專利名稱：玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆及功能分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種源自玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)， 并能夠在玉米中高水平表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。
背景技術(shù)：
玉米(Zea mays L.)是重要的糧食和飼料作物，在我國各種逆境脅迫每年都引起玉米減產(chǎn)20% -30%。干早、高鹽、低溫等逆境脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要限制因子。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界很多耕地受到鹽害威脅，干早、半干早地區(qū)，而我國有近億人口受到土地過度鹽堿化和荒摸化的威脅。因此，提高植物抗早能力已經(jīng)成為現(xiàn)代植物育種工作急需解決的關(guān)鍵問題之一。為了抵抗外界逆境條件脅迫，植物通過調(diào)節(jié)自身體內(nèi)基因的表達(dá)、生理生化變化來適應(yīng)逆境，增強(qiáng)耐性。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，許多受逆境脅迫的基因被相繼鑒定與克隆。在轉(zhuǎn)基因植物中過表達(dá)能夠提高植株的抗逆性，而啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要因素之一。同時(shí)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠調(diào)控外源基因在特定的生長時(shí)期，逆境條件下表達(dá)， 降低了植物能量的不必要浪費(fèi)。因此，逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在植物抵御逆境脅迫反應(yīng)中的作用越來越受到人們的重視。高等植物基因的表達(dá)調(diào)控已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。深入研究啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能，建立可用于植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)、空、量三維調(diào)控系統(tǒng)，可為功能基因組學(xué)研究及通過基因工程技術(shù)精確地調(diào)節(jié)植物代謝提供全新的思路。選擇適宜的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，已成為植物基因工程研究的熱點(diǎn)問題之一。針對不同的目的基因，人們選用不同的啟動(dòng)子，從而使靶基因在特定組織或條件下選擇性表達(dá)，以利于轉(zhuǎn)基因植物的正常生長發(fā)育(趙恢武等，2000 ；劉強(qiáng)等， 2000)。對植物在干旱逆境下大量表達(dá)的耐旱基因啟動(dòng)子研究表明，不同耐旱基因的啟動(dòng)子往往含有相同的順式作用元件，并受相同的反式作用因子的調(diào)控。這為我們提供了另外一條研究植物耐旱機(jī)制的途徑。國內(nèi)外科學(xué)家利用一些耐旱相關(guān)的特異性啟動(dòng)子(如RD^A)、特異性蛋白(如脫水素)、耐旱相關(guān)的特異性酶(如TPQ基因進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化并獲得了成功，得到一些耐旱品質(zhì)明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株。清華大學(xué)的劉強(qiáng)等000 將來自擬南芥的干旱誘導(dǎo)型基因RD29A的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子轉(zhuǎn)入擬南芥后發(fā)現(xiàn)擬南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世慶O006)通過基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織，經(jīng)過分子生物學(xué)檢測及在PEG脅迫下的 ⑶S組織化學(xué)染色證實(shí)了 RD29A啟動(dòng)子在小麥愈傷組織中能夠誘導(dǎo)⑶S基因的表達(dá)。也有科研工作者直接利用干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)某些耐旱有關(guān)的蛋白表達(dá)進(jìn)行植物耐旱機(jī)理的研究。如利用特異性的啟動(dòng)子啟動(dòng)與耐旱有關(guān)的基因(如脫水素基因等)或特異性的滲透調(diào)節(jié)物合成酶基因在煙草、擬南芥等模式植物體內(nèi)表達(dá)獲得耐旱植株；通常情況下在雙子葉植物中常用的組成型啟動(dòng)子CaM35S啟動(dòng)海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在煙草和擬南芥中均獲得耐旱植株，而用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD^啟動(dòng)TSP (海藻糖-6-磷酸合酶)在煙草中表達(dá)，獲得了較為明顯的耐旱煙草植株。單子葉植物的WDiquitin-promoter有兩部分組成eX0n和intron，其中intron具有增強(qiáng)子的功能。目的基因在其啟動(dòng)下能夠大量穩(wěn)定的在單子葉植物體內(nèi)表達(dá)。浙江大學(xué)郝中娜等000 對水稻0sWRKY19及0sWRKY89基因的啟動(dòng)子進(jìn)行功能研究，表明這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子是組織特異性表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。Brown 等Q010)首次發(fā)現(xiàn)冬小麥bltlOl基因啟動(dòng)子內(nèi)存在高度保守的TCA-Iike元件與誘導(dǎo)目的基因在低溫脅迫下高效表達(dá)密切相關(guān)。Takumi等分離了小麥低溫應(yīng)答基因家族基因WCorl5上游的啟動(dòng)子序列證實(shí)該啟動(dòng)子受低溫和光誘導(dǎo)。利用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗逆基因的高效表達(dá)，從而改良作物的抗逆性成為目前研究的熱點(diǎn)。然而，目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少。因此，對于新的抗逆境相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后啟動(dòng)子研究的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目標(biāo)基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來源于玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子載體，該載體指導(dǎo)在植物中高水平表達(dá)目標(biāo)基因ZmRxol的病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和5'非翻譯區(qū)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物能反映啟動(dòng)子誘導(dǎo)活性的高低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了用于植物轉(zhuǎn)化的載體，所述載體包含帶有ZmRxol基因的5'非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。