專利名稱：葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離方法及在抗病育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩個(gè)來(lái)源于葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離方法，重組表達(dá)載體構(gòu)建 及在轉(zhuǎn)基因葡萄中的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的重要DNA序列，它與轉(zhuǎn)錄因子一起 決定下游基因表達(dá)的時(shí)間、類型、水平和組織器官特異性等?；蚬こ讨邪雌渥饔梅绞郊肮?能，啟動(dòng)子通常被分為三類組織特異型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子僅在特定器官或組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在定向 改變組織器官性狀的研究中，本類啟動(dòng)子應(yīng)用比組成型啟動(dòng)子更有效。組成型啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子能在所有組織細(xì)胞、任何時(shí)空啟動(dòng)基因表達(dá)。組成型啟 動(dòng)子盡管能夠不受時(shí)空及環(huán)境影響啟動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中高效表達(dá)，Kohli等在《植 物雜志》1999年17 =591-601 “轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化質(zhì)粒重組的分子鑒定揭示煙草花葉病毒35S 啟動(dòng)子中熱點(diǎn)重組”中報(bào)道，正常環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)組成型表達(dá)抗逆蛋白不僅是一種能量浪費(fèi)， 還會(huì)導(dǎo)致植物的正常代謝受阻，致轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育異?；蛟斐善渌?fù)面影響。由于它的強(qiáng) 轉(zhuǎn)錄活性，能夠組成型高效啟動(dòng)外源轉(zhuǎn)基因表達(dá)，目前基因工程中廣泛應(yīng)用的煙草花葉病 毒35S啟動(dòng)子仍占總數(shù)的80%。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子平時(shí)不啟動(dòng)基因表達(dá)或啟動(dòng)強(qiáng)度很低。在一定誘因 下，啟動(dòng)活性增強(qiáng)。Behnam等在《植物細(xì)胞報(bào)告》2007年沈1275-1282 “擬南芥rd29A啟 動(dòng)子整合DREBlA基因提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯抗冷性”中報(bào)道，rd29A誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)擬南芥 DRREBl在馬鈴薯中表達(dá)后，攝氏4度條件下，前半小時(shí)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯與野生型DREBl的表達(dá) 都未檢測(cè)到，半小時(shí)后，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中DREBl開始表達(dá)，而野生型依然沒(méi)有檢測(cè)到，rd29A 通過(guò)在低溫條件下啟動(dòng)DREBl表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗寒性。其它干旱、鹽堿、極端溫度 等脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子近兩年也開始被逐漸重視并用于植物抗逆基因工程。歐洲葡萄以其優(yōu)良品質(zhì)成為生產(chǎn)中的主載種，然而其本身并沒(méi)有顯著抗病性。傳 統(tǒng)育種通過(guò)對(duì)雜交后代表現(xiàn)型進(jìn)行篩選相當(dāng)耗財(cái)費(fèi)時(shí)，基因工程技術(shù)已成為加快定向培 育抗病葡萄品種的新趨勢(shì)。病程相關(guān)蛋白基因是一類能有效提高葡萄抗病性的基因，被 廣泛應(yīng)用于葡萄抗病基因工程育種中。然而，F(xiàn)erreira等在《生物技術(shù)趨勢(shì)》2004年22 168-173 “不改變葡萄酒品質(zhì)的情況下提高轉(zhuǎn)基因葡萄抗病性”中指出，葡萄果實(shí)過(guò)多積累 病程相關(guān)蛋白導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)嚴(yán)重下降，因此組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)的 轉(zhuǎn)基因葡萄果實(shí)可能將導(dǎo)致酒品質(zhì)下降。截止到目前，還沒(méi)有鑒定分離出有效的葡萄病原 菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子并應(yīng)用于基因工程研究。因此，獲得葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)于葡萄抗 病基因工程建立一個(gè)高效、實(shí)用的表達(dá)系統(tǒng)是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
