專(zhuān)利名稱(chēng)：北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種冬蟲(chóng)夏草的母種選育方法，尤其涉及一種北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法。屬于食用菌、藥用菌遺傳育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草Cord yceps sinensis是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材,其所具有的特殊藥理作用和治療功效已得到人們認(rèn)可。近年來(lái)由于人類(lèi)活動(dòng)范圍的擴(kuò)大，生態(tài)環(huán)境的惡化，導(dǎo)致野生冬蟲(chóng)夏草持續(xù)減少，價(jià)格也持續(xù)飆升。到2010年優(yōu)質(zhì)蟲(chóng)草已經(jīng)銷(xiāo)售到16萬(wàn)元/公斤(干)。為解決冬蟲(chóng)夏草資源緊缺問(wèn)題，人們很早就開(kāi)始關(guān)注蛹蟲(chóng)草，從1986年起，人們把野生蛹蟲(chóng)草采集回來(lái)，通過(guò)組織分離獲得菌種，20多年里，蛹蟲(chóng)草栽培獲得重大技術(shù)突破。目前它已經(jīng)成為冬蟲(chóng)夏草的最佳替代品。全世界已知蟲(chóng)草類(lèi)有350余種，我國(guó)目前有62種，但最為昂貴的只有冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草。但目前北冬蟲(chóng)夏草人工栽培中因菌種退化問(wèn)題而導(dǎo)致的生產(chǎn)用母種種源栽培后不能穩(wěn)定出草，從而制約了北冬蟲(chóng)夏草大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決目前北冬蟲(chóng)夏草人工栽培中因菌種退化問(wèn)題而導(dǎo)致的生產(chǎn)用母種種源栽培后不能穩(wěn)定出草，從而制約了北冬蟲(chóng)夏草大規(guī)模生產(chǎn)所帶來(lái)的種源技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，是以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體作為母種選育初始種源，在對(duì)北蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行組織分離中采用雙氧水作為活體材料消毒劑，而不使用乙醇和生汞作為消毒劑，采用分生孢子涂布法進(jìn)行母種繼代培養(yǎng)，在菌落和可結(jié)實(shí)性菌絲評(píng)價(jià)篩選中先后使用了獨(dú)特的母種培養(yǎng)基及一整套仿野生生態(tài)環(huán)境培育方法，并通過(guò)菌絲顯微形態(tài)學(xué)觀察和選擇菌落子實(shí)體原基形成時(shí)間作為選育參數(shù)；該方法的具體實(shí)現(xiàn)步驟是I)以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體為材料通過(guò)組織分離手段獲得母種選育初始種源；2)組織分離中不使用乙醇和生汞作為消毒劑處理活體材料，采用5%的雙氧水作為活體材料消毒劑，噴霧消毒后20分鐘可進(jìn)行菌種分離工作；3)母種繼代培養(yǎng)接種方法采用分生孢子轉(zhuǎn)接法；4)接種后菌管在下列條件下培養(yǎng)培養(yǎng)溫度20°C ±2°C濕度60% ±5%接種后前2天避光培養(yǎng)，從第3天到第10天全程見(jiàn)光培養(yǎng)，光源采用日光燈照度前低后高，從1500勒克斯到6000勒克斯；5)選擇性狀優(yōu)良菌絲的菌管作為后續(xù)選育出發(fā)菌株；6)模擬北冬蟲(chóng)夏草自然生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行子實(shí)體原基誘導(dǎo)，模擬條件為根據(jù)白天和夜晚輪回以12小時(shí)為時(shí)長(zhǎng)，白天給予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ±2°C避光培養(yǎng)，該處理前要在無(wú)菌條件下給菌管內(nèi)菌絲換氣，連續(xù)處理3天；
