專(zhuān)利名稱(chēng)：一種菌肽活性蛋白飼料及其制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌肽活性蛋白飼料的制備方法及應(yīng)用，屬于漁業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著水產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，水產(chǎn)必需的蛋白飼料越來(lái)越缺乏。1980年全世界的水產(chǎn)業(yè)所需蛋白質(zhì)為2. 3億噸，1990年這個(gè)數(shù)字超過(guò)3. 2億噸，2000年這個(gè)數(shù)字已超過(guò)6億噸， 而到2006年這個(gè)數(shù)字達(dá)到13億噸左右。其中水產(chǎn)飼料的主要蛋白源是大米蛋白、棉粕、菜粕、酒糟等，因此，開(kāi)發(fā)新型的蛋白飼料源，提高飼料利用率和降低飼料生產(chǎn)成本成為目前飼料資源研究焦點(diǎn)。 酵母單細(xì)胞蛋白作為飼料具有明顯的優(yōu)勢(shì)如酵母干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量高達(dá)50% ； 酵母菌中含有豐富的酶類(lèi)；含有β _葡聚糖(57. 0%)、甘露寡糖(6. 6% )、糖蛋白(22. 0%) 和幾丁質(zhì)等活性成分；既對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有促生長(zhǎng)的作用，又可提高機(jī)體免疫，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物而言，酵母飼料是一種理想的生物活性蛋白質(zhì)飼料。又因酵母生產(chǎn)速度快，周期短，易于遺傳操作等特點(diǎn)，它是外源基因的理想表達(dá)受體系統(tǒng)。生長(zhǎng)激素(Growth hormone,GH)是包括魚(yú)類(lèi)在內(nèi)的所有脊椎動(dòng)物腦下垂體分泌的一種單鏈多肽激素，由于其具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，加速蛋白合成以及脂類(lèi)降解的生理功能(Donaldson et al.，1979)[1]，使得它在魚(yú)類(lèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有重大的作用，因而得到越來(lái)越廣泛的重視。人類(lèi)已利用基因工程技術(shù)合成了哺乳類(lèi)和魚(yú)類(lèi)的重組GH(rGH)，并證明 GH能被魚(yú)類(lèi)消化道完整吸收而進(jìn)入血液并保持促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的活性(Hertz Y，1991)[2]。肖東等，文(肖東，2000)[3]研究表明外源生長(zhǎng)激素在魚(yú)體內(nèi)24小時(shí)便會(huì)分解90%，4天內(nèi)全部消失，不會(huì)在魚(yú)體中累積。孫遜等(孫遜，1999)[4]，證實(shí)魚(yú)生長(zhǎng)激素對(duì)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)激素受體無(wú)任何活性。以上研究結(jié)果消除了人們對(duì)外源生長(zhǎng)激素的殘留和安全等疑慮。但天然的豬、牛、羊、雞、魚(yú)的生長(zhǎng)激素或利用基因工程菌產(chǎn)生人的生長(zhǎng)激素對(duì)魚(yú)生長(zhǎng)激素受體的結(jié)合活力要比魚(yú)本身生長(zhǎng)激素低150倍。這一結(jié)果提示，將魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因重組轉(zhuǎn)入益生素酵母中可以作為飼料廣泛應(yīng)用于淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中，這對(duì)開(kāi)發(fā)新型蛋白質(zhì)魚(yú)飼料具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將重組青魚(yú)生長(zhǎng)激素基因定向地整合到畢赤酵母中并使之高效表達(dá)，利用大米蛋白為培養(yǎng)物進(jìn)行生物發(fā)酵，開(kāi)發(fā)出一種綠色、安全、高效并含有魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素的新型飼料，以及該飼料的制備和應(yīng)用方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的?！N菌肽活性蛋白飼料的制備方法(1)在發(fā)酵罐中，含有以下質(zhì)量百分比組分的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)劑0.5-1%、 大米蛋白濃度6-7%、魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌種子液5-6%，其余為水；發(fā)酵的條件如下發(fā)酵時(shí)間96h，發(fā)酵溫度28-30°C，pH6. 0-7. 5，轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量3L/min ；
