專利名稱：防治香蕉枯萎病的海洋細(xì)菌2bs12的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治香蕉枯萎病的海洋生防菌株2BS12，屬于作物防病治病技術(shù)領(lǐng)域， 專用于香蕉枯萎病的無公害防治。背景技術(shù)：
香蕉枯萎病又稱巴拿馬病、香蕉黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴?；?/^sari oxysporum f. sp. /知引起的維管束萎蔫病害。病原菌從寄主根部的傷口入侵，通過維管束經(jīng)球莖、假莖向上部葉片蔓延，病原菌堵塞木質(zhì)部導(dǎo)管，給植株的水分運(yùn)輸帶來障礙，導(dǎo)致植株枯萎死亡。這種毀滅性的土傳病害，一旦一個(gè)地塊發(fā)病，病菌很快蔓延開來，很難根治，因而被稱為“香蕉癌癥”。因此對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行防治迫在眉睫。目前對(duì)該病還尚無有效的防治方法，沒有理想的化學(xué)藥劑和優(yōu)質(zhì)的抗病品種問世。一些栽培管理措施也只能起到局部的控制作用。并且長(zhǎng)期使用一些化學(xué)殺菌劑、改良劑，極易導(dǎo)致病原菌抗藥性問題突出，且破壞土壤的生態(tài)環(huán)境，對(duì)人類不安全。而微生物源農(nóng)藥可以利用微生物產(chǎn)生抗病物質(zhì)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、空間位點(diǎn)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等方式，安全、有效地防治植物病害，在植物病害的防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。綜上所述，這種環(huán)境友好型的高效、安全的微生物殺菌劑在香蕉枯萎病的防治中具有廣闊的發(fā)展空間，同時(shí)也是農(nóng)業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展的需要?，F(xiàn)有技術(shù)中按照本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液專利(公開專利號(hào)CN1358838，
公開日2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存2-3年。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前尚無對(duì)香蕉枯萎病具有較好防治效果的生防制劑的現(xiàn)狀， 提供開發(fā)一種防治香蕉枯萎病的生防菌株，該菌為海洋細(xì)菌，從海洋植物秋茄GfmWia candel (L.) Druce)根圍分離獲得。對(duì)香蕉枯萎病具有較好的防治效果，并具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能。技術(shù)方案
一種防治香蕉枯萎病的海洋細(xì)菌2BS12，為解淀粉芽孢桿柳― _yl0liquefaCienS\2Q\Q年込只3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為 CGMCC NO. 4045。2BS12在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)10小時(shí)后產(chǎn)生單菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣有細(xì)齒，中間隆起，表面光滑，菌體為短直桿狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，可產(chǎn)生芽孢。可分泌蛋白酶、纖維素酶及嗜鐵素。生防菌株2BS12制備生防菌劑的方法為
將上述防治香蕉枯萎病的菌株2BS12在PDA培養(yǎng)液30°C 180 rpm振蕩培養(yǎng)20- 小時(shí)，然后6000 rpm離心10分鐘，取2BS12濕菌與菌體保藏液(專利號(hào)ZL02112559. 7，公開專利號(hào)CN1358838，
公開日2002年7月17日)，按質(zhì)量體積比為1 :40配成菌劑，菌劑成品種活菌總濃度為IX IO9-I X IO12 CFU/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為用200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30分鐘，接著用四層紗布過濾，濾液加20克蔗糖，定容至 1000 ml，調(diào)節(jié)PH至7. 2-7. 4，121°C滅菌20分鐘。菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液， 還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對(duì)香蕉枯萎病開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，對(duì)環(huán)境友好，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，對(duì)人無害， 有利于無公害生產(chǎn)、有機(jī)生產(chǎn)。同時(shí)，該菌劑還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。離體試驗(yàn)表明，2BS12菌劑對(duì)香蕉枯萎病病原菌的生長(zhǎng)有很好的抑制作用(圖1)。 溫室實(shí)驗(yàn)表明該菌制劑能顯著降低由香蕉枯萎病1號(hào)、4號(hào)生理小種引起的病害的發(fā)生， 并兼有促進(jìn)香蕉生長(zhǎng)的作用(表1，2)。田間試驗(yàn)表明使用該菌劑對(duì)香蕉枯萎病的防治效果可達(dá)35%以上，顯著優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈(表3)。該菌劑用濕菌與本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液(屬本實(shí)驗(yàn)室已授權(quán)專利，專利號(hào) ZL02112559. 7，公開專利號(hào)CN1358838，
公開日:2002年7月17日)按1 :40 (g/ml)配成菌劑，可室溫保存2-3年。該菌劑可以在移栽時(shí)灌根使用，也可以在移栽前倒入有機(jī)肥中制成堆肥，然后隨肥料在整地過程中埋到土里。四


圖1 2BS12菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種的生長(zhǎng)抑制情況圖2溫室試驗(yàn)中2BS12菌劑處理35天后對(duì)香蕉枯萎病的防治效果(巴西蕉) 圖3溫室試驗(yàn)中2BS12菌劑處理50天后對(duì)香蕉苗的促生效果(巴西蕉) 五具體實(shí)施方式
1. 2BS12生防菌劑的制備