7)從第4天起以20°C ±2°C 6000勒克斯光照條件培養(yǎng)，以7_10天內(nèi)通過(guò)解剖鏡或放大鏡觀察以子實(shí)體原基形成多，均勻，色澤深褐菌管為可結(jié)實(shí)性母種資源；8)對(duì)選育的可結(jié)實(shí)性母種資源進(jìn)行凹玻片微室無(wú)菌培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，根據(jù)分生孢子在菌絲體上的著生狀態(tài)進(jìn)行判斷，最終獲得北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源。本發(fā)明的特點(diǎn)及有益效果通過(guò)以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體為材料，通過(guò)組織分離手段獲得母種選育初始種源，采用該材料作為組織分離材料，可以最大限度保證菌種的野生性狀，降低退化頻率；采用雙氧水作為活體材料消毒劑，而不使用乙醇和生汞作為消毒劑，可以避免乙醇作為消毒劑對(duì)組織材料極強(qiáng)的浸殺性，從而降低活 體材料成活性得不足，也可以避免升汞的高毒性、藥品難以購(gòu)買(mǎi)以及使用劑量和處理時(shí)間不宜掌握的不足，通過(guò)上述方法所獲得母種初始種源具有穩(wěn)定的遺傳性，其產(chǎn)量性狀和產(chǎn)生蟲(chóng)草素能力都很強(qiáng)。這一成果對(duì)于人工生產(chǎn)功能性北蟲(chóng)草具有重要價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，是以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體作為母種選育初始種源，在對(duì)北蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行組織分離中采用雙氧水作為活體材料消毒劑，而不使用乙醇和生汞作為消毒劑，采用分生孢子涂布法進(jìn)行母種繼代培養(yǎng)，在菌落和可結(jié)實(shí)性菌絲評(píng)價(jià)篩選中先后使用了獨(dú)特的母種培養(yǎng)基及一整套仿野生生態(tài)環(huán)境培育方法，并通過(guò)菌絲顯微形態(tài)學(xué)觀察和選擇菌落子實(shí)體原基形成時(shí)間作為選育參數(shù)；該方法的具體實(shí)現(xiàn)步驟是以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體為材料通過(guò)組織分離手段獲得母種選育初始種源。組織分離中不使用乙醇和生汞作為消毒劑處理活體材料，采用5%的雙氧水作為活體材料消毒劑，噴霧消毒后20分鐘可進(jìn)行菌種分離工作。用于組織分離和繼代培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 5克氯化鈣0. 3克水1000ml，復(fù)合維生素(21金維他)100毫克瓊脂粉18克蒸餾水1000毫升。母種繼代培養(yǎng)接種方法采用分生孢子轉(zhuǎn)接法。接種后菌管在下列條件下培養(yǎng)培養(yǎng)溫度20°C ±2°C濕度60% ±5%接種后前2天避光培養(yǎng)，從第3天到第10天全程見(jiàn)光培養(yǎng)，光源采用日光燈照度前低后高，從1500勒克斯到6000勒克斯。選擇菌絲生長(zhǎng)整齊，菌落毛毯狀平整，氣生菌絲不徒長(zhǎng)，菌絲轉(zhuǎn)色快(由白色轉(zhuǎn)成黃色然后到紅褐色)，色素分泌多的菌管作為后續(xù)選育出發(fā)菌株。以選育的出發(fā)菌株為材料，模擬北冬蟲(chóng)夏草自然生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行子實(shí)體原基誘導(dǎo)程序，所模擬條件為根據(jù)白天和夜晚輪回以12小時(shí)為時(shí)長(zhǎng)，白天給予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ± 2°C避光培養(yǎng)，該處理前要在無(wú)菌條件下給菌管內(nèi)菌絲換氣，連續(xù)處理3天。從第4天起以20°C ±2°C 6000勒克斯光照條件培養(yǎng)，以7_10天內(nèi)通過(guò)解剖鏡或放大鏡觀察以子實(shí)體原基(草芽)形成多，均勻，色澤深褐菌管為可結(jié)實(shí)性母種資源。對(duì)選育的可結(jié)實(shí)性母種資源進(jìn)行凹玻片微室無(wú)菌培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，根據(jù)分生孢子在菌絲體上的著生狀態(tài)進(jìn)行判斷，最終獲得北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源。本發(fā)明中對(duì)北蟲(chóng)草種源所限定的“可結(jié)實(shí)性”意指所用種源栽培后能夠正常出草，即形成產(chǎn)量性狀穩(wěn)定、形態(tài)學(xué)指標(biāo)明顯的北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體。實(shí)施例該方法是通過(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn)的