隨后利用所述載體在玉米中誘導(dǎo)表達(dá)，并觀察到該啟動(dòng)子與病害誘導(dǎo)性相關(guān)的高水平活性。本發(fā)明提供一種獲得的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，包含相對于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至_155bp區(qū)(見序列表)的DNA核苷酸序列，病原菌侵染可以在植物中誘導(dǎo)本發(fā)明所述的啟動(dòng)子的高水平活性。獲得的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列源自玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)。一種克隆得到的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的5'非翻譯區(qū)，包含相對于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+1421bp區(qū)(見序列表)的DNA核苷酸序列，本發(fā)明所述的非翻譯區(qū)能通過增強(qiáng)導(dǎo)入植物中的目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于玉米轉(zhuǎn)化的病害誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體包含玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的 5'非翻譯區(qū)。上述用于玉米轉(zhuǎn)化的病害誘導(dǎo)型載體是指能夠在轉(zhuǎn)基因植物中持久表達(dá)外源基因的二元載體。所述二元載體可以是任何包含T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)的RB (右邊界序列)和 LB (左邊界序列)，能夠在根癌農(nóng)桿菌(Agroba terium tumefaciens) Ti質(zhì)粒存在下轉(zhuǎn)化植物的二元載體。該載體可以是經(jīng)常用于相關(guān)領(lǐng)域的二元載體，例如PCAMBIA1301載體、 PBI121 載體。
一種用于植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，包含玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的5'非翻譯區(qū)。本發(fā)明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。關(guān)于本發(fā)明所述的用于植物的誘導(dǎo)型載體(PCAMBIA1301)，所述的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)在植物表達(dá)載體中位于外源基因的前面。本發(fā)明提供通過插入本發(fā)明所述的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)含有GUS 報(bào)告基因的載體中而構(gòu)建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來代替。本發(fā)明提供一種應(yīng)用病害誘導(dǎo)型二元載體的轉(zhuǎn)基因植物，以及一種應(yīng)用本發(fā)明所述進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的玉米成熟胚。植物能通過使用例如根癌農(nóng)桿菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轟擊方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子二元載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，例如煙草可以用葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提供來自玉米的抗病蛋白基因(ZmRXOl)的病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)使得能夠在植物中進(jìn)行病害誘導(dǎo)型表達(dá)。本發(fā)明的有益效果在于可用于啟動(dòng)抵抗逆境基因的高效表達(dá)，對于玉米抗逆品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究，培育綜合抗性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因新品系具有積極意義。


圖1為玉米(B73)基因組電泳圖
圖2 為 ZmRXOl-pro PCR 電泳圖
圖3為ZmRXOΙ-pro連T載質(zhì)粒提取電泳圖
圖4為ZmRXOΙ-pro連T載酶切鑒定電泳圖
圖5為pCAMBIA 1301: Zm RXOlPro酶切鑒定電泳圖
圖6為植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖
圖7為pCAMBIA 1301: Zm RXOPro轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌PCR鑒定電泳圖
圖8為pCAMBIA 1301: Zm RXOlPro轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取電泳圖
圖9為3 啟動(dòng)子的⑶S檢測照片
圖10為ZmRXOl啟動(dòng)子(未用20% PEG處理)的⑶S檢測照片
圖11為ZmRXOl啟動(dòng)子(用20%的PEG處理Mh)的⑶S檢測照片
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖具體說明實(shí)施例以下的實(shí)施例將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方式
來對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動(dòng)子(啟動(dòng)子序列包含相對于SEQ ID NO=I的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至_155bp區(qū)的DNA核苷酸序列)，在玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的5'非翻譯區(qū)序列中得到鑒定。玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)登錄在NCBI GenBank(登錄號(hào)AY935244. 1)，序列表顯示本發(fā)明上述基因的植物逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)的DNA序列。在圖1中，蛋白合成的起始密碼子ATG帶有下劃線，而且轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基A用+1示出。并用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站分析了啟動(dòng)子的核心元件。啟動(dòng)子分析網(wǎng)站http://WWW. dna. affrc. go. jp/PLACE/ signalscan. html。以玉米基因組DNA (圖1)為模板，擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析， 擴(kuò)增出長度為1576bp的特異條帶(圖2)。電泳后回收目的片段，與pMD 18-T載體連接得到重組質(zhì)粒pMD 18-T: ZmRXOPro，提取質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖幻，酶切驗(yàn)證 (圖4)，并測序。更具體地說，通過PCR擴(kuò)增克隆的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動(dòng)子和1421bp 的5'非翻譯區(qū)(見序列表)，上述PCR所用引物詳細(xì)顯示在表1中。對于PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序94°C 5min ；94°C 45S，56°C 40S，72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；表1:引物
