專利名稱：一種棉花生長點特異性啟動子及其克隆和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一個新的棉花基因的特 異性啟動子的克隆。
背景技術(shù)：
棉花是我國重要的纖維作物和主要的經(jīng)濟作物。以棉花為研究材料，利用轉(zhuǎn)基因 技術(shù)提高棉花產(chǎn)量、質(zhì)量和育種效率具有重要的實際意義。生長點是植物細胞不斷進行分 裂增生的部位，位于根和莖的頂端。莖的生長點往往呈錐狀，故又稱“生長錐”。莖和根的生 長點分別是由胚芽和胚根的生長點發(fā)育形成的。健全的棉子，播種后如果條件適宜，就會吸水膨脹，通過內(nèi)部一系列的酶促變化， 逐漸恢復(fù)旺盛的生命活動，開始進行胚細胞的分裂、伸長及分化，從形態(tài)上看有胚根的生長 及胚芽的伸長，這個過程叫萌發(fā)。一般要經(jīng)歷三個階段吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段。 萌動階段，胚不斷吸收營養(yǎng)物質(zhì)進行細胞分裂，胚根伸長，從珠孔突破種皮長出幼根；發(fā)芽 階段，細胞繼續(xù)分裂增生，胚軸向上生長，形成幼莖。生長點是種子萌發(fā)過程中細胞分裂和 增大的關(guān)鍵部位，細胞旺盛分裂的生長點有助于胚突破種皮，因此研究生長點基因的表達 對種子萌發(fā)具有重要意義。棉花的主莖是由胚芽發(fā)育而成的。胚芽頂端的分生組織不斷地分裂分化形成主莖 的節(jié)與節(jié)間，葉原基與腋芽原基。葉原基將來長成葉片，腋芽原基變成葉枝或果枝。因此， 胚芽生長點是棉株地上部分各器官分化建成的總的發(fā)源地。棉花的主莖具有一個重要的特 性，就是具有無限生長習(xí)性。只要環(huán)境適宜，主莖生長點就能不斷地分裂分化增長枝葉，其 中果枝的增加有助于棉花的產(chǎn)量增加。當然也不可以讓主莖徒長而發(fā)生早衰、棉桃脫落，造 成減產(chǎn)。因此通過控制某種影響莖生長點細胞分裂分化的基因的表達有望通過增加果枝的 數(shù)量來提高棉花產(chǎn)量，具有重要的應(yīng)用價值。在植物轉(zhuǎn)基因工程研究中，目前大多數(shù)采用的是組成型啟動子，如CaMV35S啟動 子、玉米Ubiquitin啟動子，但是這些啟動子能夠驅(qū)動外源基因在植物的所有組織和器官 中表達，造成能量浪費，給植物的正常生長發(fā)育帶來很大負擔。為保證植物的健康生長，在 轉(zhuǎn)基因時，能夠使所需基因在一定時期和一定的組織中表達非常重要。因此尋找時空特異 性啟動子具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，本發(fā)明克隆了一個新的棉花MPK7基因的特異性啟動子，該啟動 子在特定時期驅(qū)動基因在植物細胞分裂分化的關(guān)鍵部位尤其是生長點特異表達。本發(fā)明 構(gòu)建了該啟動子和GUS報告基因的的植物表達載體，并轉(zhuǎn)擬南芥。實驗表明在種子萌發(fā)階 段和幼苗期，該啟動子驅(qū)動GUS基因在莖或根的生長點特異表達；而在繁殖期，所有器官和 組織中均無表達。6BA、GA、IAA等激素是在植物種子萌發(fā)和生長過程中起重要作用的的信 號分子，用上述激素對子葉期幼苗進行誘導(dǎo)，GUS染色表明該啟動子的表達受上述激素的誘導(dǎo)。因此這一特異性啟動子的克隆對研究植物種子萌發(fā)及生長，提高種子發(fā)芽率，控制植株 生長速度具有重要的實際意義和應(yīng)用價值。該啟動子能驅(qū)動GUS基因在植物種子萌發(fā)和生長時期在莖或根的生長點特異表 達，繁殖期無表達，其基因序列如Seq ID No:l所示。該啟動子是在已得到的棉花GhMPK7基因的基因組序列(該基因其序列為如 Seq ID No :2所示)的基礎(chǔ)上，通過反向PCR的方法，得到的1298bp的啟動子序列，如 Seq ID No:l所示。