(2)對(duì)發(fā)酵得到的混合物進(jìn)行噴霧干燥即得；所述的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌是將青魚(yú)生長(zhǎng)激素cDNA定向插入含強(qiáng)啟動(dòng)子AOX I的表達(dá)載體pPIC 3. 5k，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC3. 5K_bcGH ；再將其電擊轉(zhuǎn) 化導(dǎo)入組氨酸缺陷型酵母GS115菌株得到，將獲得的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌經(jīng)過(guò)如下活化培養(yǎng)過(guò)程后得到發(fā)酵用的種子液取-80°C冰箱保藏的重組bcGH酵母菌種劃線(xiàn)轉(zhuǎn)接到MD平板， 30°C恒溫倒置培養(yǎng)3-5天，接1環(huán)生長(zhǎng)良好的MD平板種子至裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL 搖瓶中，置于300rpm恒溫?fù)u床，30°C振蕩培養(yǎng)菌液0D600至2_6，時(shí)間為10-24小時(shí)即可。步驟(1)中發(fā)酵時(shí)間96h，pH6. 5，魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌種子液6%，發(fā)酵溫度30°C，誘導(dǎo)劑濃度1%，大米蛋白濃度7%。步驟⑵所述的噴霧干燥的條件如下進(jìn)風(fēng)溫度110_130°C，進(jìn)風(fēng)速度 1. 00-1. 20m3/min，進(jìn)樣速度 12. 00ml/min。步驟⑵所述的噴霧干燥的條件優(yōu)選如下進(jìn)風(fēng)溫度120°C，進(jìn)風(fēng)速度1. IOm3/ min，進(jìn)樣速度 10. 00-14. OOml/min。所述的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟1)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的青魚(yú)GH基因序列AF389238設(shè)計(jì)引物，上游引物Pl :5，-ATG GCT AGA GCA TTA GTG CT-3，；下游引物P2 :5，-CTA CAG GGT GCA GTT GGA AT-3，；2)按照Invitrogen公司的Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取青魚(yú)腦垂體總RNA，根據(jù)invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成青魚(yú)cDNA第一鏈RNA模板5 μ L (1 μ g/ μ L)、1 μ L oligo (dT) 18 引物(0· 5 μ g/ μ L)、DEPC 處理的 ddH20 補(bǔ)足 12 μ L, 65 "C 水浴 5min ;300rpm 離心 30S，立即放在冰上 lmin，再依次加入 5 X Reaction Buffer 4μ L.40U/ μ LRNase 抑制齊[J 1 μ LUOmM/μ L dNTP Mix 2 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L (IU/μ L)，300rpm 離心 30S，立即放在42°C水浴60min，70°C終止反應(yīng)5min。青魚(yú)生長(zhǎng)激素基因cDNA片段克隆，反應(yīng)體系如下上述獲得的cDNA 2yL(lyg/ μ L)，10XPCR Buffer 2. 5μ L,25mmol MgCl2 L 5 μ L，IOmM/ μ L 引物 P1，P2 各 1 μ L, IOmM/ μ LdNTP 1 μ L, 5U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶 1 μ L, ddH20 補(bǔ)足為 20 μ L ；PCR 反應(yīng)流程為94°C 預(yù)變性 3min，94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 40C IOmin ；經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1，與預(yù)期結(jié)果一致。3)根據(jù)步驟2)得到的青魚(yú)生長(zhǎng)激素cDNA序列及表達(dá)載體pPIC 3. 5K多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)含EcoR I和Not I的酶切位點(diǎn)的特異性引物，擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的青魚(yú)生長(zhǎng)激素基因，以便構(gòu)建表達(dá)載體PPIC3. 5K-bcGH。引物序列如下 pPIC3. 5K-GHF 5’ GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATTAGTG-3’，pPIC3. 5K-GHR 5’ TATGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGGGTGCAGTTGGAAT-3’。其中，下劃線(xiàn)標(biāo)記的序列分別是EcoR I和Not I的酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。以步驟2)合成的cDNA為模板，用引物pPIC3. 5K-GHF，pPIC3. 5K-GHR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系東盛生物科技公司提供的2XlmL規(guī)格的2XPCR TaqMix 12. 5 μ L, IOmM/μ L 引物 pPIC3. 5K-GHF 和 pPIC3. 5K-GHR 各 1 μ L，(1 μ g/ μ L) cDNA 2 μ L，添力口 dd H2O 至25μ L ；PCR 擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性 3min，94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10min，4°C IOmin ；4)將步驟3 )得到的PCR產(chǎn)物回收純化后，用EcoR I和Not I雙酶切PCR產(chǎn)物，經(jīng)酚氯仿抽提后，與同樣進(jìn)行雙酶切并且經(jīng)堿性磷酸酶處理的PPIC3. 