制造4-羥基丁酸酯、1,4-丁二醇和相關(guān)化合物的微生物和方法
【專利說明】制造4-羥基丁酸酯、1，4- 丁二醇和相關(guān)化合物的微生物和 方法
[0001] 本發(fā)明申請(qǐng)案含有已經(jīng)由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表且其全部?jī)?nèi)容以引 用方式并入本文中。于2013年5月29日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝命名為871943-228191_ SL. txt且大小為242, 819個(gè)字節(jié)。
[0002] 本申請(qǐng)案主張2012年6月4日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/655, 429號(hào)的優(yōu)先權(quán) 的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文中。
[0003] 本發(fā)明大概來說涉及生物體的計(jì)算機(jī)的設(shè)計(jì)和生物體的改造，所述生物體更特定 來說為具有1，4-丁二醇、4-羥基丁酰基-CoA、4_羥基丁醛或腐胺生物合成能力的生物體。
【背景技術(shù)】
[0004]化合物4-羥基丁酸（4-羥基丁酸酯（4-hydroxybutanoate)、4-羥基丁酸酯 (4-hydroxybutyrate)、4_HB)是具有作為各種商品和特殊化學(xué)品的結(jié)構(gòu)單元的工業(yè)潛力的 4_碳羧酸。特定來說，4-HB具有用作進(jìn)入1，4-丁二醇化學(xué)品家族的新進(jìn)入點(diǎn)的潛力，所述 家族包括溶劑、樹脂、聚合物前體和特殊化學(xué)品。1，4_丁二醇（BD0)是聚合物中間體和工業(yè) 溶劑，全球市場(chǎng)為約30億lb/年。BD0目前是從石油化學(xué)前體（主要為乙炔、馬來酸酐和環(huán) 氧丙烷）產(chǎn)生。
[0005] 例如，使乙炔與2分子甲醛在R印pe合成反應(yīng)中反應(yīng)（克羅斯威克斯 (Kroschwitz)和格蘭特（Grant)，化學(xué)工業(yè)技術(shù)百科全書（EncyclopediaofChem.Tech.), 約翰威利父子公司（JohnWileyandSons,Inc.)，紐約（1999))，之后進(jìn)行催化氫化以形成 1，4_ 丁二醇。據(jù)估計(jì)，美國(guó)生產(chǎn)的乙炔90%用于生產(chǎn)丁二醇?；蛘撸淇赏ㄟ^源自丁烷的 馬來酸酐的酯化和催化氫化來形成。在下游，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化丁二醇；例如，通過氧化轉(zhuǎn)化成 Y- 丁內(nèi)酯，Y- 丁內(nèi)酯可進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)檫量┩橥蚇-甲基-吡咯烷酮，或者通過氫解而轉(zhuǎn) 變?yōu)樗臍溥秽?。所述化合物具有作為聚合物中間體、溶劑和添加劑的各種應(yīng)用，并且總市場(chǎng) 近20億lb/年。需要研發(fā)通過替代手段產(chǎn)生所述化學(xué)品的方法，所述替代手段不僅代替用 于基于石油的原料的可再生品，并且還使用能量和資本較不密集的工藝。
[0006] 因此，相關(guān)技藝需要用于有效地產(chǎn)生商業(yè)量的1，4_ 丁二醇和其化學(xué)前體的替代 手段。本發(fā)明滿足這種需要且還提供相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供具有4-羥基丁酸酯、1，4- 丁二醇或其它產(chǎn)物途徑且能夠產(chǎn)生4-羥基 丁酸酯、1，4-丁二醇或其它產(chǎn)物的非天然微生物，其中所述微生物包含一或多種遺傳修飾。 本發(fā)明另外提供使用所述微生物產(chǎn)生4-羥基丁酸酯、1，4_ 丁二醇或其它產(chǎn)物或相關(guān)產(chǎn)物 的方法。
【附圖說明】
