專利名稱：聚β-羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其是一種聚β-羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方 法。
背景技術(shù)：
抗生素在一定程度上可以預(yù)防和控制水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌病的流行，但不加選擇地濫用 抗生素不僅可使細(xì)菌產(chǎn)生多重抗藥性，而且還會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物免疫機(jī)能下降、體內(nèi)微生物 菌群失調(diào)和藥物殘留等問題。短鏈脂肪酸具有抑菌、降低動(dòng)物腸道PH和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收 利用等廣泛的生理功能，是一種具有應(yīng)用前景的生物活性物質(zhì)和飼料添加劑。聚羥基 丁酸酯(Poly-i^-hydroxybutyrate，PHB)是短鏈脂肪酸β _羥基丁酸的聚合體，為一定粒 度的脂溶性顆粒(直徑0.2 0.5 μ m)。一些細(xì)菌在碳過量和氮缺乏等營(yíng)養(yǎng)脅迫時(shí)，可大量 積累PHB作為碳源和能量?jī)?chǔ)備。PHB在動(dòng)物腸道內(nèi)可通過酶解和化學(xué)水解的方式，降解為 β -羥基丁酸單體。PHB的疏水特性可減少揮發(fā)性SCFA對(duì)水質(zhì)的破壞作用，適于在水產(chǎn)育 苗和養(yǎng)殖中的應(yīng)用。研究表明，在養(yǎng)殖水體中加入PHB顆?；蛘叻e累PHB的細(xì)菌，可完全保 護(hù)感染發(fā)光弧菌(Vibrio campbellii)的鹵蟲。最近發(fā)現(xiàn)飼料中添加PHB具有促進(jìn)歐洲鱸 魚(Dicentrarchus labrax)生長(zhǎng)的作用。目前還沒有將PHB應(yīng)用于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物育苗的 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種聚羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方法，發(fā)現(xiàn)以100mg/L PHB濃度強(qiáng)化鹵蟲幼體24h效果最佳，本發(fā)明對(duì)PHB在水產(chǎn)育苗中的應(yīng)用研究具有很好的指
眉、ο為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種聚β -羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方法，其特征在于聚β -羥基丁酸酯強(qiáng) 化鹵蟲幼體時(shí)，聚β-羥基丁酸酯濃度為100mg/L，強(qiáng)化時(shí)間為Mh，聚β-羥基丁酸酯的顆 粒大小為10 50μπι。而且，所述聚β -羥基丁酸酯采用超聲波處理法將PHB顆粒分散成均勻，粒度為 10 50 μ m的懸浮液。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明使用的β -羥基丁酸酯(PHB)具有廣泛應(yīng)用前景的可替代抗生素的生物 控制劑，目前針對(duì)其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究在國(guó)內(nèi)尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)尚屬首次。本發(fā) 明給出了不同濃度PHB和不同強(qiáng)化培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鹵蟲成活率和生長(zhǎng)的影響，得出以100mg/L PHB濃度強(qiáng)化鹵蟲幼體24h效果最佳，本發(fā)明對(duì)PHB在水產(chǎn)育苗中的應(yīng)用研究具有很好的指
導(dǎo)意義。2、本發(fā)明的方法中采用超聲波處理法將PHB顆粒分散成均勻的、平均粒度 30 μ m (10 50 μ m)的懸浮液，PHB可以被有效包裹于鹵蟲消化道，較小的顆粒更有利于鹵蟲攝食，且更容易降解為水溶性β -羥基丁酸單體，從而被鹵蟲所利用。


