一種甘藍(lán)枯萎病菌1號(hào)和2號(hào)生理小種檢測的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)枯萎病菌1號(hào)和2號(hào)生理小種檢測的試劑盒，包括檢測引物、10×PCREasyTaq緩沖液2.0μl、10mM的dNTPs0.5μl、活性酶濃度為5U/ml的Taq聚合酶0.4μl、甘藍(lán)枯萎病菌1號(hào)和2號(hào)生理小種陽性對(duì)照DNA各1μl、重量濃度≥99%的超純水20μl；還公開了檢測方法，包括如下步驟：(1)提取植物組織或土壤DNA；（2）對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（3）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，分離后再經(jīng)溴化乙錠染色于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種準(zhǔn)確性高、操作簡便、特異性強(qiáng)且靈敏度高的甘藍(lán)枯萎病菌1號(hào)和2號(hào)生理小種的快速檢測與鑒定試劑盒及其方法。
【專利說明】一種甘藍(lán)枯萎病菌1號(hào)和2號(hào)生理小種檢測的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測鑒定及植物檢疫的領(lǐng)域，具體是一種甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在公知的甘藍(lán)枯萎病菌就是尖孢鐮刀菌粘團(tuán)?；停怄哏牭毒硤F(tuán)?；?.Fusarium oxysporum f.sp.Conglutinans )引起的甘藍(lán)枯萎病是一種毀滅性的土傳病害，在全球大部分甘藍(lán)產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，該病自2001年在我國首次報(bào)道發(fā)生以來，先后在河北省張家口市、山西省晉中市和山西省大同市均有發(fā)生，在我國的發(fā)生呈蔓延趨勢，并逐年加重，已成為影響我國甘藍(lán)品質(zhì)和產(chǎn)量的重要病害。根據(jù)危害寄主甘藍(lán)的品種，可分為2個(gè)生理小種，目前我國甘藍(lán)生產(chǎn)主要受到I號(hào)生理小種的危害。該病自2001年在我國延慶地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，發(fā)病面積逐年增加，已成為威脅我國甘藍(lán)生產(chǎn)的重要因素。目前生產(chǎn)上缺少有效防控甘藍(lán)枯萎病的方法，因此，快速穩(wěn)定的病原菌鑒定與檢測體系是對(duì)該病害進(jìn)行綜合防控的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有甘藍(lán)枯萎病菌生理小種的鑒定與檢測技術(shù)仍然以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和鑒別寄主鑒定為主。但是形態(tài)學(xué)鑒定需要經(jīng)驗(yàn)極其豐富的專家操作并且生理小種之間形態(tài)學(xué)差異較小，難以得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。而利用鑒別寄主鑒定生理小種費(fèi)時(shí)費(fèi)力且需要大量的品種。隨著生命科學(xué)的高速發(fā)展，包括AFLP，RFLP，以及SCAR在內(nèi)的分子檢測技術(shù)在病原菌的應(yīng)用得到植物病理學(xué)家的重視，基于各生理小種的特異基因設(shè)計(jì)特異性引物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于枯萎病菌生理小種的分子檢測。
[0003]植物病理學(xué)家已基于特異性引物成功建立了快速檢測番爺枯萎病菌QFusari umoxysporum f.sp.eiee1-1s」，香蕉才古萎病菌(/7.0xysporum f.sp.ew辦eflse)，萵苣才古萎病|if iFusarium oxysporum f.sp.1actucae),|if iFusarium oxysporum f.sp.dianthi),豌豆枯萎病菌{Fusarium oxysporum f.sp.pi si )和唐菖蒲枯萎病菌{Fusariumoxysporum f.sp.Wat/io/i)不同生理小種的分子鑒定體系。利用這一技術(shù)在對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行分子診斷時(shí)的靈敏度達(dá)到0.2 y g新鮮菌絲的水平。同時(shí)該技術(shù)也在種子，土壤以及發(fā)病組織中病原菌的檢測上得到了充分應(yīng)用。三重PCR檢測技術(shù)也在香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種鑒定中得到了應(yīng)用。甘藍(lán)枯萎病菌生理小種的檢測與鑒定技術(shù)尚未見報(bào)道，本研究在甘藍(lán)枯萎病菌1，2號(hào)生理小種全基因組測序數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，篩選出兩小種各自的特異引物并引入尖孢鐮刀菌通用引物W106R/W106S為內(nèi)標(biāo)，建立起一步三重PCR快速檢測甘藍(lán)枯萎病菌1，2號(hào)生理小種的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述檢測甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種檢測試劑盒及其檢測方法，其目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的生物學(xué)檢測方法所需周期長，且目前尚未有甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種分子檢測方法的問題，通過對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種進(jìn)行全基因組測序，并通過比較基因組學(xué)的方法找出甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的特異基因組片段，然后這針對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的特異片段堿基序列分別設(shè)計(jì)特異引物，用于帶甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，并提供一種準(zhǔn)確性高、操作簡便、特異性強(qiáng)且靈敏度高的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種快速分子檢測的試劑盒，該試劑盒可用于帶菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，對(duì)于甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種引起病害顯癥之前的早期檢測和診斷具有十分重要的意義。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)枯萎病菌的檢測試劑盒，該試劑盒包括，濃度為lpmol/W的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1W，濃度為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種特異引物1#77R、1#77S各1W，濃度為IOpmoI/m的甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種特異引物2#40R、2#40S各IW ,IOXPCR EasyTaq緩沖液2.0W UOmM的dNTPs0.5W、活性酶濃度為5U/ml的Taq聚合酶0.4W、甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種陽性對(duì)照DNA各IW、重量濃度≥99%的超純水20ul。檢測引物的序列:
W106R 的序列 5’ - GCAGTCGTACGTCATCGACC -3’、
W106S 的序列 5’ - CCATGGCAGATGGCGAGTCA -3’，
1#77R 的序列 5’ - AAATCCAAGGTGCGAAGA -3’，
1#77S 的序列 5’ - CCAGGCTACACTAATACAACAG -3’，
2#40R 的序列 5’ - CTTTCGCTTCTCCCTTCA -3’，
2#40S 的序列 5’ - AACGCATCGTCTTCTATT -3’。
[0006]其中W106R、W106S的序列出自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，名稱為香蕉枯萎病菌I號(hào)和4號(hào)生理小種的快速檢測與檢測的文獻(xiàn)，作者為李慧敏。
[0007]本發(fā)明還公開了采用所述試劑盒檢測甘藍(lán)枯萎病菌的方法，該方法包括如下步驟，(I)利用NuClean Plant Gen DNA Kit試劑盒提取被甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)或2號(hào)生理小種感染的植物組織DNA,利用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒方法提取被甘藍(lán)枯萎病菌侵染的土壤DNA ；
(2 )采用檢測試劑盒對(duì)(I)步分離出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3)將6W步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，分離后再經(jīng)溴化乙錠染色于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增出兩條大小分別為729bp和1927bp產(chǎn)物時(shí)，可判斷植物組織或土壤中存在甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增出兩條大小分別為729bp和309bp產(chǎn)物時(shí)，可判斷植物組織或土壤中存在甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種。
[0008]所述步驟(2)的具體操作方法是，①取(I)步的DNA1W，將其與試劑盒的試劑混合，該試劑盒的試劑包括濃度為lpmol/W的枯萎病菌通用引物W106R/W106S各1W，濃度為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種特異引物1#77R/1#77S各1W，濃度為IOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種特異引物2#40R/2#40S各IW ,IOXPCR Easy Taq緩沖液2.0W、IOmM的dNTPs0.5W、活性酶濃度為5U/ml的Taq聚合酶0.4W、甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種陽性對(duì)照DNA各1W、重量濃度≥99%的超純水20ul ；②將①步的混合物放入PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ° C預(yù)變性5 min；94。C 變性 40 sec;60° C 退火 30 sec ；72 ° C 延伸 I min 30sec ； 35 個(gè)循環(huán)最后 72 ° C延伸10 min o
[0009]本發(fā)明方法適用于植物組織和土壤樣品中甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的快速可靠檢測和鑒定，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果:
1、特異性強(qiáng):本發(fā)明檢測方法是利用比較基因組學(xué)方法對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種之間以及和其他枯萎病菌的全基因組序列進(jìn)行分析得到甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的特有片段，根據(jù)特異片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測。已經(jīng)對(duì)源于來自我國北京、山西省及國外的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種和尖孢鐮刀菌近緣種及其他常見病菌的驗(yàn)證，結(jié)果具有很強(qiáng)的特異性；
2、實(shí)用性好:本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的一系列特異性引物，可用于帶甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，因此本方法的實(shí)用性強(qiáng)，可滿足對(duì)帶菌土壤和發(fā)病植物組織中存在的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種進(jìn)行快速可靠的檢測和鑒定的需要；
3、操作簡便快速:應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)帶甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的土壤樣品和植物組織進(jìn)行病原菌DNA提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳后即可判定結(jié)果，無需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切。一般整個(gè)檢測過程在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，而現(xiàn)有的得需要數(shù)天才能完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種特異性PCR產(chǎn)物電泳圖；