5K載體片段連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒pPIC3. 5K_bcGH ；5)將重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-bcGH電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入組氨酸缺陷型酵母GSl 15菌株(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)，獲得基因工程酵母菌。一種菌肽活性蛋白飼料是由上述的方法制備而成的飼料?？蓪暳现苯语曫B(yǎng)魚(yú)類(lèi)或者與魚(yú)類(lèi)飼料混合飼用。本發(fā)明利用甲基營(yíng)養(yǎng)型畢氏酵母Pichia Pastoris這一理想的真核蛋白高水平表達(dá)系統(tǒng)，將青魚(yú)魚(yú)生長(zhǎng)激素基因定向克隆到酵母整合型質(zhì)粒載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)， 獲得了高效表達(dá)的重組魚(yú)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌。通過(guò)以大米蛋白為發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行生物發(fā)酵，制備菌肽活性蛋白飼料，而后將飼料直接飼養(yǎng)魚(yú)類(lèi)或者與魚(yú)類(lèi)飼料混合飼用。在降低飼料生產(chǎn)成本的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)促生長(zhǎng)和提高抗病的作用，從而增加魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖效益。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；Lane M :DNA marker Lane 1-3 :RT_PCR 結(jié)果圖 2 為 pPIC3. 5K_bcGH 的 EcoR I/Not I 酶切電泳圖；1-6 :pPIC3. 5K_bcGH 的 EcoR I 和 Not I 酶切 M :DNA marker圖3為重組酵母菌落PCR圖；1-4 重組酵母 PCR 結(jié)果 M :DNA marker圖4為pPIC 3. 5k_bcGH重組酵母菌的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE(12% )；1陰性對(duì)照，M :Marker，2-7誘導(dǎo)24小時(shí)取樣培養(yǎng)基PH分別為4. 5,5. 5,6. 0,6. 5， 7. O圖5為pPIC 3. 5k_bcGH重組酵母菌的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE(12% )；1-6和7-12分別是誘導(dǎo)48小時(shí)和72小時(shí)取樣培養(yǎng)基PH分別為4. 5,5. 5,6. 0， 6. 5,7. OM :Marker圖6為純化bcGH的SDS-PAGE結(jié)果；1 7 純化的bcGH，M 蛋白marker，8 未純化蛋白圖7為蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖8為發(fā)酵時(shí)間對(duì)重組bcGH酵母表達(dá)量影響；1、未誘導(dǎo)；2、蛋白質(zhì)Marker ；3 7、誘導(dǎo)時(shí)間分別為96h、72h、48h、24h、12h圖9為發(fā)酵溫度對(duì)重組bcGH酵母表達(dá)量影響；1、蛋白質(zhì)Marker ；2 6、發(fā)酵溫度分別為32°C、30°C、28°C、26°C、24°C;7、未誘導(dǎo)圖10為種子液接種量對(duì)重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；1、未誘導(dǎo)；2 6、接種量分別為2%,3%,4%,5%,6% ；7、蛋白質(zhì)Marker圖11為大米蛋白濃度對(duì)重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；1、蛋白質(zhì)Marker ;2 6、大米蛋白濃度分別為7%、6%、5%、4%、3% ；7、未誘導(dǎo)圖12為甲醇濃度對(duì)重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；
1、蛋白質(zhì) Marker ；2 6、甲醇濃度分別為2. 5%,2%U. 5%U%>0. 5% ；7、未誘
導(dǎo)

圖13為pH值對(duì)重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；1、蛋白質(zhì) Marker ；2 6、pH 值分別為8. 0,7. 5,7. 0,6. 5,6. 0 ；7、未誘導(dǎo)