[0008]圖1是顯示產(chǎn)生4-羥基丁酸酯（4-HB)和1，4_ 丁二醇的生物化學(xué)途徑的示意圖。 前5個(gè)步驟是大腸桿菌（E.coli)的內(nèi)源性步驟，而其余步驟可異源表達(dá)。催化生物合成反 應(yīng)的酶是：（1)琥珀?；?CoA合成酶；（2)非CoA依賴性琥珀酸半醛脫氫酶；（3)a-酮戊 二酸脫氫酶；(4)谷氨酸：琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶；（5)谷氨酸脫羧酶；(6)CoA依賴性琥珀酸半 醛脫氫酶；（7) 4-羥基丁酸脫氫酶；（8)a-酮戊二酸脫羧酶；（9) 4-羥基丁?；鵆oA:乙酰 基-CoA轉(zhuǎn)移酶；（10) 丁酸激酶；（11)磷酸轉(zhuǎn)丁?；福唬?2)醛脫氫酶；（13)醇脫氫酶。
[0009] 圖2是顯示大腸桿菌中的高絲氨酸生物合成的示意圖。
[0010] 圖3顯示使用具有表達(dá)4-HB途徑基因的各種組合的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株在葡 萄糖最低培養(yǎng)基中產(chǎn)生4-HB。（a)培養(yǎng)液中的4-HB濃度；(b)培養(yǎng)液中的琥珀酸酯濃 度；（c)在600nm下測(cè)量的培養(yǎng)物0D。條形簇代表24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)（如果測(cè) 量）時(shí)間點(diǎn)。沿x軸的代碼指示所用菌株/質(zhì)粒組合。第一索引是指宿主菌株：1，MG1655 lacIQ;2，MG1655AgabDlacIQ;3，MG1655AgabDAaldAlacIQ。第二索引是指所用 質(zhì)粒組合：1，PZE13-0004-0035 與pZA33-0036 ;2,pZE13-0004-0035 與pZA33-0010n;3， PZE13-0004-0008 與pZA33-0036 ;4,pZE13-0004-0008 與pZA33-0010n;5,對(duì)照載體pZE13 與pZA33。
[0011] 圖4顯示在表達(dá)來自結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis)的a-酮戊二 酸脫羧酶的大腸桿菌菌株中從葡萄糖產(chǎn)生4-HB。菌株1-3含有pZE13-0032和pZA33-0036。 菌株4僅表達(dá)空載體pZE13和pZA33。宿主菌株如下：1和4，MG1655lacIQ;2，MG1655AgabD lacIQ;3，MG1655AgabDAaldAlacIQ。條形是指在24小時(shí)和48小時(shí)的濃度。
[0012] 圖5顯示在重組大腸桿菌菌株中從10mM4-HB產(chǎn)生BD0。編號(hào)位置對(duì)應(yīng)于使 用MG1655lacIQ的實(shí)驗(yàn)，其含有表達(dá)來自牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis)的cat2的 PZA33-0024 和在pZE13 上表達(dá)的以下基因：1，無（對(duì)照）；2,0002 ;3,0003 ;4,0003n;5， 0011 ;6,0013 ;7,0023 ;8,0025 ;9,0008n;10,0035?；蚓幪?hào)定義于表6中。對(duì)于各位置來 說，條形分別是指好氧性條件、微好氧性條件和厭氧性條件。微好氧性條件是通過密封培養(yǎng) 管但不將其抽空來產(chǎn)生。
[0013] 圖6顯示由在補(bǔ)加有4g/L未經(jīng)標(biāo)記葡萄糖（a、c、e和g)、均勻標(biāo)記13c-葡 萄糖（b、d、f和h)的M9 最低培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002p ZA33-0034-0036產(chǎn)生的4-HB和BD0的質(zhì)譜圖。（a)和（b)，衍生化BD0的質(zhì)量116特征片 段，其含有2個(gè)碳原子；（c)和（d)，衍生化BD0的質(zhì)量177特征片段，其含有1個(gè)碳原子； (e)和（f)，衍生化4-HB的質(zhì)量117特征片段，其含有2個(gè)碳原子；(g)和（h)，衍生化4-HB 的質(zhì)量233特征片段，其含有4個(gè)碳原子。
[0014] 圖7是用于產(chǎn)生丁內(nèi)酯的生物工藝的示意性工藝流程圖。圖（a)圖解說明利 用分批分離的分批補(bǔ)料發(fā)酵且圖（b)圖解說明利用連續(xù)分離的分批補(bǔ)料發(fā)酵。
[0015] 圖8A和8B顯示實(shí)例性1，4_ 丁二醇（BD0)途徑。圖8A顯示始于琥珀?；?CoA 的BD0途徑。圖8B顯示始于a-酮戊二酸酯的BD0途徑。
