專利名稱：用于制造肽的方法
用于制造肽的方法
本申請要求美國臨時(shí)申請60/832,649的權(quán)益，其內(nèi)容通過參考并入本 申請中。
本發(fā)明涉及用于制造肽及其中有用中間體的方法。
肽類具有潛在的生物活性，并且現(xiàn)今已知相當(dāng)眾多的有用的基于肽之 藥物。具有生物活性的肽的一個(gè)具體實(shí)例是
Ac-Nle-Asp畫His畫D誦Phe-Arg-Trp誦Lys畫OH
(PT-141)，其是一種可用于治療勃起功能障礙的候選藥物(Drugs Fut 2004,29(6),第645頁)。對于這種分子已開發(fā)了不同的合成方法。例如， Flora等人在Bioorg. Med Chem. Lett. 2005 (1065-1068 )中描述了用于該 分子的一種固相肽合成策略。然而，這種方法需要使用昂貴的王氏樹脂
(Wang type resins )以及極其昂貴的保護(hù)及脫保護(hù)技術(shù)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可產(chǎn)業(yè)化的用于制造環(huán)狀肽的方法，其 具有提高的環(huán)狀產(chǎn)物產(chǎn)率。
因此，本發(fā)明涉及一種用于制造環(huán)狀肽的方法，該方法包括
(a)提^M合到梅里菲爾德型樹脂(Merrifield type resin)上的一種環(huán)狀
肽，以及
(b )通過酯交^^應(yīng)將該環(huán)狀肽從所*里菲爾德型樹脂上切下。
出人意料地，已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法允許利用低成本的試劑進(jìn)行工 業(yè)恥漠的環(huán)狀肽或肽衍生物的制造。在根據(jù)本發(fā)明的方法中獲得的環(huán)狀肽 具有高純度并且可以更容易地純化，根據(jù)本發(fā)明的方法避免了使用常用于 將肽M里菲爾德型樹脂上除去的HF。這是特別有利的，因?yàn)槭褂肏F 是利用梅里菲爾德型樹脂進(jìn)行工業(yè)目肽合成的一個(gè)障礙。
就本發(fā)明的目的而言，"梅里菲爾德型樹脂"旨在具體表示一種氯甲基化的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，其可任選地被取代基所取代。更特別地優(yōu) 選未經(jīng)取代的氯甲基化的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
在才艮據(jù)本發(fā)明的方法中，所述環(huán)狀肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)通常由2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20個(gè)^J^酸 構(gòu)成。該環(huán)狀肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)優(yōu)選地由5、 6、 7、 8、 9、 10、 11或12個(gè)^J^ 酸構(gòu)成，并且更優(yōu)選由6或7個(gè)M酸構(gòu)成。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述環(huán)狀肽優(yōu)選具有由羧基與M通過分子 內(nèi)>^應(yīng)所形成的酰胺鍵。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，有利地使用醇或石克醇(特別是烷基醇或烷基 硫醇)來進(jìn)行所述酯交^A應(yīng)，特別是C1-C3醇，優(yōu)選選自曱醇和乙醇。 更特別優(yōu)選的是曱醇。曱硫醇或乙疏醇是優(yōu)選的硫醇，特別是以其堿金屬 鹽的形式。
當(dāng)使用醇進(jìn)行該酯交M應(yīng)時(shí)，所負(fù)載的環(huán)化肽優(yōu)選懸浮在該醇中或 者在該醇與適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充溶劑之混合物中。
當(dāng)使用硫醇進(jìn)行該酯交M應(yīng)時(shí)，所負(fù)載的環(huán)化肽優(yōu)選懸浮在該硫醇 的鹽在適當(dāng)溶劑中的溶液中。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以適當(dāng)?shù)厥褂悯ソ粨Q反應(yīng)催化劑，其可選 自例如堿，特別是親核性堿例如胺(特別是叔胺)或具有空間位阻的醇鹽 (例如叔醇鹽，如叔丁醇鉀)、陰離子交換樹脂(特別是季銨型陰離子交 換樹月旨(quaternary anion-exchange resin ))以及特另'J選自氰4fc物和氟4匕 物的親核陰離子M金屬鹽(例如氰化鉀或氟化鉀)。叔胺特別是二異丙 基乙胺是優(yōu)選的，并且最優(yōu)選三乙胺。