通過PlantCARE軟件和查閱資料對該啟動子進行順式作用元件分 析，有三個與細胞分裂素(6-BA)作用相關(guān)的CPBCSP0R元件(Naoki Fusada，2005，Plant Molecular Biology, 59 :631_645)，分別處于 _878—864bp、_860—866bp、-702—706bp 處；在-569—575bp和-405—412bp處分別有一個與赤霉素(GA)作用相關(guān)的元件，分別 是 TATCCA0SAMY 和 GARE10SREP1(Keita Sutoh and Daisuke Yamauchi，2003， The Plant Journal, 34 635-645)；有三種與生長素(IAA)誘導(dǎo)相關(guān)的元件分別是ARFAT、NtBBFl 禾口 TGA-element (Jennifer L.Nemhauser,2004, PLoS Biology, 9 1460-1471), ARFAT 在-1072—1078bp 處，在-316—322bp(_)，-354—360bp (-)，-417—423bp (-)各有一個 NtBBFl元件，TGA-element處于_148—154bp (-)；此外，增強轉(zhuǎn)錄水平的元件CAAT_box、 G-box(未標注)，胚乳表達所需的控制元件Skn-1-motif也是與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)的 順式作用元件，元件的位置如附圖2。為了完成該啟動子的初步功能分析，本發(fā)明采用了花粉管通道法進行轉(zhuǎn)基因，構(gòu) 建了一種該啟動子的植物真核表達載體，即用棉花GhMPK7基因的啟動子序列取代pBI121 中的35S啟動子，構(gòu)建GUS融合基因，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，將該表達載體轉(zhuǎn)擬南芥，具體方法是進行 花序侵染，即待擬南芥繁殖期開花時，配制侵染液，用農(nóng)桿菌侵染花序。本發(fā)明在經(jīng)過上述轉(zhuǎn)基因后的擬南芥的不同發(fā)育時期檢測了 GUS活性，并用不同 的條件進行誘導(dǎo)，研究該啟動子驅(qū)動基因的表達情況，具體如下本發(fā)明分別取種子發(fā)芽時期、幼苗生長時期、繁殖期的轉(zhuǎn)基因擬南芥，通過現(xiàn)有的 方法檢測⑶S基因的表達情況。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在種子發(fā)芽時期，在莖和根的生長點有⑶s基 因的表達(圖4A、B)；在幼苗生長時期，在莖生長點檢測到有⑶S基因活性(圖4C、D)；在 繁殖期，所有組織器官中均無⑶S基因的表達。由此可見，本發(fā)明克隆所得的棉花GhMPK7 基因的啟動子具有不同生長發(fā)育時期的表達特異性，即時間表達特異性。同時發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該啟動子具有生長點特異性，并且根據(jù)對啟動子順式作用元件的 分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子具有ABA、GA、6BA、IAA等激素的響應(yīng)元件，而上述的激素是幾種與植物 細胞分裂、分化及凋亡相關(guān)的激素，因此我們選用上述激素對轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗誘導(dǎo)，分析 本發(fā)明克隆的啟動子的功能。無誘導(dǎo)條件下，GUS基因只在莖的生長點有表達(圖5A、B)。 在轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉期對其進行誘導(dǎo)，具體結(jié)果如下ABA誘導(dǎo)后，進行GUS組織化學(xué)染色， 發(fā)現(xiàn)⑶S基因在莖和葉脈中表達，并且在莖中的表達量很高；不同的赤霉素(GA)生物活性 不同，GA3的活性最高，用GA3誘導(dǎo)后，在子葉和莖的生長點檢測到GUS活性(圖5C、D) ；6BA 誘導(dǎo)，⑶S基因只在莖的生長點高效表達(圖5G、H) ；IAA誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)⑶S基因仍在莖的生長 點高效表達，在莖中其它部位也有表達(圖5E、F)。因此本發(fā)明指出該啟動子驅(qū)動基因的 表達具有組織特異性，并且是一種激素誘導(dǎo)型啟動子。通過上述的實驗，發(fā)明人證實了，通過本發(fā)明克隆所得的特異性啟動子，在生長點特異表達，又由于ABA、GA、6BA、IAA這些激素對植物種子的萌發(fā)、芽的生長和莖的伸長有重 要作用，因此該啟動子影響著棉花種子的發(fā)芽、芽和子葉的生長及莖的生長速度。因此，本 發(fā)明所克隆的啟動子在植物生長點的特異表達，有望在提高種子發(fā)芽率中應(yīng)用；構(gòu)建該啟 動子和相關(guān)基因的表達載體，調(diào)控植株莖的生長速度，可能會影響棉花及其它作物的結(jié)實 率；該啟動子是一個時空特異性表達和誘導(dǎo)型的啟動子，因此該啟動子的克隆對植物轉(zhuǎn)基 因技術(shù)領(lǐng)域啟動子的研究也具有重要意義。