本發(fā)明涉及一種防治香蕉枯萎病的海洋細(xì)菌2BS12，為解淀粉芽孢桿菌OfeciBm amyloliquefaciens)，hk侮灃堪嫩HQKandelia candel (L.) Druce)根圍分離得到。 2BS12在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)10小時(shí)后產(chǎn)生單菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣有細(xì)齒，中間隆起，表面光滑，菌體為短直桿狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，可產(chǎn)生芽孢?？煞置诘鞍酌浮⒗w維素酶及嗜鐵素。將上述防治香蕉枯萎病的菌株2BS12在PDA培養(yǎng)液30°C 180 rpm振蕩培養(yǎng)20_24 小時(shí)，然后6000 rpm離心10分鐘，取2BS12濕菌與菌體保藏液，按質(zhì)量體積比為1 :40配成菌劑，菌劑成品種活菌總濃度為IX IO9-I X IO12 CFU/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為用 200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30分鐘，接著用四層紗布過濾，濾液加20 克蔗糖，定容至1000 ml，調(diào)節(jié)PH至7. 2-7.4，121°C滅菌20分鐘。菌體保藏液為0. Olmol/ L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. OOlmol/L的Tween20非離子型表面活性劑。. 2BS12菌劑對(duì)香蕉枯萎病病原菌的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)
將1 ml濃度為IO8 CFU/ml的2BS12菌劑加入200 ml PDA培養(yǎng)基中，混勻，倒平板，以不加2BS12菌劑的PDA培養(yǎng)基作對(duì)照，在每個(gè)平板的中心接上一個(gè)直徑為5 mm的香蕉枯萎病病原菌菌塊，在25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，測(cè)定病原菌的生長(zhǎng)情況。圖1為2BS12菌劑對(duì)香蕉枯萎病病菌的抑制作用。表1 2BS12菌劑施用K天后對(duì)香蕉枯. 2BS12菌劑的溫室防效試驗(yàn)
病原菌孢子懸浮液的制備香蕉枯萎病病原菌1號(hào)生理小種(Foc-Rl)、4號(hào)生理小禾中(Foc_R4) (R. Morpurgo et al. , 1994, Selection parameters for resistance to Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4 on diploid banana Qfusa acuminate Colla))，分別用PDA培養(yǎng)液在25° C，150 rpm/min條件下培養(yǎng)7_10天，用無菌紗布濾去菌絲得孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子懸浮液的濃度，并將孢子懸浮液濃度調(diào)至IO7個(gè)孢子/ml，備用。選用4-5葉期的香蕉苗，生防菌處理組，每株苗用30 ml濃度為IO8 CFU/ml的 2BS12菌液灌根處理，對(duì)照組用清水處理，每個(gè)處理6棵苗，每處理重復(fù)3次。待生防菌處理 5天后，每株苗澆30 ml病原菌孢子懸浮液?！皬V粉1號(hào)”澆灌R)c_Rl，“巴西蕉”和“農(nóng)科1 號(hào)”澆灌R)c_R4。待蕉苗開始發(fā)病后，觀察記錄葉片黃化狀況，病原菌處理45天后統(tǒng)計(jì)最終結(jié)果。按Ploetz (Ploetz, 1999)的病情統(tǒng)計(jì)分級(jí)，根據(jù)植株黃化、萎蔫狀況進(jìn)行病情統(tǒng)計(jì)
O級(jí)一植株健康；
1級(jí)--輕度褪綠和萎蔫，葉柄不下垂； 2級(jí)一中度褪綠、萎蔫，少數(shù)葉柄下垂和(或)莖基部開裂； 3級(jí)一嚴(yán)重褪綠、萎蔫，葉柄下垂，植株矮化； 4級(jí)一死亡。病害嚴(yán)重度(％)= [ Σ (病級(jí)數(shù)X該病級(jí)植株數(shù))/(最高病級(jí)X總植株數(shù))]X 100% 生防效果(％)=[(對(duì)照1病害嚴(yán)重度-處理組病害嚴(yán)重度)/對(duì)照1病害嚴(yán)重度]X100% 溫室防效試驗(yàn)結(jié)果表明(表1，圖2)，2BS12菌劑處理組能夠很好的抑制香蕉枯萎病的
發(fā)生，其防治效果達(dá)到52. 37-77. 78%。
權(quán)利要求
1.一種防治香蕉枯萎病的海洋細(xì)菌2BS12，為解淀粉芽孢桿 _yl0liquefaCienS\2Q\Q年込只3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4045。
2.用權(quán)利要求1所述生防菌株2BS12制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求2所述生防菌劑在防治香蕉枯萎病方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述生防菌株2BS12用于制備生防菌劑的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述生防菌株2BS12在PDA培養(yǎng)液30°C 180 rpm振蕩培養(yǎng)20- 小時(shí)， 然后6000 rpm離心10分鐘，取2BS12濕菌與菌體保藏液，按質(zhì)量體積比為1 :40配成菌劑， 菌劑成品種活菌總濃度為1 X IO9-I X IO12 CFU/ml，菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液， 還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生防菌株2BS12用于制備生防菌劑的方法，其特征在于，所用 PDA培養(yǎng)液配制方法為用200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后至少煮20分鐘以上，接著用四層醫(yī)用紗布過濾，濾液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值調(diào)至7. 2-7. 4，然后121°C滅菌 20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治香蕉枯萎病的海洋細(xì)菌2BS12，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。該菌是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，將該菌在PDA培養(yǎng)液37℃180rpm振蕩培養(yǎng)20-24小時(shí)，然后6000rpm離心10分鐘，取濕菌與本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液按1∶40(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109-1×1012CFU/ml。在不同香蕉品種上，對(duì)香蕉枯萎病的溫室防效為52.37-77.78%，促生效果為17.08-51.19%，田間防效達(dá)到35.96%。該菌劑可以噴霧使用，做成堆肥使用，也可稀釋后在移栽時(shí)灌根使用。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102172249SQ201110071160
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者鄭穎, 郭堅(jiān)華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)