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例11、生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌的構(gòu)建根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的青魚(yú)GH基因序列(AF389238)設(shè)計(jì)引物。上游引物 Pl 5'-ATG GCT AGA GCA TTA GTG CT-3，。下游引物P2 5'-CTA CAG GGT GCA GTTGGMT-3，。參照invitrogen公司的Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取青魚(yú)腦垂體總RNA。根據(jù) invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成青魚(yú)cDNA第一鏈RNA模板5 μ L(1 μ g/μ L)、 IyL oligo(dT)18 引物(0· 5 μ g/μ L)、DEPC 處理的 ddH20 補(bǔ)足 12μ L，65°C 水浴 5min ； 300rpm 離心 30S，立即放在冰上 lmin，再依次加入 5XReaction Buffer 4μ L、40U/y L RNase 抑制劑 1 μ LUOmM/μ L dNTP Mix 2 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L(1U/μ L)，300rpm 離心 30S， 立即放在42°C水浴60min，70°C終止反應(yīng)5min。再準(zhǔn)備青魚(yú)生長(zhǎng)激素基因cDNA片段克隆，反應(yīng)體系如下上一步獲得的 cDNA 2 μ L(1 μ g/μ L), 10XPCR Buffer 2. 5μ L,25mmol MgCl2 1.5口1^，101111/^1^引物？1，？2各1口1^，101111/^1^ dNTP 1 μ L，5U/μ L 的 Taq DNA 聚合酶1 μ L，ddH20補(bǔ)足為20 μ L ；PCR反應(yīng)流程為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸lmin, 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin, 4°C IOmin ；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1， 與預(yù)期結(jié)果一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，與pEASY-Tl cloning vector (購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)連接。反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物1μ 1，pEASY-Tl cloning vector 1 μ 1，室溫反應(yīng)5min，再置于冰上終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α (購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司)，挑取白色克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證過(guò)的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送交上海生工測(cè)序分析。測(cè)序所得結(jié)果與GeneBank上傳的基因序列一致(馮浩，2002)[5]說(shuō)明成功地克隆出了青魚(yú)生長(zhǎng)激素基因。根據(jù)前面得到的青魚(yú)生長(zhǎng)激素cDNA序列和表達(dá)載體pPIC 3. 5K(購(gòu)自寶生物工程 (大連)有限公司)多克隆位點(diǎn)，運(yùn)用Seqencer軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物pPIC3. 5K-GHF :5， -GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATTAGTG-3’，pPIC3. 5K-GHR :5’ -TATGCGGCCGCTTAATGATGATGATG ATGATGCAGGGTGCAGTTGGAAT-3’。以合成的cDNA 為模板，用引物 pPIC3. 5K-GHF，pPIC3. 5K-GHR 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 體系東盛生物科技公司提供的2XlmL規(guī)格的2XPCR TaqMix 12. 5 μ L，IOmM/μ L引物 pPIC3. 5K-GHF 和 pPIC3. 5K-GHR 各 1 μ L，(1 μ g/μ L) cDNA2 μ L，添力口 dd H2O 至 25 μ L ；PCR 擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin, 30個(gè)循環(huán)，72°C 延伸10min，4°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，用EcoR I和Not I雙酶切PCR 產(chǎn)物，經(jīng)酚氯仿抽提后，與同樣進(jìn)行雙酶切并且經(jīng)堿性磷酸酶處理的PPIC3. 5K載體片段連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，菌落PCR，EcoR I和Not I雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)一步測(cè)序分析。將獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為PPIC3.漲-bcGH，結(jié)果見(jiàn)圖 2 (Lane 1-6 :pPIC3. 5K_bcGH 的 EcoR I 和 Not I 酶切 Lane M :DNA marker)酵母感受態(tài)的制備參考文獻(xiàn)(Frederick MA，1995) 。于液氮中取出Gsll5酵母感受態(tài)，將其立即置于冰上至剛?cè)?，加線(xiàn)性化的PPIC3. 5K-bcGH重組載體(5 10 μ g)與 (isll5酵母(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. Icm電轉(zhuǎn)杯中；在冰上放置5min ；按電壓600V，電阻400 Ω，電容25 μ F的條件進(jìn)行電擊；立即加入ImL 預(yù)冷的IM山梨醇至杯中，立即涂于MD平板上QOO μ L每平板)；30°C倒置培養(yǎng)3 4d，至克隆(His+轉(zhuǎn)化子)產(chǎn)生。