細胞DNA損傷而引起基因突變和染色體畸形的可能性，這是一類負反饋調(diào)節(jié)機制。當細胞周期進程中出現(xiàn)異常變化，如DNA損傷或DNA復制受阻時，這類調(diào)節(jié)機制就被激活，及時地中斷細胞周期的運行，待細胞修復或排除了故障后，細胞周期才能恢復運轉(zhuǎn)。DNA損傷修復包括光修復和暗修復兩種。暗修復涉及到UvrA、UvrB,UvrC和UvrD 四種蛋白質(zhì)的聯(lián)合作用。修復過程UvrA以二聚體形式結(jié)合DNA，并且吸引UvrB結(jié)合成為 UvrA2B復合體，UvrA2B憑借其解旋酶活性和ATP提供的能量沿DNA巡視。在前進過程中遇到DNA損傷，解旋不能繼續(xù)進行，而且UvrA2B結(jié)合損傷DNA的能力高于非損傷DNA的能力約千倍，所以能把UvrB定位在損傷位點。抵達損傷位點后，釋放出單體UvrA,而結(jié)合UvrC0 UvrC將DNA損失部位切除，然后在DNA聚合酶I的作用下降切除部位的堿基修復，最后在 DNA連接酶的作用下把斷開的DNA鏈連接起來。UvrA是一個二聚體蛋白，屬于ABC蛋白家庭。UvrA包含兩個ATP結(jié)合域1和II。 信號域I和II插入相應的ATP結(jié)合域。第一個信號域也包含兩個額外的插入位點，一個 UvrB結(jié)合位點，另一個是DNA結(jié)合位點。這兩個ATP酶活化位點，其中一個處于ATP結(jié)合域I和信號域II之間，另一個處于ATP結(jié)合域II和信號域I之間。在這個UvrA蛋白二聚體中還存在三個鋅指結(jié)構(gòu)。然而，迄今為止UvrA基因在微生物中對重金屬鎘抗性究竟起什么作用仍不清楚， 也沒有從AMD微生物中克隆到UvrA基因的報道。有文獻(Cynthia J. Kenyon & Graham C. Walker, Expression of the E. coli uvrA gene is inducible, Nature 289, 808 - 810 (26 February 1981) ；Sancar A., Wharton R. P. , Seltzer S. Identification of the uvrA gene product,(1981) Journal of Molecular Biology, 148 (1)，pp. 45-62.)報道過 UvrA 基因的鑒定和表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種重金屬鎘抗性相關(guān)蛋白 UvrA,即紫外損傷修復核酸酶A (簡稱DbsUvrA)和編碼該酶的核苷酸序列，以及該蛋白和基因的應用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。含有上述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA的生物制劑。該蛋白在治理環(huán)境鎘污染中的應用。編碼上述蛋白UvrA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。上述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白KdpD的編碼基因在治理環(huán)境鎘污染中的應用，如可用于制備能夠治理鎘污染的轉(zhuǎn)基因植物等。
含有上述編碼蛋白UvrA的基因的表達載體，該載體含有上述鎘抗性相關(guān)蛋白 UvrA的編碼基因。所述表達載體優(yōu)選的出發(fā)載體為pED8a，即載體pET28a中插入UvrA的編碼基因的編碼序列。一種基因工程菌，含有上述的表達載體，具體是由該表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌得到的。該基因工程菌在治理環(huán)境鎘污染中的應用，如可以用于制備具有鎘離子抗性的轉(zhuǎn)基因植物或直接投放到環(huán)境鎘污染中。尤其是對于鎘離子濃度在200μΜ以下的環(huán)境治理效果最好。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明首次公開了一種新的重金屬鎘抗性相關(guān)蛋白DbsUvrA及其編碼基因，發(fā)現(xiàn)該蛋白對于(Γ200μΜ濃度的鎘離子都具有良好的抗性，在提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性方面有重大應用價值。


圖1為DbsUvrA在大腸桿菌中的表達時相，M為蛋白分子量標準，1為攜帶空載體 pET28a的BL21 (DE3)菌株的電泳結(jié)果，2 9為攜帶pET28a- DbsUvrA的BL21 (DE3)菌株誘導表達(Γ7小時后的電泳結(jié)果。圖2為表達DbsUvrA的大腸桿菌在不同鎘濃度下培養(yǎng)12小時后的生長情況。圖3為表達DbsUvrA的大腸桿菌在150μΜ鎘脅迫下的生長曲線。
具體實施例方式以下實施例中除有特殊說明外，均為本領(lǐng)域常用實驗試劑及實驗手段。實施例1 DbsUvrA基因全序列的克隆 (一)野外微生物樣品采集
在云浮鉛/鋅礦選取不同酸化階段(PH為2，4，6)的AMD，使用0. 22 Mm的濾膜收集20L AMD里面的細胞。為了保持核酸的完整，保存樣品凍于液氮中二4小時內(nèi)帶回實驗室，并放于-70°C冰箱長期保存。(二)核酸的提取
DNA提取采用SET方法，過程如下向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化30 min后，15，OOOrpm離心15 min后用氯仿抽提2次，用異丙醇沉淀過夜后，75 %乙醇清洗2 次，最后溶于滅菌水中。用Qiagen tip-100柱純化回收基因組DNA，用核酸蛋白分析儀檢測 DNA質(zhì)量及濃度。(三)基因組測序
用 Roche 公司的 GS FLX Titanium General Library Preparation Kit 制備上機樣品。 使用Roche 454 Genome Seqencer FLX測序儀，通過進行測序，用PyrcAayer軟件獲取堿基序列。(四)基因組序列分析
去除低質(zhì)量的測序結(jié)果后，對基因組進行如下分析
序列拼接使用Euler-SR及454公司的GS De Novo Assembler Software進行序列拼接。用N50指數(shù)評價拼接的效果。
基因組注釋將拼接好的微生物的全基因組序列用IMG和SEED系統(tǒng)進行基因組的注釋，發(fā)現(xiàn)新的基因。(五)DbsUvrA基因片段的克隆
通過PCR方法，以從AMD中提取的DNA為模板，根據(jù)基因組測序并拼接得到的基因序列設(shè)計一對引物
DBS19-F: ATGCTACGTATTCGGGGTGC (SEQ ID NO:3); DBS19-R: TCATGGTGTATGGTTGTTGTGG (SEQ ID N0:4)。PCR獲得一條31Λ大小的條帶，并克隆到PCR2. 1 (購自invitrogen公司)載體中， 序列委托invitrogen公司測定。(六)DbsUvrA基因序列分析