為克服組成型啟動(dòng)子給轉(zhuǎn)基因抗病葡萄帶來(lái)的負(fù)面影響，并避免染色體步移等方 法克隆啟動(dòng)子的繁瑣，本發(fā)明公開了一種啟動(dòng)子快速克隆法，以克隆獲得兩個(gè)葡萄病原菌 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(GenBank登陸號(hào)分別為⑶565705及HQ174899)構(gòu)建啟動(dòng)子報(bào)告基因融 合載體，兩個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)報(bào)告基因在葡萄葉片中的表達(dá)受白粉菌誘導(dǎo)，為葡萄抗病基因工 程提供病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆方法并成功應(yīng)用于葡萄抗病育種中。本發(fā)明是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的中國(guó)野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’葡萄抗病轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl 和VpWRKY2為白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)型基因，其啟動(dòng)子具有受病原菌誘導(dǎo)啟動(dòng)基因上調(diào)表達(dá)的活 性，采用GenBank葡萄基因組序列及白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2 序列設(shè)計(jì)引物，從中國(guó)野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’基因組DNA中進(jìn)行啟動(dòng)子 片段的克隆，獲得了病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PvpWRKYl全長(zhǎng)序列694bp與病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 PvpffRKY2全長(zhǎng)序列643bp，通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)載體PvpWRKYl GUS和PvpWRKY2 ⑶S，并用 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法導(dǎo)入葡萄葉片，瞬時(shí)表達(dá)所克隆啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS報(bào)告基因，通 過(guò)對(duì)接種葡萄白粉菌前后瞬時(shí)表達(dá)葉片的GUS染色觀察，及對(duì)接種葡萄白粉菌前后瞬時(shí)表 達(dá)葉片的GUS活性定量檢測(cè)，驗(yàn)證了 PvpWRKYl和PvpWRKY2受葡萄白粉菌誘導(dǎo)啟動(dòng)報(bào)告基 因活性上調(diào)。本發(fā)明克隆的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)與轉(zhuǎn)錄因子基因序列為基礎(chǔ)設(shè) 計(jì)引物直接克隆所得，避免了染色體步移等方法克隆啟動(dòng)子的繁瑣，具有簡(jiǎn)便、快速等特 點(diǎn)，此方法也完全適用于克隆其它啟動(dòng)子。⑶S且未 接種白粉菌的葉片淺度著色，接種后葉片染色程度加深，陰性對(duì)照葉片接種前后均未著色， 陽(yáng)性對(duì)照即轉(zhuǎn)化35: :GUS載體的葉片深度著色，而轉(zhuǎn)化無(wú)啟動(dòng)子的GUS載體葉片染色后僅 微弱變藍(lán)。接種白粉菌前后轉(zhuǎn)化葉片的GUS活性定量檢測(cè)結(jié)果表明PvpWRKYl和PvpWRKY2 啟動(dòng)的GUS本底活性相對(duì)較弱，但兩啟動(dòng)子活性受白粉菌誘導(dǎo)后上升，PvpffRKYl啟動(dòng)的GUS 在接種白粉菌后的活性是接種前3. 21倍，而PvpWRKY2啟動(dòng)的GUS在接種白粉菌后的活性 是接種前1. 63倍，即本發(fā)明克隆的兩個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均能在病原菌侵染時(shí)以精準(zhǔn)方式調(diào) 控轉(zhuǎn)入外源基因，使轉(zhuǎn)入基因僅在受病原菌誘導(dǎo)的條件下被啟動(dòng)表達(dá)。在葡萄抗病育種中， 僅需把重組載體中啟動(dòng)子所啟動(dòng)的報(bào)告基因換成任何感興趣的抗病基因，即可轉(zhuǎn)化葡萄獲 得病原菌誘導(dǎo)表達(dá)外源抗病基因的轉(zhuǎn)化植株，從而減少抗病基因工程育種中組成型啟動(dòng)子 對(duì)轉(zhuǎn)基因葡萄造成的負(fù)面影響，最大限度發(fā)揮轉(zhuǎn)基因優(yōu)勢(shì)。