[0016] 圖9A-9C顯不實(shí)例性BD0途徑。圖9A和9B顯不始于4-氣基丁酸醋的途徑。圖 9C顯示從乙酰乙酰基-CoA到4-氨基丁酸酯的途徑。
[0017] 圖10顯示始于a-酮戊二酸酯的實(shí)例性BD0途徑。
[0018] 圖11顯示始于谷氨酸酯的實(shí)例性BD0途徑。
[0019] 圖12顯示始于乙酰乙?；?CoA的實(shí)例性BD0途徑。
[0020] 圖13顯示始于高絲氨酸的實(shí)例性BD0途徑。
[0021] 圖14顯示大腸桿菌琥珀?；?CoA合成酶的核苷酸和氨基酸序列。圖14A顯示大 腸桿菌sucCD操縱子的核苷酸序列（SEQIDN0:46)。圖14B(SEQIDN0:47)和14C(SEQ IDNO:48)顯示由sue⑶操縱子編碼的琥珀?；?CoA合成酶亞單元的氨基酸序列。
[0022] 圖15顯示牛分枝桿菌（Mycobacteriumbovis)a-酮戊二酸脫羧酶的核苷酸和氨 基酸序列。圖15A顯示牛分枝桿菌sucA基因的核苷酸序列（SEQIDN0:49)。圖15B顯示 牛分枝桿菌a-酮戊二酸脫羧酶的氨基酸序列（SEQIDN0 :50)。
[0023] 圖16顯示大腸桿菌在厭氧性（微好氧性）條件下在最低培養(yǎng)基中經(jīng)由a-酮 戊二酸酯從葡萄糖生物合成4-羥基丁酸酯。宿主菌株是ECKh-401。實(shí)驗(yàn)基于存在 于質(zhì)粒pZA33上的如下上游途徑基因來標(biāo)記：1) 4hbd_sucA;2)sucO)-sucD-4hbd;3) sucCD-sucD-4hbd_sucA。
[0024] 圖17顯示大腸桿菌在最低培養(yǎng)基中經(jīng)由琥珀酸酯和a_酮戊二酸酯從葡萄糖生 物合成4-羥基丁酸酯。宿主菌株是野生型MG1655。實(shí)驗(yàn)基于存在于質(zhì)粒pZE13和pZA33上 的如下基因來標(biāo)記：1)空對(duì)照載體；2)空pZE13、pZA33-4hbd;3)pZE13-sucA、pZA33-4hbd。
[0025] 圖18A顯示來自牙齦卟啉單胞菌的CoA依賴性琥珀酸半醛脫氫酶（sueD)的核苷 酸序列（SEQIDN0:51)，并且圖18B顯示所編碼氨基酸序列（SEQIDN0:52)。
[0026] 圖19A顯示來自牙齦卟啉單胞菌的4-羥基丁酸脫氫酶（4hbd)的核苷酸序列（SEQ IDNO: 53)，并且圖19B顯示所編碼氨基酸序列（SEQIDNO: 54)。
[0027] 圖20A顯示來自牙齦卟啉單胞菌的4-羥基丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶（cat2)的核苷酸序列 (SEQIDN0 :55)，并且圖20B顯示所編碼氨基酸序列（SEQIDN0 :56)。
[0028] 圖21A顯不來自丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum)的憐酸轉(zhuǎn)丁醜基 酶（ptb)的核苷酸序列（SEQIDN0:57)，并且圖21B顯示所編碼氨基酸序列（SEQIDN0: 58)。
[0029]圖22A顯示來自丙酮丁醇梭菌的丁酸激酶（bukl)的核苷酸序列（SEQIDNO:59)， 并且圖22B顯示所編碼氨基酸序列（SEQIDNO:60)。
[0030] 圖23顯示丙酮丁醇梭菌020 (磷酸轉(zhuǎn)丁?；福┑奶娲塑账嵝蛄校湎鄬?duì)于丙 酮丁醇梭菌天然序列將密碼子改變?yōu)楦Ｒ姷拇竽c桿菌密碼子。圖23A-23D(020A-020D，分 別為SEQIDN0 :61-64)所含序列中經(jīng)更常見密碼子置換的罕見大腸桿菌密碼子的數(shù)目遞 增（A<B<C<D)。
[0031] 圖24顯示丙酮丁醇梭菌021 ( 丁酸激酶）的替代核苷酸序列，其相對(duì)于丙酮丁醇 梭菌天然序列將密碼子改變?yōu)楦Ｒ姷拇竽c桿菌密碼子。圖24A-24D(021A-021B，分別為 SEQIDN0 :65-68)所含序列中經(jīng)更常見密碼子置換的罕見大腸桿菌密碼子的數(shù)目遞增（A <B<C<D)。
