一種高親和力抗重金屬鎘單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種高親和力抗重金屬鎘單克隆抗體 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在自然界中，鎘大多以鎘鹽的形式存在，可與硫、氯、氧等形成無機(jī)化合物。鎘氧化 態(tài)為+1或+2價(jià)，在空氣中容易被氧化，在加熱時(shí)會出現(xiàn)棕色氧化物層；在高溫條件下鎘可 與鹵素發(fā)生劇烈反應(yīng)，產(chǎn)生鹵化鎘；鎘還可與硫直接反應(yīng)，生成有毒且具有致癌作用的黃色 或橙色的硫化鎘。此外，如氧化鎘、溴化鎘、硒化鎘、碘化鎘、氯化鎘、氰化鎘、硝酸鎘等多種 鎘化合物均具有毒性。由于大多數(shù)鎘化物都能溶于水，可經(jīng)由飲用水、食物等途徑通過呼吸 道、消化道、皮膚等途徑被機(jī)體所吸收與蓄積，對人類健康產(chǎn)生非常嚴(yán)重的危害。
[0003]根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國土壤的重金屬污染總體情況非常嚴(yán)重，約有1. 5億畝的耕 地和1200萬噸的糧食被污染，多達(dá)1000萬噸的糧食受到污染，至少造成200億元的經(jīng)濟(jì)損 失。2008年，從廣東、河南、江西等省隨機(jī)抽取63份農(nóng)貿(mào)市場中銷售的大米，有60%以上的 大米其鎘含量超標(biāo)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，廣東省韶關(guān)市大寶山礦自1969年開礦以來造成了 2個(gè)鎮(zhèn)10 個(gè)村土地的重金屬污染，高達(dá)13000多人口受害和10000余畝的稻田遭到污染，由于農(nóng)作物 重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)使當(dāng)?shù)爻蔀槟I結(jié)石、肝癌、皮膚病的高發(fā)區(qū)。重金屬的土壤污染具有不 可逆、長久且毒害性大等特點(diǎn)，但是我國對于土壤的重金屬污染修復(fù)才剛起步，據(jù)統(tǒng)計(jì)，修 復(fù)率還低于3%，形勢相對嚴(yán)峻。而對于鎘等重金屬污染修復(fù)的前提條件是鎘等重金屬污染 的檢測。
[0004] 目前最常用的鎘離子檢測方法是電感耦聯(lián)等離子體質(zhì)譜法，石墨爐原子吸收法 (Graphite Furnace AtomicAbsorption Spectrometry，GFAAS)等儀器檢測方法，這些檢測 方法具有準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備昂貴，同時(shí)需要一定的實(shí) 驗(yàn)場地和專業(yè)儀器操作人員才能進(jìn)行樣品檢測，不適用于市場產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查和產(chǎn)品進(jìn)出 口快速通關(guān)的要求。因此，建立一種快速便捷的重金屬鎘檢測方法對控制食品中的鎘超標(biāo) 情況非常必要。近年來發(fā)展起來的重金屬免疫檢測法（ELISA)(間接競爭Elisa法)，克服 了上述方法的缺點(diǎn)，利用抗原抗體的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)可作為抗原或抗體的污染物的檢測， 該方法檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，目前已成功應(yīng)用于重金屬鎘、汞、鉛以及鋁的檢測。但是， ELISA法也有自身的缺陷，即完成一批試樣的檢測仍至少需要3h，不能達(dá)到快速檢測的要 求；而且抗原或抗體的選擇是非常重要的因素，決定了檢測的特異性和靈敏性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有重金屬鎘離子檢測方法的缺陷和技術(shù)不足， 提供一種高親和力的、特異性識別重金屬鎘的抗重金屬鎘單克隆抗體。利用該抗重金屬鎘 單克隆抗體可以建立檢測重金屬鎘的一步競爭法(直接競爭Elisa)，該檢測方法耗時(shí)短、靈 敏性高，性能可靠，操作簡單。
[0006] 本發(fā)明另一目的是提供所述抗重金屬鎘單克隆抗體的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供一種用于測定重金屬鎘的直接競爭Elisa檢測方法。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一株分泌高親和力抗重金屬鎘單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1H9,該雜交瘤細(xì)胞株1H9 于2015年3月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC C201521，保藏地址 為中國武漢武漢大學(xué)。
[0009] -種高親和力抗重金屬鎘單克隆抗體1H9,由上述雜交瘤細(xì)胞株1H9分泌所得。所 述高親和力是指該單克隆抗體與Cd-EDTA復(fù)合物有高親和力。
[0010] 所述單克隆抗體1H9的可變區(qū)包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；所述重鏈可變區(qū)基 因序列如SEQ ID NO. 1所示，所述輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID N0. 2所示；所述重鏈可變 區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0011] 所述重鏈可變區(qū)由342個(gè)堿基組成，編碼114個(gè)氨基酸，可變區(qū)含有3個(gè)⑶R (互 補(bǔ)決定簇）區(qū)。⑶R1編碼5個(gè)氨基酸，⑶R2編碼17個(gè)氨基酸，⑶R3編碼6個(gè)氨基酸(如附 圖4所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性高達(dá)90. 8%，而3個(gè)CDR區(qū)則是特 異性序列，與其他鼠源性抗體重鏈可變區(qū)CDR區(qū)有差異。