圖1為本發(fā)明PHB濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2-1-4為本發(fā)明PHB強(qiáng)化48h鹵蟲和饑餓48h鹵蟲的相差顯微照片(圖2_1和 圖2- 和經(jīng)過尼羅藍(lán)A染色后的熒光顯微照片(圖2-3和圖2-4)；圖3為本發(fā)明試驗(yàn)1中不同濃度PHB強(qiáng)化培養(yǎng)鹵蟲的成活率；圖4為本發(fā)明試驗(yàn)1中不同濃度PHB強(qiáng)化培養(yǎng)72h的鹵蟲體長(zhǎng)；圖5為本發(fā)明試驗(yàn)2中不同濃度PHB強(qiáng)化培養(yǎng)鹵蟲的成活率；圖6為本發(fā)明試驗(yàn)2中不同濃度PHB強(qiáng)化培養(yǎng)72h的鹵蟲體長(zhǎng)；圖7為本發(fā)明經(jīng)過不同時(shí)間強(qiáng)化培養(yǎng)的鹵蟲體內(nèi)PHB含量(占鹵蟲干重)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。鹵蟲強(qiáng)化是利用其非選擇性濾食的特點(diǎn)，將一定大小的顆粒狀物質(zhì)包裹于鹵蟲消 化道內(nèi)，水產(chǎn)幼苗通過捕食鹵蟲而間接地將被包裹物攝入體內(nèi)，既達(dá)到輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的目 的，又可避免這些物質(zhì)直接加入水中所造成的浪費(fèi)和水質(zhì)污染。一種聚羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方法，通過以下實(shí)驗(yàn)證明得到鹵蟲強(qiáng)化 的最佳方法。實(shí)驗(yàn)1中PHB濃度分別設(shè)定為0，50，100，200,400和800mg/L，探索PHB強(qiáng)化鹵蟲 的最佳濃度范圍；在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)2中PHB濃度分別設(shè)定為50，100，150和200mg/L，試驗(yàn) PHB強(qiáng)化鹵蟲的最佳濃度。小球藻(5X106cell/mL)投喂作為對(duì)照組。每組設(shè)置3個(gè)平行樣。PHB懸浮母液的配制稱取一定量的PHB粉末于50mL塑料離心管中，加入45mL海水(鹽度為30)。將離 心管置于超聲波處理器中處理5min，使其中的PHB分散均勻，顆粒直徑為10 50 μ m。鹵蟲幼體的孵化和PHB強(qiáng)化試驗(yàn)用鹵蟲卵來源于我國(guó)新疆艾比湖。鹵蟲卵的孵化條件如下海水(鹽度為 30)，pH范圍8 9，溫度^°C，水表面光強(qiáng)為20001uX，連續(xù)充氣。孵化24h后，分離并收集 無節(jié)幼體。將100個(gè)初孵鹵蟲無節(jié)幼體轉(zhuǎn)入裝有200mL海水的錐形玻璃管中，向其中加入 不同劑量PHB懸浮母液，使錐形管中PHB達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度，連續(xù)培養(yǎng)72h。強(qiáng)化培養(yǎng)條件 同鹵蟲卵孵化條件。試驗(yàn)期間每天換水100%，pH維持在8. 30 8. 45，溶解氧DO > 6mg/ L0鹵蟲成活率和體長(zhǎng)的測(cè)定每天換水的同時(shí)，分別記錄Mh，4 i和7 各組鹵蟲的成活率。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(72h)， 每組取10 20只鹵蟲，在立體解剖鏡(Nikon SMZ645)下測(cè)定鹵蟲體長(zhǎng)，并計(jì)算平均值。數(shù) 據(jù)處理采用CXD圖像采集系統(tǒng)和hganaly計(jì)算機(jī)圖像處理軟件(濟(jì)南維納儀器有限公司 提供)。
強(qiáng)化鹵蟲體內(nèi)PHB積累的熒光顯微觀察尼羅藍(lán)A是一種堿性嗪類顏料，溶于水和乙醇。經(jīng)過尼羅藍(lán)A染色的PHB顆粒在熒 光顯微鏡下呈現(xiàn)亮橘黃色光斑，而細(xì)胞膜和其它脂類物質(zhì)由于不能與染料有效結(jié)合，僅呈 現(xiàn)較暗的紅色。本實(shí)驗(yàn)參照細(xì)菌中PHB顆粒的熒光染色法，經(jīng)PHB強(qiáng)化培養(yǎng)48h的鹵蟲經(jīng) 過1 %尼羅藍(lán)A染色lh，將鹵蟲取出固定，在M3nm波長(zhǎng)的熒光激發(fā)下，在顯微鏡下(Nikon Eclipse Ti)觀察強(qiáng)化鹵蟲體內(nèi)的PHB積累情況。強(qiáng)化鹵蟲體內(nèi)PHB含量的測(cè)定鹵蟲體內(nèi)PHB含量參照細(xì)菌中PHB的紫外光譜測(cè)定，方法參考陳玲，李禮堯，王 武.