當(dāng)使用酯交M應(yīng)催化劑時(shí)，其在催化劑/溶劑混合物中的濃度通常為 0.5~3摩爾/升，優(yōu)選為1~2.5摩爾/升，最優(yōu)選約2摩爾/升。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，使用氛基醇來進(jìn)行該酯交M應(yīng)，所述氨 基醇特別地是具有叔胺官能團(tuán)和伯醇官能團(tuán)的氨基醇，例如特別是2-二曱 基氨基乙醇。在這個(gè)實(shí)施方案中，因?yàn)榘被倌軋F(tuán)催化了該反應(yīng)，所以不 需要使用額外的催化劑。在這個(gè)實(shí)施方案中，可以避免使用有毒的催化劑， 例如在Savoie et al. Can J. Chem. 1974第2832-9頁中的鉈衍生物。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述酯交M應(yīng)通常在0。C~100°C的溫度 下進(jìn)行，優(yōu)選10。C 60。C。特別優(yōu)選約25°C的溫度。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述酯交M應(yīng)通常在大氣壓下進(jìn)行。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，游離的環(huán)狀肽酸可以從步驟(b)中得到的環(huán) 狀肽酯適當(dāng)?shù)孬@得，其通過與磁<^應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，所i2t^選自例如堿性的、季 銨或堿土金屬的氫氧化物或碳酸鹽。具體實(shí)例包括氫氧化四丁基銨、碳酸 鉀以及氫氧化鋰。優(yōu)選的是氫氧化鋰。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，切割通常在pH8 10下進(jìn)行。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述任選的切割通常在0。C~100°C的溫度 下進(jìn)行，優(yōu)選為10°C~60°C。特別優(yōu)選約25°C的溫度。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制造具有由羧基與氨基的分子內(nèi) 反應(yīng)形成之酰胺鍵的環(huán)狀肽的方法，該方法包括
(a) 提皿合到梅里菲爾德型樹脂上的線性肽，該線性肽包含具有游離 M的第一JL&酸以及具有游離g的第二M酸；
(b) 通過所述g與所述Jl^的分子內(nèi)反應(yīng)，對所負(fù)載的肽進(jìn)行環(huán)化；
(c) 通過酯交M應(yīng)將所負(fù)載的環(huán)化肽從該梅里菲爾德型樹脂上切下。
、在，個(gè)實(shí)施方'案、中i所，，性肽通常在酰胺鍵形成試劑的存在下進(jìn)，
劑，例如在Bodansky， M. ， Principles of Peptide Synthesis,第2版.Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993 ^描述的那些。酰胺鍵形成試劑的具體實(shí)例 選自混合酸酐以及其他酰化劑，例如活化酯或酰卣(例如氯曱酸異丁酯或 新戊酰氯)。它們可以是碳二亞胺(例如，1-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺)、活化的苯并三溱衍生物(DEPBT: 3-(二乙氧基磷,氧)-1，2,3-苯并三漆-4(3H)-酮)或苯并三唑的脲鐵(uronium)或磷総(phosphonium) 鹽衍生物。
一種優(yōu)選的酰胺鍵形成試劑是二環(huán)己1^碳二亞胺。已發(fā)現(xiàn)這種廉價(jià)的 試劑在環(huán)化反應(yīng)中提供良好的結(jié)果。本發(fā)明的方法還包括提供具有被保護(hù) 的氨基和,皮保護(hù)的氛基的線性肽前體。
在這個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基受到第一保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)。該第一保護(hù) 基團(tuán)選自例如可在使所述線性肽與所述梅里菲爾德樹脂相連接的鍵基本 保持完整的條件下被除去的保護(hù)基團(tuán)。此類保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選實(shí)例包括可通
過酸解被除去的M保護(hù)基團(tuán)，其選自例如叔丁氧羰基、對甲氧基千氧 基羰基、二苯基甲lt^羰基以及優(yōu)選地千l^羰基。這樣的保護(hù)基的其他 實(shí)例包括可通過用金屬或金屬化合物還原而被除去的M保護(hù)基團(tuán)，例如 三氯代乙氧基羰基。