[0012] 所述輕鏈可變區(qū)由336個(gè)堿基組成，編碼112個(gè)氨基酸，可變區(qū)含有3個(gè)⑶R (互 補(bǔ)決定簇）區(qū)。⑶R1編碼16個(gè)氨基酸，⑶R2編碼7個(gè)氨基酸，⑶R3編碼7個(gè)氨基酸(如附 圖5所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性為98%，而3個(gè)CDR區(qū)則為特異性 序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區(qū)CDR區(qū)有差異。
[0013] 上述單克隆抗體1H9的腹水Elisa效價(jià)達(dá)1 X 106。
[0014] 上述單克隆抗體1H9對金屬鎘的檢測靈敏度可達(dá)到2. Ing/mL。
[0015] 上述高親和力抗重金屬鎘單克隆抗體1H9在金屬鎘的檢測方面的應(yīng)用也在本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016] 具體可應(yīng)用于以單克隆抗體1H9為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)檢 測試劑盒。
[0017] 作為一種可實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種金屬鎘的直接競爭Elisa檢測方法，步 驟如下： (1) 包被：將鎘單克隆抗體m9稀釋至工作濃度加入包被板，37°C條件下孵育后，再用 脫脂奶粉和聚乙二醇20000為混合封閉液，37 °C恒溫封閉； (2) 加樣：每孔分別加入待測樣品和酶標(biāo)物Cd-EDTA-HRP，37°C孵育后，進(jìn)行TMB底物顯 色，濃硫酸終止實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行酶標(biāo)儀讀數(shù)測定結(jié)果。
[0018] 更具體地，操作如下： (1) 包被：將制備的鎘單克隆抗體m9稀釋至工作濃度每孔100 yL，37°C條件下孵育3 小時(shí)后用PBST緩沖液洗滌3次，再用5%的脫脂奶粉和2%的聚乙二醇20000為混合封閉液 進(jìn)行37°C恒溫封閉1小時(shí)，PBST緩沖液洗滌3次； (2) 加樣：每孔分別加入50 y L的待測樣品和50 y L工作濃度酶標(biāo)物（Cd-EDTA-HRP) 37°C孵育10min，PBST緩沖液洗滌3次，進(jìn)行TMB底物顯色，分別加A、B液各50 y L，37°C避 光15min，濃硫酸（2M)終止實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行酶標(biāo)儀讀數(shù)測定結(jié)果。
[0019] 本發(fā)明采用直接競爭Elisa檢測方法，通過對抗原合成時(shí)條件的優(yōu)化并嚴(yán)格控制 cd-EDTA與載體蛋白的偶聯(lián)比，并免疫小鼠后，經(jīng)過多次融合，及5次克隆化，篩選獲得多 株穩(wěn)定的單克隆抗體細(xì)胞株，其中雜交瘤細(xì)胞株H19效價(jià)最高，靈敏度最好，且反應(yīng)非常迅 速，并可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測中。
[0020] 雜交瘤細(xì)胞株1H9分泌并純化得到的單克隆抗體1H9具有高靈敏度與高特異性的 特點(diǎn)，而且具有準(zhǔn)確、迅速快捷、安全簡便、試劑穩(wěn)定和成本低廉等特點(diǎn)，可進(jìn)行定量檢測， 特別適用于樣品中鎘的快速篩選。
[0021] 本發(fā)明所述單克隆抗體與其他抗體相比具有高效價(jià)和高親和力，所述抗體可在 lOmin內(nèi)與抗原結(jié)合達(dá)到平衡狀態(tài)，采用測一步法反應(yīng)快速，整個(gè)直接競爭ELISA可在 30min內(nèi)完成，并應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測中。
[0022] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明根據(jù)篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞株m9,表達(dá)純化得到了一種高親和力抗重金屬鎘 單克隆抗體1H9,單克隆抗體1H9克服了現(xiàn)有技術(shù)的瓶頸(現(xiàn)有技術(shù)中高效價(jià)、高特異性單 克隆抗體的制備是制約金屬鎘免疫檢測技術(shù)的瓶頸)，具有高效價(jià)、高特異性、高靈敏性的 特點(diǎn)，使得直接競爭Elisa法用于重金屬鎘的測定成為可能。
[0023] 另外，根據(jù)單克隆抗體1H9建立的直接競爭Elisa檢測方法，很好彌補(bǔ)了 ELISA方 法的時(shí)間缺陷，具有迅速快捷耗時(shí)短、靈敏準(zhǔn)確、性能可靠，操作安全簡便、試劑穩(wěn)定和成本 低廉等特點(diǎn)，可在30min得出結(jié)果，可進(jìn)行定量檢測，其敏感性可達(dá)2. Ing/mL，可實(shí)現(xiàn)樣品 中痕量重金屬鎘的快速篩查，可廣泛用于含重金屬鎘的水溶液樣品的分析測試和實(shí)際樣品 快速篩查。
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