附圖1為本發(fā)明VpWRKYl和VpWRKY2表達(dá)模式圖。圖示VpWRKYl和VpWRKY2在葡萄葉片接種白粉菌前后不同時(shí)間表達(dá)模式的半定量 分析結(jié)果；VpWRKYl和VpWRKY2被白粉菌誘導(dǎo)先上調(diào)表達(dá)到最高，再逐漸下降至初始水平。附圖2為本發(fā)明重組載體構(gòu)建示意圖。載體pCAMBIA1301的組成型35S啟動(dòng)子分別被置換成目標(biāo)啟動(dòng)子或直接去掉，從 而構(gòu)建成新的重組載體。附圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)化葉片⑶S染色結(jié)果圖。
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w/o35S GUS、PvpffRKYl GUS、PvpffRKY2 GUS 禾口 35S GUS 分別為無(wú)啟動(dòng)子、 PvpffRKYU PvpWRKY2、35S啟動(dòng)⑶S表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染過(guò)的葉片，上排為葡萄白粉 菌懸浮液接種12小時(shí)后各載體轉(zhuǎn)化葉片的GUS染色結(jié)果，下排為水對(duì)照處理相同時(shí)間的染 色結(jié)果，WT為對(duì)照，即僅空農(nóng)桿菌LBA4404侵染。附圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)化葉片⑶S活性定量圖。不同啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS活性在葡萄葉片接種白粉菌前后的定量比較。灰色和柱子 黑色分別表示同一載體轉(zhuǎn)化葉片接種前、后的GUS活性。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述實(shí)施例一葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因啟動(dòng)子的分離方法a.葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因半定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)取樣首先對(duì)葡萄葉片進(jìn)行白粉菌接種處理，當(dāng)新梢長(zhǎng)至25-30cm長(zhǎng)，新葉長(zhǎng)至5-6cm寬 時(shí)，在每新梢上選取3片幼葉，壓片前預(yù)先噴霧無(wú)菌水使葉片上有微小液滴，但無(wú)明顯露點(diǎn) 出現(xiàn)，從田間發(fā)病葡萄上采摘白粉病發(fā)病癥狀一致的葉片對(duì)選取的葉進(jìn)行壓片接種，壓片 時(shí)間超過(guò)&，壓片后即套袋M小時(shí)保濕以利白粉菌孢子萌發(fā)，在接種后0、6、12、24、48、72、 96,120小時(shí)采集葉片在田間用液氮凍存，去離子水處理的葉片做為對(duì)照；b. RNA分離采用SDS/酚法，cDNA第一鏈合成參照Promega公司M-MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 使用說(shuō)明進(jìn)行；c.引物設(shè)計(jì)及反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)選擇VpGAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)目的基因及內(nèi)參基因序列設(shè)計(jì)引物如下VpffRKYl 上游引物GCGTCCTCGTCGGAGGGGATVpffRKYl 下游引物ATCTGGACCTGTTTGGTTGCVpffRKY2 上游引物CAGAGAAGGCTGAACCGAACVpffRKY2 下游弓丨物AGCCTTTGGAAATGGTGATGVpGAPDH 上游弓丨物ATCCACGGGAGCAGCAAA
VpGAPDH 下游弓丨物AGAACGCGAAAATTAGAACAGG反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)采用天根公司預(yù)混上樣緩沖液的2 X PCR mix反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)程 序94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒條件下擴(kuò)增25 循環(huán)，最后72 °C延伸5分鐘，中國(guó)野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2 被葡萄白粉菌誘導(dǎo)12小時(shí)后先上調(diào)表達(dá)到最高，后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降至初始水平，表 明這兩個(gè)基因啟動(dòng)子為病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以‘白河-35-1’基因組DNA為模板，根據(jù) VpffRKYl和VpWRKY2基因序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子下游引物，根據(jù)NCBI歐洲葡萄基因組同源序列設(shè) 計(jì)啟動(dòng)子上游引物，PCR先直接快速擴(kuò)增出包含與基因重疊區(qū)域啟動(dòng)子片段，回收PCR產(chǎn)物 克隆、測(cè)序；d. PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段PvpffRKYl 上游引物CTATTAGGAGGAGTTGGTTGPvpffRKYl 下游引物CTCATGGTGGCGTCTGTG
PvpffRKY2 上游引物ATGGTCTCCGTTCCGTCTT