把MD平板上的pPIC3. 5K-bcGH畢赤酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行YPD平板 (G418的濃度分別為1. 0,2. 0和3. Omg/ml)梯度篩選多拷貝，30°C培養(yǎng)3 4d。把生長(zhǎng)良好的高抗性轉(zhuǎn)化子O. Omg/ml以上)通過(guò)PCR法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。結(jié)果見(jiàn)圖3 (Lane 1 4 重組酵母 PCR 結(jié)果 Lane M :DNA marker)挑取陽(yáng)性酵母單菌落，接種至BMGY培養(yǎng)基中，30°C，300r/min培養(yǎng)至0D600達(dá)到 2 6，離心收菌，并重懸于BMMY培養(yǎng)基(pH為6. 0)，30°C，300r/min,培養(yǎng)4天，每24h補(bǔ)加終濃度為(ν/ν)的甲醇誘導(dǎo)。收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果見(jiàn)圖4(Lane 1陰性對(duì)照，LaneM :Marker，Lane 2 7誘導(dǎo)M小時(shí)取樣，培養(yǎng)基pH分別為4. 5，5. 5，6. 0，6. 5， 7. 0.)和圖 5 (Lanel 6 誘導(dǎo) 48 小時(shí)取樣，Lane M =Marker)。誘導(dǎo)后，離心收集菌體，根據(jù)QIAGEN的操作手冊(cè)裂解和消化菌體，用Ni Sepharose High Performance純化蛋白。洗脫的樣品裝入截留分子量為3kD的透析袋后，放入1L0. 9% NaCl溶液中，4°C透析。透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)定量。以鼠抗青魚(yú)生長(zhǎng)激素為一抗，羊抗小鼠IgG為二抗，顯色底物為3’ 3’ 5’ 5’ -四甲基聯(lián)苯胺[TMB]。分別用免疫前的小鼠血清和PBST作陰性對(duì)照和空白對(duì)照。重組酵母工程菌(isll5在pH6. 5的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)7 后，菌液經(jīng)液氮、玻璃珠的裂解，Ni-NTAMagnetic Agarose Bead吸附帶6x組氨酸標(biāo)簽的重組青魚(yú)生長(zhǎng)激素多肽。經(jīng)過(guò)親和吸附后，只留下經(jīng)誘導(dǎo)的菌株表達(dá)的青魚(yú)生長(zhǎng)激素的融合蛋白，詳細(xì)見(jiàn)圖6。純化產(chǎn)物分別稀釋2000倍、4000倍、8000倍、16000 倍、32000倍、64000倍，一抗分別稀釋1000倍、2000倍、4000倍、8000倍，同時(shí)做陰性對(duì)照和空白對(duì)照，ELISA檢測(cè)蛋白免疫原性。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 :bcGH 的 Elisa 分析
權(quán)利要求
1.一種菌肽活性蛋白飼料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)在發(fā)酵罐中，含有以下質(zhì)量百分比組分的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)劑0.5-1%、大米蛋白濃度6-7%、魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌種子液5-6%，其余為水；發(fā)酵的條件如下 發(fā)酵時(shí)間96h，發(fā)酵溫度^-30°C，pH6. 0-7. 5，轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量3L/min ；(2)對(duì)發(fā)酵得到的混合物進(jìn)行噴霧干燥即得；所述的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌是將青魚(yú)生長(zhǎng)激素cDNA定向插入含強(qiáng)啟動(dòng)子 AOX I的表達(dá)載體pPIC3.證，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC3. 5K-bcGH ；再將其電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入組氨酸缺陷型酵母GS115菌株得到，將獲得的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌經(jīng)過(guò)如下活化培養(yǎng)過(guò)程后得到發(fā)酵用的種子液取_80°C冰箱保藏的重組bcGH酵母菌種劃線(xiàn)轉(zhuǎn)接到MD平板，300C 恒溫倒置培養(yǎng)3-5天，接1環(huán)生長(zhǎng)良好的MD平板種子至裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，置于300rpm恒溫?fù)u床，30°C振蕩培養(yǎng)菌液0D600至2_6，時(shí)間為10-24小時(shí)即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟1)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的青魚(yú)GH基因序列AF389238設(shè)計(jì)引物，上游引物 Pl :5，-ATG GCT AGA GCA TTA GTG CT-3，；下游引物 P2 :5，-CTA CAG GGT GCA GTT GGA AT-3，；2)提取青魚(yú)腦垂體總RNA，按RT-PCR進(jìn)行cDNA合成cDNA第一鏈合成1μ g/ μ L的 RNA 模板 5 μ L、0. 