專利名稱：一種白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)并再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物誘導(dǎo)再生技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)并再生植株的方法。
背景技術(shù)：
白鶴芋QSpathiphylIum Schott)為又稱白掌或一帆風(fēng)順，原產(chǎn)中南美洲，是重要的熱帶觀賞植物，在歐美市場備受歡迎。上世紀(jì)80年代引入我國大陸，迅速發(fā)展形成產(chǎn)業(yè)， 成為我國最重要的熱帶觀賞植物之一。白鶴芋植物組織培養(yǎng)自20世紀(jì)70年代以來相繼有所報(bào)道，主要利用頂芽和莖段等外植體誘導(dǎo)獲得叢生芽，以叢生芽增殖的方式擴(kuò)大繁殖數(shù)量，再以生根培養(yǎng)獲得完整植株，其目的是實(shí)現(xiàn)離體快速繁殖，擴(kuò)大稀有品種資源的個體數(shù)量，滿足育種和生產(chǎn)的需要。曹靜等(1995)和朱根發(fā)(2004)以幼嫩佛焰苞花序?yàn)橥庵搀w，經(jīng)培養(yǎng)獲得體細(xì)胞胚并再生植株。Werbrouck等(2000)、Eeckhaut T等(2001)和秦靜遠(yuǎn)(2005)等報(bào)道了用幼嫩佛焰苞花序進(jìn)行培養(yǎng)時，從雄蕊花絲部位誘導(dǎo)產(chǎn)生了體細(xì)胞胚。這些誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)材料均為花器官，屬生殖器官組織。從報(bào)道看誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的效率比較低，一般每個外植體上只能產(chǎn)生單個或十幾個體細(xì)胞胚；外植體的采集也需在開花季節(jié)，受到植物生長發(fā)育時限限制較大。目前，在白鶴芋上還未見從營養(yǎng)器官如葉片或葉柄等外植體成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚并再生植株的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)植株再生技術(shù)從材料和方法上進(jìn)行創(chuàng)新， 提供一種以營養(yǎng)器官一幼嫩試管苗葉片或葉柄作為外植體，高效率的誘導(dǎo)體細(xì)胞胚并再生植株的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)并再生植株的方法，利用外植體材料誘導(dǎo)，所采用的外植體材料為白鶴芋幼嫩試管苗葉片或葉柄。具體包括如下步驟
(1)后柱體細(xì)胞胚誘導(dǎo)。取白鶴芋屬植物5⑵/Wi/Wi 的莖段或頂芽，經(jīng)消毒處理， 接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得無菌的試管苗，然后轉(zhuǎn)移至試管苗增殖培養(yǎng)基中，在溫度 2Γ30 °C、光照強(qiáng)度為1000 1400 lux，每日10 14小時光照的環(huán)境中，每3-4周繼代一次， 試管苗不斷增殖。將幼嫩試管苗葉片切成廣10毫米寬的條塊，或?qū)⑷~柄切成廣10毫米的截段，然后接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度M 30 °C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)3飛周，獲得體細(xì)胞胚。
(2)體細(xì)胞胚的增殖。將獲得的體細(xì)胞胚繼代培養(yǎng)于體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中，在溫度2Γ30 °C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)2、周后，體細(xì)胞胚大量增殖。(3)植株再生。將獲得的體細(xì)胞胚接種至植株再生培養(yǎng)基中，在溫度M 30 °C、光照強(qiáng)度為100(T1400 lux，每日1(Γ14小時光照培養(yǎng)2、周，體細(xì)胞胚萌發(fā)，獲得完整再生植株。在上述方法中，步驟(1)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每 1升培養(yǎng)基中添加了 3. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為5. 6^6. 0 ；步驟(1)所述試管苗增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每1升培養(yǎng)基中添加了 2. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、 20^40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為5. 6^6. 0 ；步驟(1)所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有1. (Γ3. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤或0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5 2. 0毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、20 40克的蔗糖和6、克的瓊脂，PH值為5. 6^6. 0 ；步驟(2)所述體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基， 同時每1升培養(yǎng)基中還含有1. (Γ3. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤或0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5 1. 0毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6 9克的瓊脂，ρΗ值為5. 6 6. 0 ； 步驟(3)所述植株再生培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有 0. 5^1. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2毫克的α -奈乙酸或0. Γθ. 2毫克的吲哚丁酸，2(Γ40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為5.6飛.O ；所述MS培養(yǎng)基由濃度為1900 mg · Γ1 的 KNO3,濃度為 1650 mg · Γ1 的 NH4NO3,濃度為 170 mg · Γ1 的 KH2PO4,濃度為 370 mg