圖1 擴增的棉花GhMPK7基因啟動子的電泳圖(A為目的片段，B為2kb的 Marker)；由圖中可知，擴增得到的序列為1298bp，包括1223bp的啟動子序列和部分5’非編 碼區(qū)序列。圖2 棉花GhMPK7基因特異性啟動子區(qū)域可能的順式作用元件及擴增轉(zhuǎn)基因序列 所用的引物；圖3 棉花GhMPK7基因啟動子序列與GUS基因的融合表達載體的構(gòu)建流程圖；圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥不同生長發(fā)育時期的GUS活性檢測圖；圖中可見，在種子發(fā)芽時期，在莖和根的生長點有⑶S基因的表達(圖4A、B)；在 幼苗生長時期，在莖生長點檢測到有GUS基因活性(圖4C、D)；圖5 不同誘導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS活性檢測圖；圖5中可見無誘導(dǎo)條件下，⑶S基因只在莖的生長點有表達(圖5A、B)；在轉(zhuǎn)基因 擬南芥子葉期對其進行誘導(dǎo)，具體結(jié)果如下ABA誘導(dǎo)后，進行GUS組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)GUS 基因在莖和葉脈中表達，并且在莖中的表達量很高；不同的赤霉素(GA)生物活性不同，GA3 的活性最高，用GA3誘導(dǎo)后，在子葉和莖的生長點檢測到GUS活性(圖5C、D) ；6BA誘導(dǎo)，GUS 基因只在莖的生長點高效表達(圖5G、H) ；IAA誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)GUS基因仍在莖的生長點高效表 達，在莖中其它部位也有表達(圖5E、F)。
具體實施例方式本發(fā)明的實施步驟是根據(jù)棉花GhMPK7基因的DNA序列用反向PCR的方法克隆 得到該基因的啟動子序列一啟動子順式作用元件分析及功能預(yù)測一設(shè)計帶有酶切位點 Hindi 11和BamH I的引物從DNA上擴增得到目的啟動子序列一用同樣的酶Hindi 11和BamH I酶切pBI121 —連接目的片段和酶切的PBI121 —轉(zhuǎn)擬南芥一⑶S組織化學(xué)染色檢測⑶S 活性，分析啟動子功能。本實施例中的其他技術(shù)均采用已有技術(shù)。實施例1棉花GhMPK7基 因啟動子的克隆1. 1基因組DNA的提取l、5ml 提取buffer (lOOmM Tris,500mM NaCl,50mM EDTA，高壓滅菌后 4°C用)中加 入40 ill 巰基乙醇，冰?。?、稱取lg幼嫩葉片，在液氮中研磨，快速轉(zhuǎn)移到提取buffer中，渦旋混勻；3、加入 2ml 10% SDS，65°C水浴 lOmin ；4、加入 5ml 5M KAC,混勻，冰水浴 20min ；
5、4°C，llOOOrpm 離心 20min ；6、上清用無菌紗布過濾，加入10ml異丙醇充分混勻，_20°C放置30min ；7、4°C，llOOOrpm 離心 15min，棄上清；8、沉淀用 700 ill 溶解 buffer (50mM Tris, 10mM EDTA，高壓滅菌后 4°C 保存)懸 ?。?、移入 1. 5ml eppendorf 管，加入 5 u 1 RNase A, 37°C溫育 30min ；10、加入等體積苯酚氯仿異戊醇(25 24 1)，混勻，4°C，12000rpm離心 lOmin ；11、取上清，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)，混勻后4°C，12000rpm離心 5min ；12、取上清，加入1/10體積的3M NaAC和lml異丙醇，_20°C放置2h ；13、4°C，12，OOOrpm 離心 lOmin,棄上清；14、70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥；15、60 ill TE 溶解沉淀，測 0D260，_20°C 保存。1. 2棉花GhMAPK7基因啟動子的克隆該啟動子的克隆是采用反向PCR(I-PCR)的方法。