PvpffRKY2 下游引物ACTCGGGGTTCGGCTCAG ；
e.葡萄基因組按小量提取法進(jìn)行
e.1采摘Icrn2左右葉片放入離心管中，
e.2加0.細(xì)1提取緩沖液，提取緩沖液配制200mM Tris PH 7. 5, 250mMNaCl, 25mMEDTA PH8..0,0. 5% SDS,
e.3用與離心管配套的小塑料研棒按順、逆時(shí)針交替旋轉(zhuǎn)法將樣品在緩沖液中磨碎，
e.4在12000rpm，離心5分鐘，
e.5上清液轉(zhuǎn)移至新管，
e.6加入0.細(xì)1酚氯仿異戊醇溶液，其體積比為25 24 1，PH值為6. 5，
e.7加0.細(xì)1異丙醇，混勻，
e.8放置5分鐘，
e.9全速離心5分鐘，
e.10棄上清，管底剩下DNA，
e.11加Iml 70%乙醇上下輕柔顛倒至白色片狀物懸浮，室溫放置2分鐘，
e.12在12000rpm，離心1分鐘，棄上清，
e.13開放空間干燥10分鐘以上，至乙醇揮發(fā)干凈，
e.14 加 50ul 滅菌 ddH20,
e.15稀釋5倍直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
f.目地片段的TA連接測(cè)序方法按Promega載體使用說(shuō)明進(jìn)行。
實(shí)施例二 啟動(dòng)子重組載體的構(gòu)建和應(yīng)用
a.重組載體構(gòu)建，為構(gòu)建⑶S報(bào)告重組載體，重新設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)^CbaI和
Nco I的引物僅擴(kuò)增不包含與基因重疊區(qū)域啟動(dòng)子片段部分，分別命名為PvpWRKYl和 PvpWRKY2，用目的啟動(dòng)子替換pCAMBIA1301的35S，使⑶S處于所克隆啟動(dòng)子控制下，構(gòu)建成 promoter: GUS重組表達(dá)載體，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S啟動(dòng)子，利 用同尾酶互補(bǔ)將載體重新連接成沒(méi)有35S的⑶S載體，命名為w/o35S:⑶S，pCAMBIA1301 做為陽(yáng)性對(duì)照，即35組成型啟動(dòng)GUS表達(dá)；PvpffRKYl ⑶S 上游引物gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTGPvpffRKYl ⑶S 下游引物gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAAPvpffRKY2 ⑶S 上游引物gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC
PvpffRKY2⑶S 下游引物gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG以TA連接好的載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR回收產(chǎn)物與pCAMBIA1301空載體 分別進(jìn)行)(bal和NcoI雙酶切后，PCR與載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后送測(cè)序保證重組載 體中啟動(dòng)子插入位置正確無(wú)誤；b.電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備b. 1將LBA4404菌株接種于20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福平終濃度的 LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)M小時(shí)，b. 2將培養(yǎng)好的菌液加入IOOml新鮮LB中至OD值0. 2，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至OD 值 0.6，
b. 3從搖床中取出菌液，冰浴15分鐘，b. 4菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管，4°C 5000rpm離心15分鐘，棄上清，b. 5用冰浴的滅菌ddH20 35ml重懸細(xì)胞，離心，棄上清，重復(fù)用ddH20洗一次，b. 6用冰浴的滅菌10%甘油25ml輕柔重懸浮細(xì)胞，離心，沉淀會(huì)很松散，棄上清， 重復(fù)用10%甘油洗一次，b. 7用2ml冰浴后的10%甘油重懸細(xì)胞即成感受態(tài)細(xì)胞，b. 8將感受態(tài)細(xì)胞按100 μ 1分裝到1. 5ml離心管，立即置于冰上準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)化；c.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，c. 1 將測(cè)序正確的 promoter: :GUS 菌液及陰性對(duì)照 w/0;35S: :GUS 和 pCAMBIA1301 提取質(zhì)粒后，用50ul無(wú)菌ddH20溶解備用，c. 2將電轉(zhuǎn)化用的電極杯及蓋子用ddH20洗凈后，80%乙醇侵泡5分鐘，用紫外交 聯(lián)儀紫外線照射30分鐘以除去殘留DNA，并將溫度設(shè)置為30°C烘干電極杯，c. 3將電極杯蓋好與感受態(tài)細(xì)胞一起分別置于冰上預(yù)冷20分鐘，c. 4加入ddH20溶解的質(zhì)粒0. 