上游引物5' CGGAATTCACAATATCGGTTCCGCTGC 3'SEQ ID NO 2下游引物5' CCCATGGCTTCTTATTCGATCAGAC 3'SEQ ID NO 3實(shí)施例2 植物逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子載體的構(gòu)建將在實(shí)施例1中所克隆的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的啟動(dòng)子和1421bp的5' 非翻譯區(qū)ZmRXOl 見序列表)插入到載體中，從而構(gòu)建植物逆境誘導(dǎo)型載體。具體地說，將植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301及重組質(zhì)粒pMD 18_T: ZmRXOlPro用 EcoRI和NcoI分別進(jìn)行酶切，然后將它們插入載體pCAMBIA1301的EcoRI和NcoI酶切位點(diǎn)。該載體被稱作pCAMBIA 1301::ZmRX01ftx)，用于驅(qū)動(dòng)⑶S基因的表達(dá)，經(jīng)酶切鑒定(圖 5)獲得了啟動(dòng)子片段，與預(yù)期結(jié)果相同。在圖6中，以編碼ρ-葡糖酸醛酶的基因GUS為報(bào)告基因，選擇標(biāo)記為潮霉素抗性基因。此外:35s-pro代表HPTII的啟動(dòng)子，而:35s_ter代表HPTII的終止子，ZmCIPK16Pro 代表⑶S的啟動(dòng)子，而Nos-ter代表⑶S的終止子。實(shí)施例3 鑒定玉米逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性通過熱激轉(zhuǎn)化法，將在實(shí)施例2中構(gòu)建的載體pCAMBIA 1301: ZmRXOlPro轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，提取質(zhì)粒(圖8)并進(jìn)行PCR鑒定(圖7)。為鑒定啟動(dòng)子的逆境誘導(dǎo)活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法將玉米的成熟胚做了逆境之一的干旱處理再檢測GUS的活性。具體地說，將玉米種子浸泡催芽，然后將種子縱切，成兩半，用20 % PEG 誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，將玉米種子在⑶S檢測液中于37 °C過夜，⑶S檢測液lmg/ml X-gluc (5-溴-4-氯-3- 口引哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH = 7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. iTritonX-IOO, 20%甲醇。如圖所示(圖9、 圖10、圖11)，經(jīng)過PEG誘導(dǎo)的愈傷組織顯示出高水平的⑶S活性，而未經(jīng)誘導(dǎo)的愈傷組織顯示出低水平的⑶S活性。
SEQ ID NO. 1的序列(帶功能元件標(biāo)記)⑴序列特征(A)長度-lbp至-155bp ；+Ibp至+1421bp ； (B)類型核苷酸；(C)鏈性單鏈。(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述:SEQ ID NO. 1-155 A EamIATCGG TTCCGCTGCG TCGGTTCGGA TGTGTGGATC GGTTGGGTCG GACCATGTGC
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權(quán)利要求
1.一種獲得的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列包含相對于 SEQID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至_155bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列源自玉米抗病蛋白基因ZmRXOl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的5'非翻譯區(qū)包含相對于SEQ ID NO=I的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+142Ibp區(qū)的DNA核苷酸序列。
4.一種用于玉米轉(zhuǎn)化的病害誘導(dǎo)型的表達(dá)載體，其特征在于所述植物表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3所述的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl 的5'非翻譯區(qū)。
5.一種用于植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物包含權(quán)利要求1所述的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3所述的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的 5'非翻譯區(qū)。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆及功能分析屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供一種獲得的玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，包含相對于SEQ ID NO1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-155bp區(qū)的DNA核苷酸序列；同時(shí)提供用于玉米轉(zhuǎn)化的病害誘導(dǎo)型的表達(dá)載體，包含玉米病害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米抗病蛋白基因ZmRX01的5′非翻譯區(qū)；SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的PCR引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段；本發(fā)明可用于啟動(dòng)抵抗逆境基因的高效表達(dá)，對于玉米抗逆品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究，培育綜合抗性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因新品系具有積極意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102417908SQ20111036366
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者劉金亮, 張世宏, 李桂華, 潘洪玉, 賈承國, 陳婷婷, 陳景源, 陶冶 申請人:吉林大學(xué)