分別用六種核酸內(nèi)切酶酶切棉 花總 DNA，這六種酶分別是 EcoR I，Kpnl, Sea I，Xba I，Xho I，Bgl II，Pst I, Vsp I，用 大連寶生物公司生產(chǎn)T4連接酶將酶切后的產(chǎn)物連接成環(huán)，以連接好的產(chǎn)物為模板擴增棉花 GhMPK7基因的啟動子序列。酶切體系為80 ill 15iil的DNA，3iil酶，8iilBuffer (根據(jù) 每種酶說明書上有相應(yīng)的各種Buffer)，54 ill ddH20 ；十二小時之后補酶1 yl。連接體系 為 20 ill 2111的酶切的0嫩，4111的5\1^吐€61~，2111114連接酶，12111 ddH20 ；常溫連 接10分鐘。用酶Sea I酶切連接的模板擴增出了一段GhMPK7基因啟動子序列，第一輪PCR所 用的一對外側(cè)引物是Supl和Sscal，第二輪PCR用的一對內(nèi)側(cè)引物是Sup2和Ssca2，得到 980bp的啟動子序列。利用得到的這段啟動子序列設(shè)計引物，所用模板是內(nèi)切酶Vsp I所酶 切連接的環(huán)狀DNA，第一輪PCR所用的一對外側(cè)引物是Sup3和Svspl，第二輪PCR用的一對 內(nèi)側(cè)引物是Sup4和Svsp2，得到另外318bp的啟動子序列；因此共得到1298bp的啟動子序 列。啟動子的克隆所需的引物如下表
6 1. 3棉花GhMPK7基因啟動子序列的擴增設(shè)計克隆GhMPK7基因啟動子所需引物引物 Szl (上游序列)序列如 Seq ID No 11 所示，AAGCTTAATAAATTACGTCCGCGAC ；弓| 物Szxl(下游序列)序列如Seq ID No: 12所示， GGATCCACTTTGAGATCATTCCACCAC ；引物Szl中的AAGCTT為Hindlll的酶切位點，引物Szxl中的GGATCC是BamHI的 酶切位點，下劃線的部分是啟動子序列。利用引物Szl和引物Szxl，以棉花DNA為模板將該 啟動子從棉花基因組中擴增出來，擴增片段為1298bp，序列如序列表中SED ID NO. 1。體系如下 反應(yīng)程序為預(yù)變性94°C，5min ；變性94°C，40s，退火52°C，40s，延伸72°C，lmin20s, 35 個循環(huán)；后延伸 72°C，lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小正確，回收目的片段，如圖 1。實施例2植物表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化2. 1棉花GhMPK7基因啟動子序列與⑶S報告基因的融合選擇pBI121作為植物表達載體，將PCR擴增得到目的片段酶切，電泳并膠回收。同 時用限制性內(nèi)切酶Hindlll和BamHI酶切表達載體，并回收載體片段。連接基因片段與載 體片段，利用菌落PCR及質(zhì)粒酶切方法篩選pBI121-GhMPK7啟動子。具體過程可參考附圖 31、用帶有酶切位點的引物Szl和Szxl擴增棉花GhMPK7基因的啟動子序列，并凝 膠電泳分離和回收目的片段。2、用Hindlll和BamH I雙酶切回收目的片段和植物表達載體pBI121。3、回收進行瓊脂糖凝膠電泳，切下含有GhMPK7啟動子序列的DNA片段和pBI121 載體片段。4、連接，連接體系如下
10 x ligation Buffer l|ilGhMAPK7總動子4卩 1 PBI121 4^1 T4 DNA連接酶 lpl混勻后16 °C連接過夜。5、轉(zhuǎn)化取5iU連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，菌液涂布于含卡那霉 素的固體培養(yǎng)基平板上；6、重組子的篩選對長出的菌落進行PCR及質(zhì)粒的Hindlll和BamH I雙酶切鑒定。2. 2農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備1、挑取單菌落LBA4404，接種于5ml加有50mg利福平(Rifampicin)的液體LB培 養(yǎng)基中，28 °C，200rpm,過夜培養(yǎng)。2、取2ml培養(yǎng)物至液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D800為0. 5左右。將培養(yǎng)物冰 浴 30min, 4°C, 5，OOOrpm,離心 5min。