圖中，M:DNA Marker ;1_10:甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種基因組DNA ; 11-12:甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種基因組DNA ; 13-19:其他枯萎病菌基因組DNA ;20_23:常見其他病原菌基因組DNA ；24:清水對(duì)照。
[0011]圖2為發(fā)病植株樣品中甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種檢測電泳圖；
圖中，M:DNA Marker ；1:甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種基因組DNA ；2:甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種基因組DNA ；3-5:發(fā)病甘藍(lán)葉片總DNA ;6_8:發(fā)病甘藍(lán)根部總DNA ；9:健康甘藍(lán)總DNA ; 10清水對(duì)照。
[0012]圖3為土壤樣品中甘藍(lán)枯萎病菌檢測電泳圖；
圖中，M:Trans2K plus Marker ；1:甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種基因組DNA ；2:甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種基因組DNA ；3-9:發(fā)病甘藍(lán)根際土壤總DNA ；10:未發(fā)病甘藍(lán)根際土壤總DNA ; 11:清水對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0014]實(shí)施例一:本發(fā)明的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的檢測試劑盒，該試劑盒包括，濃度為lpmol/W的枯萎病菌通用引物W106R/W106S各1W，濃度為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種特異引物1#77R/1#77S各1W，濃度為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種特異引物2#40R/2#40S各IW，IOXPCR Easy Taq緩沖液2.0WUOmM的dNTPs0.5W、活性酶濃度為5U/ml的Taq聚合酶0.4W、甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種陽性對(duì)照DNA各I W、重量濃度≥99%的超純水20ul。檢測引物的序列:
【權(quán)利要求】
1.一種甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒的試劑包括檢測引物、IOXPCR Easy Taq緩沖液2.0W、IOmM的dNTPs0.5耵、活性酶濃度為5U/ml的Taq聚合酶0.4W、甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種陽性對(duì)照DNA各1W、重量濃度> 99%的超純水20ul ;檢測引物包括濃度為lpmol/W的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1W，濃度均為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種的上游引物1#77R、下游引物1#77S各1W，濃度均為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種上游引物2#40R、下游引物 2#40S 各 IPl ；1#77R 的序列 5’ - AAATCCAAGGTGCGAAGA -3’，1#77S 的序列為 5’ -CCAGGCTACACTAATACAACAG -3’ , 2#40R 的序列為 5’ - CTTTCGCTTCTCCCTTCA -3’ , 2#40S 的序列為 5’ - AACGCATCGTCTTCTATT -3’。
2.一種采用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟，(I)利用NuClean Plant Gen DNA Kit試劑盒提取被甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)或2號(hào)生理小種感染的植物組織DNA，利用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒方法提取被甘藍(lán)枯萎病菌侵染的土壤DNA ； (2 )采用檢測試劑盒對(duì)(I)步分離出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)將6W步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，分離后再經(jīng)溴化乙錠染色于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增出兩條大小分別為729bp和1927bp產(chǎn)物時(shí)，可判斷植物組織或土壤中存在甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增出兩條大小分別為729bp和309bp產(chǎn)物時(shí)，可判斷植物組織或土壤中存在甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測甘藍(lán)枯萎病菌的方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作方法是，①取(I)步的DNAlW，將其與試劑盒的試劑混合，該試劑盒的試劑包括濃度為lpmol/m的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1W，濃度為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)生理小種上游引物1#77R、下游引物1#77S各1W，濃度為lOpmol/W的甘藍(lán)枯萎病菌2號(hào)生理小種上游引物2#40R、下游引物2#40S各IW ,10XPCR Easy Taq緩沖液2.0W、IOmM的dNTPs0.5W、活性酶濃度為5U/ml的Taq聚合酶0.4W、甘藍(lán)枯萎病菌I號(hào)和2號(hào)生理小種陽性對(duì)照DNA各1W、重量濃度≥99%的超純水20ul ； ②將①步的混合物放入PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ° C預(yù)變性5 min；94。C 變性 40 sec ;60。C 退火 30 sec ；72 ° C 延伸 I min 30sec ； 35 個(gè)循環(huán)，最后 72 ° C延伸10 min o
【文檔編號(hào)】C12R1/77GK103451298SQ201310405495
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】楊宇紅, 張吉祥, 凌鍵, 陳國華, 茆振川, 謝丙炎 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所