2ul于感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吸打混勻繼續(xù)冰浴30分 鐘，c. 5將混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使均勻進(jìn)入電極杯底部 且內(nèi)部不產(chǎn)生氣泡，c. 6打開電穿孔儀，選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化模式，調(diào)節(jié)電壓至1. 8KV,c. 7將電極杯側(cè)面用吸水紙完全拭干后按狹縫向前方向放入卡槽中，c. 8將卡槽推入電轉(zhuǎn)化儀，按start鍵，聽到兩聲輕微蜂鳴后，取出電極杯置于冰 上，待最后一個(gè)樣品電擊完畢，在超凈臺(tái)內(nèi)向每個(gè)電極杯中加200 μ 1液體LB將細(xì)胞洗出并 移入1. 5ml離心管中，至于培養(yǎng)1. 5小時(shí)后涂布于篩選平板上，c. 9對(duì)篩選出的菌落進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)陽(yáng)性菌進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得工程菌；d.工程菌轉(zhuǎn)化葡萄葉片，誘導(dǎo)啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，用真空滲透法將工程菌轉(zhuǎn)化入葡 萄葉片，并在接種前后染色，獲得報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)，d. 1將含有目地質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液接種到20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福 平終濃度的LB液體培養(yǎng)基，28°C,200rpm振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，d. 2將5ml培養(yǎng)液加入200ml新鮮含有相同抗生素的LB在、200rpm振蕩培養(yǎng) 16小時(shí)，d. 3在5000rpm離心10分鐘，棄上清，用20ml重懸液重懸菌體至OD值0. 6，重懸 液配制10mM MES pH 5. 6, IOmM MgCL2, 2% (ff/V)蔗糖，150 μ M乙酰丁香酮，將配好的重懸 液高壓滅菌15分鐘，冷卻備用，d. 4將大小薄厚一致的葡萄葉片均勻加入培養(yǎng)好的菌液中，菌液深度不超過(guò) 1. 5cm，在真空泵壓力0. 085-0. 09MPa下抽真空45分鐘，d. 5擦去葉片表面菌液，正面朝上將葉柄固定于濕潤(rùn)的脫脂棉內(nèi)，放于托盤中，覆 蓋帶孔保鮮膜，于27°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)16小時(shí)，再在弱光下培養(yǎng)至3天，期間噴霧保濕，d. 6每處理取出半數(shù)葉片，用去離子水沖洗，基中兩片用于蛋白測(cè)定，其余放入 ⑶S染色液中再抽真空10分鐘，37°C染色，d. 7對(duì)另半數(shù)葉片用壓片法接種葡萄白粉菌，壓片前預(yù)先噴霧無(wú)菌水使葉片上有微小液滴，但無(wú)明顯露點(diǎn)出現(xiàn)，從田間采摘發(fā)病嚴(yán)重且一致的葉片對(duì)轉(zhuǎn)化葉片進(jìn)行壓片接 種，壓片時(shí)間5秒，壓片后繼續(xù)覆蓋帶孔保鮮膜保濕，12小時(shí)后取兩片用于蛋白測(cè)定，其余 放入GUS染色液中染色；e.轉(zhuǎn)基因葡萄葉片病原誘導(dǎo)GUS活性的定量檢測(cè)⑶S活性檢測(cè)方法按Jefferson經(jīng)典方案，以4_甲基傘形酮酰-β -D-葡萄糖酸苷 (4-MUG)為底物，GUS催化使之水解為4-甲基傘形酮G-MU)與β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分 子中的羥基解離后被365nm的光激發(fā)，產(chǎn)生455nm的熒光，熒光值由熒光分光光度計(jì)測(cè)定。
權(quán)利要求
1.葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離方法，中國(guó)野生華東葡萄抗白粉病株系‘白 河-35-1’葡萄抗病轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2為白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)型基因，其啟動(dòng) 子具有受病原菌誘導(dǎo)啟動(dòng)基因上調(diào)表達(dá)的活性，采用GenBank葡萄基因組序列及白粉菌誘 導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2序列設(shè)計(jì)引物，從中國(guó)野生華東葡萄抗白粉 病株系‘白河-35-1’基因組DNA中進(jìn)行啟動(dòng)子片段的克隆，獲得了病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 PvpffRKYl全長(zhǎng)序列694bp與病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PvpWRKY2全長(zhǎng)序列64;3bp，其特征在于 通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)載體PvpWRKYl:⑶S和PvpWRKY2:⑶S，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法 導(dǎo)入葡萄葉片，瞬時(shí)表達(dá)所克隆啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS報(bào)告基因，通過(guò)對(duì)接種葡萄白粉菌前后 瞬時(shí)表達(dá)葉片的GUS染色觀察，及對(duì)接種葡萄白粉菌前后瞬時(shí)表達(dá)葉片的GUS活性定量檢 測(cè)，驗(yàn)證了 PvpWRKYl和PvpWRKY2受葡萄白粉菌誘導(dǎo)啟動(dòng)報(bào)告基因活性上調(diào)。