3、棄上清。用 10ml 0. lmol/L 冷的 NaCl 懸浮菌體；4°C，5, OOOrpm，離心 5min。4、棄上清，lml 20mmol/L冷的CaCl2懸浮，分裝成50111/ ，液氮中速凍后，-801保存。2. 3凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1、冰上融化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，加入3iU帶有目的片段的pBI121質(zhì)粒， 冰凍30min，液氮中冷凍lmin，然后在37°C水浴5min。2、加入lml無抗生素的YEP培養(yǎng)基，28°C，200rpm,振蕩培養(yǎng)3h。3、10，OOOrpm離心lmin以濃縮菌液，用100 u 1 YEP回溶菌體。
4、將回溶后的菌體涂于附加50mg/L卡那霉素(Kanamycin sulfate)和100mg/L 利福平的固體YEP培養(yǎng)基上，28°C下培養(yǎng)2-3d。5、酶切及PCR鑒定陽性菌落。2. 4農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥農(nóng)桿菌的培養(yǎng)從-80°C冰箱中取出所要的菌種，在冰浴中融化。分別取30 yl的 農(nóng)桿菌接種于5ml的YEP培養(yǎng)基(100mg/L利福平，100mg/L卡那霉素)，28°C，200rpm過夜 培養(yǎng)。然后在附加50mg/L卡那霉素和100mg/L的固體YEP培養(yǎng)基上劃板，以便將來挑單菌 落所用。侵染液的配制配制15ml侵染液，需加入0.81g蔗糖，加3. 6 ill sliwet。花序侵染挑取農(nóng)桿菌(攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落)接種于含有50mg/L卡那 霉素的YEP培養(yǎng)液中，28°C，250rpm,振蕩培養(yǎng)約48h，至對數(shù)生長后期；將菌液用MS培養(yǎng)液 稀釋10倍，待用。將擬南芥種子播種于MS基本培養(yǎng)基中，待種子萌發(fā)長出子葉后，移入蛭石 中，澆營養(yǎng)液，等待擬南芥開花。將搖好的菌液放入80ml大離心管中，5，500rpm離心7min ； 去上清，用侵染液5ml將沉淀重懸，稍震蕩。將所有花序侵入約5S，時間過長花序容易死掉， 過短則侵染不上。2. 5轉(zhuǎn)基因植株的鑒定待花序侵染的擬南芥接種后，將擬南芥種子播種于加有卡那霉素的MS培養(yǎng)基中 篩取轉(zhuǎn)基因的擬南芥種子，能在加有卡那霉素的MS培養(yǎng)基中萌發(fā)生長的擬南芥種子，可初 步確定為轉(zhuǎn)基因的擬南芥。種子萌發(fā)長出子葉后，移入蛭石中，澆營養(yǎng)液。為進一步鑒定所 得到的植株為轉(zhuǎn)基因的植株，取每個植株的的一片小葉分別用微量法提取DNA，通過PCR的 方法進行轉(zhuǎn)基因鑒定。所用引物和程序如擴增啟動子時所用引物和程序，得到目的片段，連 接轉(zhuǎn)化后，取陽性克隆，經(jīng)測序證明所得植株中確實轉(zhuǎn)入了該發(fā)明所克隆的啟動子。實施例3對不同時期的轉(zhuǎn)基因植株進行GUS活性組織化學(xué)染色3. 1⑶S活性組織化學(xué)染色的方法1、樣品放入冰水混合物冰浴兩分鐘；2、將樣品用濾紙吸干水，放入染色瓶中，加入90%丙酮浸過樣品lOmin ；3、用buffer迅速清洗一遍倒掉；4、加入GUS染色液沖洗兩遍，每遍5min，輕搖；5、抽氣 2 次 lOmin ；6、37 °C恒溫保存過夜。用顯微鏡觀察。3. 2⑶S 染色 Buffer 配方
ddH20 定容至 100ml。3. 3GUS染色液配方用800 u 1DMS0 溶解 lOOmg 的 X-GluC，加入⑶S 染色 buffer 定容至 100ml。3. 4對不同時期的轉(zhuǎn)基因植株進行GUS活性組織化學(xué)染色分別在轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌發(fā)階段、幼苗期及繁殖期進行GUS活性組織化學(xué)染 色，發(fā)現(xiàn)在種子萌發(fā)階段和幼苗期，該啟動子驅(qū)動GUS基因在莖或根的生長點特異表達(如 圖4)；而在繁殖期，所有器官和組織中均無表達，可見其為時間表達特異性啟動子。實施例4對轉(zhuǎn)基因擬南芥誘導(dǎo)的方法通過噴灑的方法將ABA、GA、6BA、IAA等激素噴灑到子葉期轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片上，6 個小時后取樣，進行GUS活性組織化學(xué)染色；其具體結(jié)果如圖5所示，由圖中內(nèi)容可見本發(fā) 明所得的啟動子驅(qū)動基因的表達具有組織特異性，并且是一種激素誘導(dǎo)型啟動子。<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120> 一種棉花生長點特異性啟動子及其克隆和應(yīng)用<160>12