[0032] 圖25顯示丁酸激酶（BK)和磷酸轉(zhuǎn)丁?；福≒TB)的經(jīng)改良表達(dá)，其密碼子經(jīng)優(yōu) 化以供在大腸桿菌中表達(dá)。圖25A顯示用考馬斯藍(lán)（Coomassieblue)對(duì)蛋白質(zhì)染色的十二 烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE);泳道1，無插入的對(duì)照載體；泳道2,丙酮丁醇 梭菌天然序列在大腸桿菌中的表達(dá)；泳道3,020B-021B密碼子優(yōu)化PTB-BK的表達(dá)；泳道4， 020C-021C密碼子優(yōu)化PTB-BK的表達(dá)。顯示BK和PTB的位置。圖25B顯示天然丙酮丁醇 梭菌序列（2021n)相較于密碼子優(yōu)化020B-021B(2021B)和020C-021C(2021C)的BK和PTB 活性。
[0033] 圖26顯示BD0和丁內(nèi)酯（GBL)在以下各種表達(dá)BD0產(chǎn)生酶的菌株中的產(chǎn)生： Cat2(034) ;2021n;2021B;2021C。
[0034]圖 27A顯不天然拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii)aid基因（025n)的核苷 酸序列（SEQIDNO:69)，并且圖27B顯示所編碼氨基酸序列（SEQIDNO:70)。
[0035] 圖28A-28D顯示拜氏梭菌aid基因的替代基因序列（025A-025D，分別為SEQID NO:71-74)，其中經(jīng)更常見密碼子置換的罕見密碼子的數(shù)目遞增（A<B<C<D)。
[0036] 圖29顯示天然拜氏梭菌aid基因和密碼子優(yōu)化變體的表達(dá)：無插入（無插入對(duì) 照）、025n、025A、025B、025C、025D。
[0037] 圖30顯示不同菌株中的BD0或BD0和乙醇產(chǎn)生。圖30顯示含有天然拜氏梭菌aid 基因（025n)的菌株或密碼子經(jīng)優(yōu)化以供在大腸桿菌中表達(dá)的變體（025A-02OT)中的BD0 產(chǎn)生。圖30B顯示相較于密碼子優(yōu)化變體025B表達(dá)丙酮丁醇梭菌AdhE2酶（002C)的菌株 中的乙醇和BD0產(chǎn)生。第三組顯示牙齦卟啉單胞菌sucD(035)的表達(dá)。在所有情況下，還 表達(dá)牙齦卟啉單胞菌Cat2 (034)。
[0038] 圖31A顯示來自熱葡糖苷酶地芽胞桿菌（Geobacillusthermoglucosidasius)的 adhl基因的核苷酸序列（SEQIDNO:75)，并且圖31B顯示所編碼氨基酸序列（SEQIDNO: 76)。
[0039] 圖32A顯示熱葡糖苷酶地芽胞桿菌adhl基因在大腸桿菌中的表達(dá)。通過 SDS-PAGE分析全部細(xì)胞溶解物或上清液并用考馬斯藍(lán)對(duì)無插入質(zhì)粒、具有083 (頭狀地霉 (Geotrichumcapitatum)N-苯甲基-3-批咯燒醇脫氫酶）插入的質(zhì)粒和具有084 (熱葡糖 苷酶地芽胞桿菌adhl)插入的質(zhì)粒染色。圖32B顯示具有丁醛（菱形）或4-羥基丁醛（正 方形）作為底物的084的活性。
[0040]圖33顯示BD0在不同菌株中的產(chǎn)生：無插入質(zhì)粒；025B ;025B-026n ;025B-026A ; 025B-026B；025B-〇26C；025B-050；025B-〇52；025B-〇53；025B-〇55；025B-〇57；025B-〇58； 025B-071 ;025B-083 ;025B-084 ;PTSlac〇-〇25B ;PTSlac〇-〇25B-〇26n。
[0041] 圖34顯示載體pRE118-V2的質(zhì)粒圖譜。
[0042] 圖35顯示涵蓋aceF和lpdA基因的ECKh-138區(qū)的序列（SEQIDNO:77)。肺炎 克雷伯氏菌（K.pneumonia)lpdA基因加下劃線，并且Glu354Lys突變體中改變的密碼子帶 陰影。
[0043] 圖36顯示天然大腸桿菌lpdA(SEQIDN0 :78)與突變肺炎克雷伯氏菌lpdA(SEQ IDNO:79)的蛋白質(zhì)序列比較。
[0044] 圖37顯示菌株AB3、MG1655AldhA和ECKh-138中的4-羥基丁酸酯（左條形） 和BD0(右條形）產(chǎn)生。所有菌株都表達(dá)中等拷貝質(zhì)粒pZA33上的大腸桿菌sucCD、牙齦卟 啉單胞菌sucD、牙齦卟啉單胞菌4hbd和高拷貝質(zhì)粒pZE13上的牙齦卟啉單胞菌Cat2、丙酮 丁醇梭菌AdhE2。
[0045] 圖38顯示融合到pflB_p6啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS)的aceE基因的5'末 端的核苷酸序列（S