Γ1 的 MgSO4 · 7H20，濃度為 440 mg · Γ1 的 CaCl2 · 2H20，濃度為 0. 83 mg · Γ1 的 KI，濃度為 6. 2 mg · L-1 的 H3BO3,濃度為 22. 3 mg · L-1 的 MnSO4 · 4H20，濃度為 8.6 mg · L-1 的 ZnSO ·7Η20，濃度為 0. 25 mg · L—1 的 Na2MoO4 · 2H20，濃度為 0. 025 mg · L—1 的 CuSO4 ·5Η20， 濃度為 0.025 mg · Γ1 的 CoCl2 ·6Η20，濃度為 37. 25 mg · Γ1 的 Na2EDTA,濃度為 27. 85 mg
L-1的FeSO4 · 7H20，濃度為100 mg · L-1的肌醇，濃度為2. O mg · L-1的甘氨酸，濃度為 0.4 mg · L—1的維生素B1,濃度為0.5 mg · L—1的維生素B6,濃度為0. 5 mg · L—1的煙酸組成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有明顯進(jìn)步
(1)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效率明顯提高。由于白鶴芋的花器官與葉片或葉柄在器官組織結(jié)構(gòu)和內(nèi)源激素水平上的不同，導(dǎo)致了體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效率明顯差異。雖然現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的以幼嫩的花器官為外植體體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率可達(dá)96. 59TlOO%，但在每塊外植體表面至多形成十幾個體細(xì)胞胚。本發(fā)明以葉片或葉柄為外植體，不僅體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率可達(dá)979Γ100%，而且每塊外植體表面能夠形成多達(dá)5(Γ200個體細(xì)胞胚，誘導(dǎo)效率明顯提高。(2)外植體材料容易獲得。本發(fā)明所用的試管苗由莖段或頂芽誘導(dǎo)獲得后，可以通過組織培養(yǎng)大量擴(kuò)繁，取材十分方便。
實(shí)施例實(shí)施例1 本實(shí)施例通過以下步驟進(jìn)行的
(1)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)。取白鶴芋屬植物5⑵/Wi/Wi 的莖段或頂芽，經(jīng)消毒處理，接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得無菌的試管苗，然后轉(zhuǎn)移至試管苗增殖培養(yǎng)基中，在溫度 2Γ30 °C、光照強(qiáng)度為1000 1400 lux，每日10 14小時光照的環(huán)境中，每3-4周繼代一次，試管苗不斷增殖。將幼嫩試管苗葉片切成廣10毫米寬的條塊，接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度M 30 °C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)2、周，獲得體細(xì)胞胚；
(2)體細(xì)胞胚的增殖將獲得的體細(xì)胞胚繼代培養(yǎng)于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度 2Γ30 °C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)2、周后，體細(xì)胞胚大量增殖；
(3)植株再生將獲得的體細(xì)胞胚接種至植株再生培養(yǎng)基中，在溫度M 30°C、光照強(qiáng)度為100(T1400 lux，每日1(Γ14小時光照的環(huán)境中培養(yǎng)2、周，體細(xì)胞胚萌發(fā)，獲得完整再生植株。上述步驟(1)中的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每1升培養(yǎng)基中添加了 3. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的瓊脂，PH值為5. 6^6. 0 ；步驟(1)所述試管苗增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每 1升培養(yǎng)基中添加了 2. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為5. 6^6. 0步驟(1)中的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有1. (Γ3. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤、0. 5^2. 0毫克的 2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為5. 6飛.0 ；步驟(2)中的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有1. (Γ3. 0毫克的 6-芐基氨基腺嘌呤、0. 5^1. 0毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的瓊脂， PH值為5. 6飛.0 ；步驟(3)中的植株再生培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有0. 5 1. 0毫克的6-芐基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2毫克的α -奈乙酸，20^40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為5. 6^6. O。按上述條件培養(yǎng)，有979Γ100%的外植體能夠誘導(dǎo)形成體細(xì)胞胚，每塊外植體表面上可以形成5(Γ200個體細(xì)胞胚。獲得的體細(xì)胞胚中，有859Γ95%可以萌發(fā)形成完整小植株。