在這個(gè)實(shí)施方案中，所述羧基受到第二保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)。該第二保護(hù) 基團(tuán)選自例如可在使所述線性肽與所述梅里菲爾德樹脂相連接的鍵基本 保持完整的條件下被除去的保護(hù)基團(tuán)。這樣的保護(hù)基的優(yōu)選實(shí)例包括可通 過酸解被除去的U保護(hù)基團(tuán)，例如選自對甲氧節(jié)基、二苯甲基以及優(yōu) 選地叔丁基。此類保護(hù)基團(tuán)的其他實(shí)例包括可通過用金屬或金屬化合物還 原而被除去的保護(hù)基團(tuán)，例如三氯乙基。
在這個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)先選擇可在單一反應(yīng)步驟中^L除去的第一和第 二保護(hù)基團(tuán)。相應(yīng)地，所述肽前體的保護(hù)基團(tuán)可以在單一反應(yīng)中被除去以 提供所述線性肽?？赏ㄟ^酸解在單一反應(yīng)步驟中被除去的第一和第二保護(hù) 基團(tuán)的合適組合的實(shí)例包括二苯基甲*^ /二苯甲基；對甲氧基節(jié)氧 基羰基/對甲氧節(jié)基，以及優(yōu)選地叔丁氧羰基/叔丁基。可通過用金屬或金 屬化合物還原在單一反應(yīng)步驟中被除去的第 一和第二保護(hù)基團(tuán)的合適組 合的實(shí)例包括三氯代乙Hi^^/三氯乙基。
當(dāng)通過酸解除去保護(hù)基團(tuán)時(shí)，合適的試劑選自例如全氟烷基羧酸以 及在有機(jī)溶劑中的HC1溶液，優(yōu)選極性有機(jī)溶劑(例如二噁烷或乙酸乙 酯)。用于酸解的試劑優(yōu)選三氟乙酸。
當(dāng)通過與金屬或金屬化合物反應(yīng)來除去保護(hù)基團(tuán)時(shí)，合適的試劑是例 如鋅金屬。
當(dāng)所述線性肽包含側(cè)鏈含有氛基的氨基酸時(shí)，才艮據(jù)本發(fā)明的方法是特 別適合的。側(cè)鏈含有氨基的氨基酸的實(shí)例包括賴氨酸、鳥氨酸、二M 丁酸以及二氨基丙酸。側(cè)鏈含有氨基的氨基酸的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是賴氨酸。
8在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述線性肽通過所述側(cè)鏈含有氨基的
M酸被鍵合到梅里菲爾德樹脂上。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所述線性肽可適當(dāng)?shù)匕瑐?cè)鏈含有氯基的氨 基酸。側(cè)鏈含有氯基的氨基酸的實(shí)例包括谷氨酸和天冬氨酸。 一個(gè)優(yōu)選實(shí)
例是天冬氨酸。
在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，所述線性肽同時(shí)包含側(cè)鏈含有氯基的氨基酸 以及側(cè)鏈含有Jl&的M酸。
以下序列
Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-梅里菲爾德樹月旨
是更特別優(yōu)選的。
所述側(cè)鏈羧基或側(cè)鏈氨基可通過上述各保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)。
本發(fā)明特別地涉及用于制造以下產(chǎn)物的方法 Ac國Nle-Asp-His-D-Phe畫Arg畫Trp-Lys畫OH,
該方法包括4^供
Ac畫Nle畫Asp國His畫D-Phe-Arg-Trp-Lys-梅里菲爾德樹脂，
通過所述a與所述Jl&的分子內(nèi)反應(yīng)對所負(fù)載的肽進(jìn)行環(huán)化，并通過酯 交M應(yīng)將所負(fù)載的環(huán)化肽從該梅里菲爾德型樹脂上切下。在該酯交換反 應(yīng)之后，通常進(jìn)行切除所述酯的操作(例如，特別是皂化反應(yīng))以得到所 述環(huán)狀肽酸。
本發(fā)明還涉及鍵合到所*里菲爾德型樹脂上的環(huán)狀肽。根據(jù)本發(fā)明 的所負(fù)載環(huán)狀肽優(yōu)選如上文所述。
本發(fā)明還涉及
P-Nle國Asp國His國D國Phe畫Arg-Trp-Lys-梅里菲爾德樹脂，其中P是JL&保護(hù)基團(tuán)，特別是?；?yōu)選乙?；?Ac )。
本發(fā)明還涉及 P-Nle畫Asp畫His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-梅里菲爾德樹脂， 其中P如上文所限定。
以下實(shí)例旨在以非限定性的方式對本發(fā)明進(jìn)行舉例說明:
本文4吏用的縮寫詞如下
Ac乙絲
Nle正亮氨酸
Asp天冬氨酸
His組氨酸
Phe苯丙氨酸
Arg精氨酸
Trp色氨酸
Lys賴氨酸
HF氟化氫
Fmoc9-芴甲氧g
Boc叔丁氧M
RCM氯甲基樹脂(梅里菲爾德樹脂
SPPS固相肽合成
Pbf2,2,4,6，7-五曱基二氫苯并呋喃，
Trt三苯甲基TFA 三氟乙酸DI 蒸餾的TIPS 三異丙基珪烷DTE 二硫蘇糖醇DCM 二氯甲烷IPA 異丙醇DIEA 二異丙基乙胺DMF 二曱基甲酰胺HOBT 羥基苯并三哇DCC 二環(huán)己差^碳二亞胺TEAP 磷酸三乙銨LiOH 氬氧化鋰實(shí)施例序列Ac-Nle-Asp畫His-D-Phe-Arg-Trp畫Lys畫OH將50 g的Fmoc-Lys(Boc)-RCM樹脂(取代度0.8 mmol/g)用于合成。 以10 ml/gm的濃度使用Fmoc SPPS策略進(jìn)4亍合成。4吏用以下Jl&酸衍生物進(jìn)行合成iiFmoc-Trp(Boc)-OHFmoc-Arg(Pbf)-OHFmoc畫D-Phe-OHFmoc畫His(Trt)-OHFmoc國Asp(OtBu)-OHFmoc-Me-OH脫保護(hù)使用乙酸酐進(jìn)行乙?；ㄟ^使用以下試劑對樹脂上的肽進(jìn)行脫保護(hù)84%TFA、 5%苯甲醚、5。/。蒸餾7JC、 3%苯曱硫醚、含2。/。DTE的30/。 TIPS。切割1~2小時(shí)。切除后使用的洗滌程序2xDCM1 xlPA2 x 5 % DIEA (在DCM中)，每次4分鐘(pH試紙檢測) 1 xDCM2x甲醇2xDCM 1 xDMF通過使用DMF中5當(dāng)量的HOBT/10當(dāng)量的DCC，在所述樹脂上進(jìn) 行環(huán)化反應(yīng)48~72小時(shí)。使用以下程序?qū)⑺鯦IU^樹脂上切下在室溫下，在15。/。TEA(在甲醇中)中將肽樹脂攪拌2天。在從樹脂 切下后，加入5%蒸餾水和5當(dāng)量的LiOH,并繼續(xù)攪拌2小時(shí)。加入乙酸以酸化反應(yīng)混合物。將樹脂濾出并用含30%乙腈的TFA A緩沖液進(jìn)行洗 滌。將濾液蒸發(fā)或用TFA A緩沖液稀釋直至有機(jī)溶劑組分低于20。/。。過 濾并純化溶液。純化TEAP體系以及l(fā)^的乙酸體系得到5.0486 g純CS341 (HPLC > 99 % )總產(chǎn)率12.3 %。
權(quán)利要求
1.用于制造環(huán)狀肽的方法，該方法包括(a)提供鍵合到梅里菲爾德型樹脂上的環(huán)狀肽，以及(b)通過酯交換反應(yīng)將該環(huán)狀肽從所述梅里菲爾德型樹脂上切下。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中使用C1-C3醇、優(yōu)選曱醇來進(jìn) 行所述酯交換反應(yīng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中使用烷基硫醇、優(yōu)選乙硫醇或 其鹽來進(jìn)行所述酯交M應(yīng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酯交換>^應(yīng) 在pH 8 ~ 10下進(jìn)行。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述環(huán)狀肽的環(huán) 狀結(jié)構(gòu)由2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20個(gè)^J^酸構(gòu)成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述環(huán)狀肽通過 形成該環(huán)狀結(jié)構(gòu)之一部分的^酸鍵合到所i^里菲爾德型樹脂上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述環(huán)狀肽具有 由g與^J^通過分子內(nèi)反應(yīng)而形成的酰胺鍵。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中鍵合到所*里菲爾德樹脂上 的所述環(huán)狀肽由以下方式提供(a) 提皿合到所g里菲爾德型樹脂上的線性肽，該線性肽包含具 有游離氨基的第一氨基酸以及具有游離羧基的第二氨基酸，并且(b) 通過該^與該#^的分子內(nèi)反應(yīng)將鍵合到所*里菲爾德型 樹脂上的所述線性肽環(huán)化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述線性肽在酰胺鍵形成試劑 存在下被環(huán)化，該酰胺鍵形成試劑選自混合酸酐、活化酯、?；?、碳二 亞胺、活化的苯并三噪衍生物以及苯并三唑的脲鎗或磷鐵鹽衍生物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，該方法還包括提^合到所述 梅里菲爾德型樹脂上的線性肽前體，該線性肽前體具有被保護(hù)的氨基和被 保護(hù)的氛基。