聚羥丁酸酯紫外檢測(cè)方法的改進(jìn)[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，16 ) :27-31, 或 KAYNAR P, BEYATLI Y. Determination of poly-β -hydroxybutyrate production by Bacillus spp. isolated from the intestines of various fishes[J]. Fish Sci,2009, 75(2) :439-443。PHB在濃硫酸溶液中加熱可以定量轉(zhuǎn)化為巴豆酸，后者在235nm處有一吸 收峰值。該測(cè)定方法排除了其它脂類的干擾，與細(xì)胞內(nèi)的總脂含量無關(guān)。繪制PHB標(biāo)準(zhǔn)曲線精確稱取0. OlOOg PHB溶于適量的氯仿中(Mettler，AL204)， 60°C水浴Ih后，100°C蒸去氯仿，加入IOmL濃硫酸配成PHB母液。分別精確移取10，20，30， 40和50 μ L PHB母液于比色管中，加入IOmL濃硫酸，使?jié)饬蛩崛芤褐蠵HB含量分別為1， 2，3，4和5μ g/mL。將比色管置于100°C水浴lOmin，冷卻后，用紫外分光光度計(jì)(Pgeneral T6)于235nm下測(cè)定吸光值，濃硫酸為空白對(duì)照。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為y =0. 128x+0. 019 (R2 = 0. 984)。鹵蟲卵孵化24h后，收集鹵蟲無節(jié)幼體。將一定量的鹵蟲無節(jié)幼體迅速轉(zhuǎn)入裝有 IOOOmL海水的錐形玻璃管中。鹵蟲無節(jié)幼體密度為300個(gè)/mL，以100mg/L PHB濃度進(jìn)行 強(qiáng)化，強(qiáng)化條件同前。分別于^!，iai，21h和Mh時(shí)取出200mL強(qiáng)化培養(yǎng)液，終止強(qiáng)化。用 100目篩絹收集鹵蟲，并用自來水反復(fù)沖洗，以去除鹵蟲體外附著的PHB顆粒，于-18°c冰箱 中冷凍保存。未經(jīng)PHB強(qiáng)化的鹵蟲(Oh)作為對(duì)照。待全部樣品收集完成后，將樣品于60°C 烘箱中干燥3h，得到鹵蟲干品。精確稱取0. OlOOg鹵蟲干品于比色管中，向比色管中加入5mL氯仿，60°C下水浴抽 提lh，在100°C下蒸去氯仿。再向比色管中加入5mL氯仿，取30yL PHB氯仿溶液于干凈比 色管中，蒸干氯仿后，加入5mL濃硫酸，100°C水浴lOmin，冷卻，于235nm下測(cè)定吸光值，濃硫 酸為空白對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出鹵蟲中PHB的含量
權(quán)利要求
1.一種聚β-羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方法，其特征在于聚β-羥基丁酸酯強(qiáng) 化鹵蟲幼體時(shí)，聚β-羥基丁酸酯濃度為100mg/L，強(qiáng)化時(shí)間為Mh，聚β-羥基丁酸酯的顆 粒大小為10 50μπι。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方法，其特征在于所 述聚β-羥基丁酸酯采用超聲波處理法將PHB顆粒分散成均勻，粒度為10 50 μ m的懸浮 液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚β-羥基丁酸酯對(duì)鹵蟲幼體的強(qiáng)化方法，其特征在于聚β-羥基丁酸酯強(qiáng)化鹵蟲幼體時(shí)，聚β-羥基丁酸酯濃度為100mg/L，強(qiáng)化時(shí)間為24h，聚β-羥基丁酸酯的顆粒大小為10～50μm。本發(fā)明使用的β-羥基丁酸酯(PHB)是具有廣泛應(yīng)用前景的可替代抗生素的生物控制劑，目前針對(duì)其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究在國(guó)內(nèi)尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)尚屬首次。本發(fā)明給出了不同濃度PHB和不同強(qiáng)化培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鹵蟲成活率和生長(zhǎng)的影響，得出以100mg/L PHB濃度強(qiáng)化鹵蟲幼體24h效果最佳，本發(fā)明對(duì)PHB在水產(chǎn)育苗中的應(yīng)用研究具有很好的指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)A23K1/18GK102132772SQ20111007152
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者孫慧賢, 隋麗英 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)