實(shí)施例2 本實(shí)施例與實(shí)施例1不同的是步驟(1)中將試管苗葉柄切成廣10毫米截段，然后接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得體細(xì)胞胚；其余與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3 本實(shí)施例與實(shí)施例1或2不同的是步驟(1)中體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基以 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且每1升培養(yǎng)基中含有0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5^2. O毫克的 2，4-二氯苯氧乙酸、20 40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為5. 6飛.O ；步驟(2)中體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且每1升培養(yǎng)基中含有0. 05、. 25毫克的噻苯隆、 0. 5 1. O毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6 9克的瓊脂，ρΗ值為5. 6 6. O ；其余與實(shí)施例1或2相同。實(shí)施例4 本實(shí)施例與實(shí)施例1、2或3不同的是步驟(3)中植株再生培養(yǎng)基以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且每1升培養(yǎng)基中含有0. 5^1. O毫克的6-芐基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2 毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6 9克的瓊脂，ρΗ值為5. 6 6. O ；其余與實(shí)施例1、2 或3相同。
權(quán)利要求
1.一種白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)并再生植株的方法，利用外植體材料誘導(dǎo)，其特征在于，所采用的外植體材料為白鶴芋葉片或葉柄或其混合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步驟(1)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)取白鶴芋幼嫩試管苗，將葉片切成廣10毫米的條塊，或?qū)⑷~柄切成 Γιο毫米的截段，然后接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度M 30 °C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng) 3飛周，獲得體細(xì)胞胚；(2)體細(xì)胞胚的增殖將獲得的體細(xì)胞胚繼代培養(yǎng)于體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中，在溫度 2Γ30 °C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)2、周后，體細(xì)胞胚大量增殖；(3)植株再生將獲得的體細(xì)胞胚接種至植株再生培養(yǎng)基中，在溫度M 30°C、光照強(qiáng)度為100(T1400 lux，每日1(Γ14小時光照環(huán)境中培養(yǎng)2、周，體細(xì)胞胚萌發(fā)，獲得完整再生植株。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有ι. (Γ3. O毫克的6-芐基氨基腺嘌呤或 0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5 2. O毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、20 40克蔗糖和6、克瓊脂， PH 值為 5. 6^6. O。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基是以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有1. (Γ3. O毫克的6-芐基氨基腺嘌呤或 0. 05 0. 25毫克的噻苯隆、0. 5 1. O毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、20 40克的蔗糖和6 9克的瓊脂，PH值為5. 6 6. O。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述植株再生培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時每1升培養(yǎng)基中還含有0. 5^1. O毫克的6-芐基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2 毫克的α -奈乙酸或0. Γ0. 2毫克的吲哚丁酸，2(Γ40克的蔗糖和6、克的瓊脂，ρΗ值為 5. 6 6. O。
全文摘要
一種白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)并再生植株的方法，它涉及一種體細(xì)胞胚誘導(dǎo)植株再生的方法。方法1.取白鶴芋幼嫩試管苗，將葉片或葉柄，切成小片段進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得體細(xì)胞胚；2.將體細(xì)胞胚繼代培養(yǎng)于體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中大量增殖；3.將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至植株再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得完整小植株。本發(fā)明的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率達(dá)97%~100%，初次培養(yǎng)外植體表面即可形成多達(dá)50~200個體細(xì)胞胚，誘導(dǎo)效率顯著提高；所獲體細(xì)胞胚的植株再生率達(dá)85%~95%。本發(fā)明解決了現(xiàn)有白鶴芋體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效率低、外植體材料采集不便的問題。
文檔編號A01H4/00GK102388805SQ20111026708
公開日2012年3月28日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者于波, 劉曉榮, 劉金梅, 廖飛雄 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所