測序結(jié)果表明UvrA基因大小為2832bp (如SEQ ID NO: 2)，編碼941個氨基酸(如SEQ ID N0:1)。 實施例2DbsUvrA基因的功能分析
本實施例中利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗分析DbsUvrA基因的功能。(一)構(gòu)建重組表達載體
設(shè)計以下一對引物，在DbsUvrA基因5，引入BamHI酶切位點，3’引入XhoI酶切位點。DbsUvrA -F: 5，CGCGGATCCATGGACACGGTATGTTCAGAAGG3，(SEQ ID NO:5); DbsUvrA -R: 5， CCGCTCGAGTGATCCCTGCATCAACCATTGT3， (SEQ ID NO:6)。以PCR2. 1- DbsUvrA載體為模板進行PCR。分別將PCR產(chǎn)物和酵母穿梭表達載體 pET28a用及和損ο I進行酶切，將酶切產(chǎn)物回收、連接、并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。經(jīng)測序并酶切鑒定，得到了 pET28a- DbsUvrA重組子。(二)蛋白表達
將重組子pET28a- DbsUvrA轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，通過PCR驗證篩選陽性克隆。挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至10ml LB(含Kan 50μ g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。將Iml 菌液加入到含100ml LB培養(yǎng)基(含Kan 50 μ g/ml)，37°C震蕩培養(yǎng)至0D600約為0. 4 1· 0 (最好0.6，大約需》ir)。加入IPTG至終濃度為ImM進行誘導，每隔1小時收集Iml菌液，離心12000gX60s 收獲沉淀，用80μ1 ddH20重懸，加入20μ 1 5XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴 IOmin0取上清作為樣品做SDS-PAGE分析(見附圖1)。(三)轉(zhuǎn)化子對重金屬鎘抗性的測定
挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至10ml LB(含Kan 50 μ g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。將100 μ 1 菌加入到 IOml Cd2+濃度分別為 0μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ 的 LB培養(yǎng)基(含Kan 50 μ g/ ml、IPTG ImM)中，37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)12小時，分別測定0D600值。根據(jù)實驗結(jié)果，選取Cd2+濃度為150μΜ作為脅迫條件，進行了生長曲線的測定。挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至10ml LB (含Kan 50 μ g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。將100μ1菌加入到 IOml Cd2+濃度為 150μΜ 的 LB 培養(yǎng)基(含 Kan 50 μ g/ml, IPTG ImM)中，37°C、200rpm 震蕩培養(yǎng)，每隔2小時測定0D600值。實驗結(jié)果表明，表達DbsUvrA基因的BL21 (DE3)在0 200μΜ Cd2+濃度下都可以正常生長，而空載體對照在Cd2+濃度超過150μΜ時便不能生長(見附圖2)。在150μΜ Cd2+濃度下，表達DbsUvrA基因的BL21(DE!3)在培養(yǎng)過程中都可以生長，而空載體對照的生長一直受到抑制(見附圖3)。實驗結(jié)果說明，DbsUvrA對重金屬鎘的防御起著重要作用。
權(quán)利要求
1.一種金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.權(quán)利要求1所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA在治理環(huán)境鎘污染中的應用。
3.權(quán)利要求1所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA的編碼基因，其特征在于核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
4.權(quán)利要求3所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA的編碼基因在治理環(huán)境鎘污染中的應用。
5.含有權(quán)利要求3所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA的編碼基因的表達載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達載體，其特征在于出發(fā)載體為pET28a。
7.一種基因工程菌，其特征在于含有權(quán)利要求6所述的表達載體。
8.權(quán)利要求7所述基因工程菌在治理環(huán)境鎘污染中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于環(huán)境鎘污染中的鎘離子濃度為200μΜ以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金屬鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA及其編碼基因和應用。該鎘抗性相關(guān)蛋白UvrA氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其編碼基因如SEQIDNO:2所示。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌實驗證明該基因在大腸桿菌中的表達可以提高其對重金屬鎘的抗性。本發(fā)明的UvrA編碼基因可用于提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性，進一步用于清除環(huán)境重金屬污染，為生物修復提供性能優(yōu)良的生物資源。
文檔編號A01H5/00GK102517266SQ20111042667
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者俞陸軍, 廖斌, 束文圣, 胡敏, 謝麗娟, 陳亮 申請人:中山大學