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離方法，其特征在于2. a葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因半定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)取樣，首先對(duì)葡萄葉片進(jìn)行白 粉菌接種處理，當(dāng)新梢長(zhǎng)至25-30cm長(zhǎng)，新葉長(zhǎng)至5-6cm寬時(shí)，在每新梢上選取3片幼葉，壓 片前預(yù)先噴霧無(wú)菌水使葉片上有微小液滴，但無(wú)明顯露點(diǎn)出現(xiàn)，從田間發(fā)病葡萄上采摘白 粉病發(fā)病癥狀一致的葉片對(duì)選取的葉進(jìn)行壓片接種，壓片時(shí)間超過(guò)^，壓片后即套袋M小 時(shí)保濕以利白粉菌孢子萌發(fā)，在接種后0、6、12、24、48、72、96、120小時(shí)采集葉片在田間用 液氮凍存，去離子水處理的葉片做為對(duì)照；2. b RNA分離采用SDS/酚法，cDNA第一鏈合成參照Promega公司M-MMLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明進(jìn)行；2. c引物設(shè)計(jì)及反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)選擇VpGAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)目的基因及內(nèi)參基因序列設(shè)計(jì)引物如下VpffRKYl 上游引物GCGTCCTCGTCGGAGGGGATVpffRKYl 下游引物ATCTGGACCTGTTTGGTTGCVpffRKY2 上游引物CAGAGAAGGCTGAACCGAACVpffRKY2 下游引物AGCCTTTGGAAATGGTGATGVpGAPDH 上游引物ATCCACGGGAGCAGCAAAVpGAPDH 下游引物AGAACGCGAAAATTAGAACAGG反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)采用天根公司預(yù)混上樣緩沖液的2XPCR mix反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)程序 94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒條件下擴(kuò)增25循 環(huán)，最后72°C延伸5分鐘，中國(guó)野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2被葡 萄白粉菌誘導(dǎo)12小時(shí)后先上調(diào)表達(dá)到最高，后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降至初始水平，表明這兩 個(gè)基因啟動(dòng)子為病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以‘白河-35-1’基因組DNA為模板，根據(jù)VpWRKYl和 VpffRKY2基因序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子下游引物，根據(jù)NCBI歐洲葡萄基因組同源序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子上 游引物，PCR先直接快速擴(kuò)增出包含與基因重疊區(qū)域啟動(dòng)子片段，回收PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序； 2.d PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段 PvpffRKYl 上游引物CTATTAGGAGGAGTTGGTTG PvpffRKYl 下游引物CTCATGGTGGCGTCTGTG PvpffRKY2 上游引物ATGGTCTCCGTTCCGTCTTPvpffRKY2 下游引物ACTCGGGGTTCGGCTCAG ；2. e葡萄基因組按小量提取法進(jìn)行 2. e. 1采摘Icm2左右葉片放入離心管中，2. e. 2 加 0. 4ml 提取緩沖液，提取緩沖液配制200mM Tris PH 7. 5,250mM NaCl, 25mM EDTA PH :8. 0,0. 5% SDS,2. e. 3用與離心管配套的小塑料研棒按順、逆時(shí)針交替旋轉(zhuǎn)法將樣品在緩沖液中磨碎， 2. e. 4 在 12000rpm，離心 5 分鐘， 2. e. 5上清液轉(zhuǎn)移至新管，2. e. 6加入0.細(xì)1酚氯仿異戊醇溶液，其體積比為25 24 1，PH值為6. 5，2. e. 7加0. 