<210>1<211>1298<212>DNA<213> ^^ (Gossypium hirsutum L.)<400>1attaatgttaatataattgcaaaatatgta60
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權(quán)利要求
一種棉花生長點特異性啟動子的克隆及其應(yīng)用，其特征在于該啟動子的基因序列如Seq ID No1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花生長點特異性啟動子的克隆及其應(yīng)用，其特征在于該 啟動子能驅(qū)動GUS基因在植物種子萌發(fā)和生長時期在莖或根的生長點特異表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棉花生長點特異性啟動子的克隆及其應(yīng)用，其特征在于 該啟動子是在棉花GhMPK7基因的基因組序列的基礎(chǔ)上，通過反向PCR的方法獲得的，所述 的GhMPK7基因其序列如Seq ID No 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棉花生長點特異性啟動子的克隆及其應(yīng)用，其特征在于 該啟動子為是激素誘導(dǎo)型啟動子，具有ABA、GA、6BA、IAA中各種激素的響應(yīng)元件。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棉花生長點特異性啟動子的克隆及其應(yīng)用，其特征在于 該啟動子具有時間表達特異性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1。利用類似方法在棉花及其他植物中克隆MPK7基因啟動子的同源 序列在權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2。利用該啟動子構(gòu)建的各種基因的植物表達載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求2。利用該啟動子序列與其他啟動子組合構(gòu)建任何基因的植物表達載 體也在權(quán)利范圍要求之內(nèi)。
9.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其應(yīng)用于提高種子發(fā)芽率、調(diào)控植株莖的生長速度以 及影響棉花及其它作物的結(jié)實率。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，克隆了一個新的棉花MPK7基因的特異性啟動子，該啟動子在特定時期驅(qū)動基因在植物細胞分裂分化的關(guān)鍵部位尤其是生長點特異表達。本發(fā)明構(gòu)建了該啟動子和GUS報告基因的的植物表達載體，并轉(zhuǎn)擬南芥。實驗表明在種子萌發(fā)階段和幼苗期，該啟動子驅(qū)動GUS基因在莖或根的生長點特異表達；而在繁殖期，所有器官和組織中均無表達。6BA、GA、IAA等激素是在植物種子萌發(fā)和生長過程中起重要作用的的信號分子，用上述激素對子葉期幼苗進行誘導(dǎo)，GUS染色表明該啟動子的表達受上述激素的誘導(dǎo)。因此這一特異性啟動子的克隆對研究植物種子萌發(fā)及生長，提高種子發(fā)芽率，控制植株生長速度具有重要的實際意義和應(yīng)用價值。
文檔編號A01H5/00GK101875932SQ200910230310
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者于菲菲, 張良, 石靜, 郭興啟 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)