5 μ g/ μ L oligo (dT) 18 弓丨物 1 μ L、DEPC 處理的 ddH20 補(bǔ)足 12 μ L, 65°C水浴 5min ；300rpm 離心 30S，立即放在冰上 lmin，再依次加入 5 X Reaction Buffer4 μ L、40U/ μ L RNase 抑制劑 1 μ L、10mM dNTP Mix 2 μ L、IU/μ L 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L，300rpm 離心 30S，立即放在42°C水浴60min，70°C終止反應(yīng)5min ；再準(zhǔn)備PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下1 μ g/μ L cDNA 1 μ L, 10XPCR Buffer2. 5 μ L, 25mmol MgCl2 1.5口1^，101111/^1^弓|物卩1，卩2各1口1^，10讓01 dNTP 1 μ L，5u/μ L 的 Taq DNA 聚合酶1 μ L，ddH20補(bǔ)足為20 μ L ；PCR反應(yīng)流程為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 4°C IOmin ；3)根據(jù)步驟2)得到的青魚(yú)生長(zhǎng)激素cDNA序列和表達(dá)載體pPIC3.5K的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)含EcoR I和Not I的酶切位點(diǎn)的特異引物，pPIC3. 5K-GHF :5’ -GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATTAGTG-3’，pPIC3. 5K-GHR :5’ -TATGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGGGTGCAGTTGGAAT-3’ ；PCR體系2XPCR TaqMix 12. 5 μ L, IOmM/μ L pPIC3. 5K-GHF和pPIC3. 5K-GHR各 1 μ L， 1 μ g/ μ L 的 cDNA 2 μ L,添力口 ddH20 M 25 μ L ；PCR擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 4°C IOmin ；4)將步驟幻得到的PCR產(chǎn)物回收純化后，用EcoRI和Not I雙酶切PCR產(chǎn)物，經(jīng)酚氯仿抽提后，與同樣進(jìn)行雙酶切并且經(jīng)堿性磷酸酶處理的PPIC3.漲載體片段連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-bcGH ；5)將重組質(zhì)粒pPIC3.5K-bcGH電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入組氨酸缺陷型酵母GS115菌株，獲得基因工程酵母菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中發(fā)酵時(shí)間96h，pH6.5，魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌種子液6 %，發(fā)酵溫度30°C，誘導(dǎo)劑濃度1 %，大米蛋白濃度7%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的噴霧干燥的條件如下進(jìn)風(fēng)溫度110-130°C，進(jìn)風(fēng)速度1. 00-1. 20m7min，進(jìn)樣速度12. 00ml/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的噴霧干燥的條件如下進(jìn)風(fēng)溫度120°C，進(jìn)風(fēng)速度110m3/min，進(jìn)樣速度10. 00-14. OOml/min。
6.一種菌肽活性蛋白飼料，其特征在于，是由權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法制備而成的飼料。
7.權(quán)利要求6所述的菌肽活性蛋白飼料的應(yīng)用方法，其特征在于，將飼料直接飼養(yǎng)魚(yú)類(lèi)或者與魚(yú)類(lèi)飼料混合飼用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種菌肽活性蛋白飼料及其制備和應(yīng)用方法，利用甲基營(yíng)養(yǎng)型畢氏酵母Pichia Pastoris這一理想的真核蛋白高水平表達(dá)系統(tǒng)，將青魚(yú)魚(yú)生長(zhǎng)激素基因定向克隆到酵母整合型質(zhì)粒載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了高效表達(dá)的重組魚(yú)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌。通過(guò)以大米蛋白為發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行生物發(fā)酵，制備菌肽活性蛋白飼料，而后直接使用或者將其與常用魚(yú)類(lèi)飼料混合使用，在降低飼料生產(chǎn)成本的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)促生長(zhǎng)和提高抗病的作用，從而增加魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖效益。
文檔編號(hào)A23K1/18GK102318752SQ201110143400
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者劉臻, 張建社, 謝帝芝, 魯雙慶 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙學(xué)院