4ml異丙醇，混勻，2. e. 8放置5分鐘，2. e. 9全速離心5分鐘，2. e. 10棄上清，管底剩下DNA，2. e. 11加Iml 70%乙醇上下輕柔顛倒至白色片狀物懸浮，室溫放置2分鐘，2. e. 12在12000rpm，離心1分鐘，棄上清，2. e. 13開放空間干燥10分鐘以上，至乙醇揮發(fā)干凈，2. e. 14 加 50ul 滅菌 ddH20,2. e. 15稀釋5倍直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2.f.目地片段的TA連接測(cè)序方法按Promega載體使用說(shuō)明進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1所述的葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在抗病育種中的應(yīng)用，其特征在于 3. a重組載體構(gòu)建，為構(gòu)建⑶S報(bào)告重組載體，重新設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn))(ba I和Nco I的引物僅擴(kuò)增不包含與基因重疊區(qū)域啟動(dòng)子片段部分，分別命名為PvpWRKYl和PvpWRKY2， 用目的啟動(dòng)子替換PCAMBIA1301的35S，使GUS處于克隆所克隆啟動(dòng)子控制下，構(gòu)建成 promoter: :GUS重組表達(dá)載體，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S啟動(dòng)子，利 用同尾酶互補(bǔ)將載體重新連接成沒(méi)有35S的⑶S載體，命名為w/o35S:⑶S，pCAMBIA1301 做為陽(yáng)性對(duì)照，即35組成型啟動(dòng)GUS表達(dá)；PvpffRKYl: GUS 上游引物gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTG PvpffRKYl: GUS 下游引物gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAA PvpffRKY2 :GUS 上游引物gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC PvpffRKY2 :GUS 下游引物gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG以TA連接好的載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR回收產(chǎn)物與PCAMBIA1301空載體分別 進(jìn)行^CbaI和NcoI雙酶切后，PCR與載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后送測(cè)序保證重組載體中 啟動(dòng)子插入位置正確無(wú)誤；3. b電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備3. b. 1將LBA4404菌株接種于20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福平終濃度的LB 液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)M小時(shí)，3. b. 2將培養(yǎng)好的菌液加入IOOml新鮮LB中至OD值0. 2，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至OD值0. 6，3. b. 3從搖床中取出菌液，冰浴15分鐘，· 3. b. 4菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管，4°C 5000rpm離心15分鐘，棄上清， 3. b. 5用冰浴的滅菌ddH20 35ml重懸細(xì)胞，離心，棄上清，重復(fù)用ddH20洗一次， 3. b. 6用冰浴的滅菌10%甘油25ml輕柔重懸浮細(xì)胞，離心，沉淀會(huì)很松散，棄上清，重 復(fù)用10%甘油洗一次，·3. b. 7用2ml冰浴后的10%甘油重懸細(xì)胞即成感受態(tài)細(xì)胞，·3. b. 8將感受態(tài)細(xì)胞按100 μ 1分裝到1. 5ml離心管，立即置于冰上準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)化；·3. c農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，·3. c. 1將測(cè)序正確的promoter: :GUS菌液及陰性對(duì)照w/0;35S: :GUS和pCAMBIA1301提 取質(zhì)粒后，用50ul無(wú)菌ddH20溶解備用，·3. c. 2將電轉(zhuǎn)化用的電極杯及蓋子用ddH20洗凈后，80%乙醇侵泡5分鐘，用紫外交聯(lián) 儀紫外線照射30分鐘以除去殘留DNA，并將溫度設(shè)置為30°C烘干電極杯， 3. c. 3將電極杯蓋好與感受態(tài)細(xì)胞一起分別置于冰上預(yù)冷20分鐘， 3. c. 4加入ddH20溶解的質(zhì)粒0. 2ul于感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吸打混勻繼續(xù)冰浴30分鐘， 3. c. 5將混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使均勻進(jìn)入電極杯底部且 內(nèi)部不產(chǎn)生氣泡，·3. c. 6打開電穿孔儀，選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化模式，調(diào)節(jié)電壓至1. 