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述氨基受到第一保護(hù)基團(tuán) 的保護(hù)，該第一保護(hù)基團(tuán)選自能夠通過酸解被除去的^J^呆護(hù)基團(tuán)，其選自例如叔丁氧g、對甲HJ^IU^^、 二苯曱li^a^以及優(yōu)選地千氧基羰基，所述羧基受到第二保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)，該第二保護(hù)基團(tuán)選自能夠 通過酸解被除去的g保護(hù)基團(tuán)，其選自例如對甲氧節(jié)基、二苯甲基以及優(yōu)選地叔丁基。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中保護(hù)基團(tuán)的除去通過與三氟 乙i^應(yīng)來進(jìn)行。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述氨基受到第一保護(hù)基團(tuán) 的保護(hù)，該第一保護(hù)基團(tuán)選自能夠通過用金屬或金屬化合物還原而被除去 的JL^保護(hù)基團(tuán)，所述羧基受到第二保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)，該第二保護(hù)基團(tuán)選 自能夠通過用金屬或金屬化合物還原而被除去的a保護(hù)基團(tuán)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中保護(hù)基團(tuán)的除去通過與鋅金 屬>^應(yīng)來進(jìn)行。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述線性肽前 體的保護(hù)基團(tuán)在單一反應(yīng)中被除去以提供所述線性肽。
16. 根據(jù)權(quán)利要求7至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中鍵合到所* 里菲爾德型樹脂上的線性肽包含側(cè)鏈含有氛基的氣基酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述側(cè)鏈含有氨基的氨基酸 是賴氨酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述線性肽通過所述側(cè) 鏈含有氨基的^酸鍵合到所*里菲爾德樹脂上。
19. 根據(jù)權(quán)利要求7至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述線性肽包 含側(cè)鏈含有絲的絲酸。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述酯交換 反應(yīng)之后進(jìn)行切除所述酯的操作，例如特別是皂化反應(yīng)，以得到環(huán)狀肽酸。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中鍵合到所* 里菲爾德樹脂上的環(huán)狀肽是Ac醒Nle-Asp-His-D-Phe國Arg-Trp-Lys國梅里菲爾德樹脂。I_I
22. 鍵合到梅里菲爾德型樹脂上的環(huán)狀肽。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的環(huán)狀肽，該環(huán)狀肽是 P國Nle-Asp-His-D畫Phe-Arg畫Trp-Lys-梅里菲爾德樹脂，其中P是Jl&保護(hù)基團(tuán)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的環(huán)狀肽，其中P是乙酰基。
25. 鍵合到梅里菲爾德型樹脂上的線性肽，其具有下式 P畫Nle-Asp-His-D-Phe誦Arg-Trp畫Lys國梅里菲爾德樹脂，其中P是^J^保護(hù)基團(tuán)。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的線性肽，其中P是乙g。
全文摘要
用于制造環(huán)狀肽的方法，該方法包括提供鍵合到梅里菲爾德型樹脂上的環(huán)狀肽以及通過酯交換反應(yīng)將該環(huán)狀肽從所述梅里菲爾德型樹脂上切下。
文檔編號C07K7/00GK101516903SQ200780034795
公開日2009年8月26日 申請日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者伯恩哈德·弗賴曼, 希馬·喬希, 曼紐爾·拉莫斯, 羅蘭·卡倫斯, 薩蒂什·喬希 申請人:索爾維公司