8KV， 3. c. 7將電極杯側(cè)面用吸水紙完全拭干后按狹縫向前方向放入卡槽中， 3. c. 8將卡槽推入電轉(zhuǎn)化儀，按start鍵，聽到兩聲輕微蜂鳴后，取出電極杯置于冰上， 待最后一個(gè)樣品電擊完畢，在超凈臺(tái)內(nèi)向每個(gè)電極杯中加200 μ 1液體LB將細(xì)胞洗出并移 入1. 5ml離心管中，至于培養(yǎng)1. 5小時(shí)后涂布于篩選平板上，·3. c. 9對(duì)篩選出的菌落進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)陽(yáng)性菌進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得工程菌； 3. d工程菌轉(zhuǎn)化葡萄葉片，誘導(dǎo)啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，用真空滲透法將工程菌轉(zhuǎn)化入葡萄葉 片，并在接種前后染色，獲得報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)，·3. d. 1將含有目地質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液接種到20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福平 終濃度的LB液體培養(yǎng)基，28°C,200rpm振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，·3. d. 2將5ml培養(yǎng)液加入200ml新鮮含有相同抗生素的LB在^°C、200rpm振蕩培養(yǎng) 16小時(shí)，·3. d. 3在5000rpm離心10分鐘，棄上清，用20ml重懸液重懸菌體至OD值0. 6，重懸液 配制10mM MES pH 5. 6, IOmM MgCL2, 2% (ff/V)蔗糖，150 μ M乙酰丁香酮，將配好的重懸液 高壓滅菌15分鐘，冷卻備用，·3. d. 4將大小薄厚一致的葡萄葉片均勻加入培養(yǎng)好的菌液中，菌液深度不超過(guò)1. 5cm, 在真空泵壓力0. 085-0. 09MPa下抽真空45分鐘，·3. d. 5擦去葉片表面菌液，正面朝上將葉柄固定于濕潤(rùn)的脫脂棉內(nèi)，放于托盤中，覆蓋 帶孔保鮮膜，于27°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)16小時(shí)，再在弱光下培養(yǎng)至3天，期間噴霧保濕，·3. d. 6每處理取出半數(shù)葉片，用去離子水沖洗，基中兩片用于蛋白測(cè)定，其余放入GUS 染色液中再抽真空10分鐘，37°C染色，·3. d. 7對(duì)另半數(shù)葉片用壓片法接種葡萄白粉菌，壓片前預(yù)先噴霧無(wú)菌水使葉片上有微 小液滴，但無(wú)明顯露點(diǎn)出現(xiàn)，從田間采摘發(fā)病嚴(yán)重且一致的葉片對(duì)轉(zhuǎn)化葉片進(jìn)行壓片接種， 壓片時(shí)間5秒，壓片后繼續(xù)覆蓋帶孔保鮮膜保濕，12小時(shí)后取兩片用于蛋白測(cè)定，其余放入GUS染色液中染色；3. e轉(zhuǎn)基因葡萄葉片病原誘導(dǎo)GUS活性的定量檢測(cè)⑶S活性檢測(cè)方法按Jefferson經(jīng)典方案，以4_甲基傘形酮酰-β -D-葡萄糖酸苷 (4-MUG)為底物，GUS催化使之水解為4-甲基傘形酮G-MU)與β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分 子中的羥基解離后被365nm的光激發(fā)，產(chǎn)生455nm的熒光，熒光值由熒光分光光度計(jì)測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啟動(dòng)子快速克隆法，以克隆獲得兩個(gè)葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)建啟動(dòng)子::報(bào)告基因融合載體，兩個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)報(bào)告基因在葡萄葉片中的表達(dá)受白粉菌誘導(dǎo)，為葡萄抗病基因工程提供病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆方法并成功應(yīng)用于葡萄抗病育種中?？寺〉膬蓚€(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均能在病原菌侵染時(shí)以精準(zhǔn)方式調(diào)控轉(zhuǎn)入外源基因，使轉(zhuǎn)入基因僅在受病原菌誘導(dǎo)的條件下被啟動(dòng)表達(dá)，在葡萄抗病育種中，僅需把重組載體中啟動(dòng)子所啟動(dòng)的報(bào)告基因換成任何抗病基因，即可轉(zhuǎn)化葡萄獲得病原菌誘導(dǎo)表達(dá)外源抗病基因的轉(zhuǎn)化植株，減少抗病基因工程育種中組成型啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)基因葡萄造成的負(fù)面影響，最大限度發(fā)揮轉(zhuǎn)基因優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102121004SQ20101058255
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者周起, 朱自果, 李慧娥, 王躍進(jìn), 謝小青 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)