以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體，通過(guò)組織分離手段獲得母種選育初始種源；組織分離所使用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 5克氯化鈣0. 3克，水1000ml，21金維他100毫克，瓊脂粉18克及蒸餾水1000毫升；組織分離中不使用乙醇和生汞作為消毒劑處理活體材料，而是采用5%的雙氧水作為活體材料消毒劑，噴霧消毒后20分鐘可進(jìn)行菌種分離工作；采用分生孢子轉(zhuǎn)接法進(jìn)行母種繼代培養(yǎng)接種。用于繼代培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基配方同上述組織分離所使用的培養(yǎng)基配方；接種后菌管在下列條件下培養(yǎng)培養(yǎng)溫度20°C ±2°〇，濕度60%±5(%;接種后的前2天避光培養(yǎng)，從第3天到第10天全程見(jiàn)光培養(yǎng)，光源采用日光燈照度前低后高，即從1500勒克斯到6000勒克斯。選擇出發(fā)菌株，選菌絲生長(zhǎng)整齊，菌落毛毯狀平整，氣生菌絲不徒長(zhǎng)，菌絲轉(zhuǎn)色快(由白色轉(zhuǎn)成黃色然后到紅褐色)，色素分泌多的菌管作為后續(xù)選育出發(fā)菌株；對(duì)選育出的出發(fā)菌株，模擬北冬蟲(chóng)夏草自然生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行子實(shí)體原基誘導(dǎo)，模擬條件為根據(jù)白天和夜晚輪回以12小時(shí)為時(shí)長(zhǎng)，白天給予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ±2°C避光培養(yǎng)，在進(jìn)行該處理前，要在無(wú)菌條件下給菌管內(nèi)菌絲換氣，連續(xù)處理3天;從第4天起以20°C ±2°C，6000勒克斯光照條件培養(yǎng)，以7_10天內(nèi)通過(guò)解剖鏡或放大鏡觀察以子實(shí)體原基(草芽)形成多，均勻，色澤深褐菌管為可結(jié)實(shí)性母種資源；對(duì)選育的可結(jié)實(shí)性母種資源進(jìn)行凹玻片微室無(wú)菌培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，根據(jù)分生孢子在菌絲體上的著生狀態(tài)進(jìn)行判斷，最終獲得北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源。
權(quán)利要求
1.北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，是以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體作為母種選育初始種源，其特征在于在對(duì)北蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行組織分離中采用雙氧水作為活體材料消毒劑，而不使用乙醇和生汞作為消毒劑，采用分生孢子涂布法進(jìn)行母種繼代培養(yǎng)，在菌落和可結(jié)實(shí)性菌絲評(píng)價(jià)篩選中先后使用了獨(dú)特的母種培養(yǎng)基及一整套仿野生生態(tài)環(huán)境培育方法，并通過(guò)菌絲顯微形態(tài)學(xué)觀察和選擇菌落子實(shí)體原基形成時(shí)間作為選育參數(shù)； 該方法的具體實(shí)現(xiàn)步驟是 1)以野生鮮北蟲(chóng)草或人工培育的蠶蛹鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體為材料通過(guò)組織分離手段獲得母種選育初始種源； 2)組織分離中不使用乙醇和生汞作為消毒劑處理活體材料，采用5%的雙氧水作為活體材料消毒劑，噴霧消毒后20分鐘可進(jìn)行菌種分離工作； 3)母種繼代培養(yǎng)接種方法采用分生孢子轉(zhuǎn)接法； 4)接種后菌管在下列條件下培養(yǎng)培養(yǎng)溫度20°C±2°C濕度60% ±5%接種后前2天避光培養(yǎng)，從第3天到第10天全程見(jiàn)光培養(yǎng)，光源采用日光燈照度前低后高，從1500勒克斯到6000勒克斯； 5)選擇性狀優(yōu)良菌絲的菌管作為后續(xù)選育出發(fā)菌株； 6)模擬北冬蟲(chóng)夏草自然生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行子實(shí)體原基誘導(dǎo)，模擬條件為根據(jù)白天和夜晚輪回以12小時(shí)為時(shí)長(zhǎng)，白天給予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ±2°C避光培養(yǎng)，該處理前要在無(wú)菌條件下給菌管內(nèi)菌絲換氣，連續(xù)處理3天； 7)從第4天起以20°C±2°C 6000勒克斯光照條件培養(yǎng)，以7_10天內(nèi)通過(guò)解剖鏡或放大鏡觀察以子實(shí)體原基形成多，均勻，色澤深褐菌管為可結(jié)實(shí)性母種資源； 8)對(duì)選育的可結(jié)實(shí)性母種資源進(jìn)行凹玻片微室無(wú)菌培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，根據(jù)分生孢子在菌絲體上的著生狀態(tài)進(jìn)行判斷，最終獲得北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，其特征在于用于組織分離和繼代培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 5克氯化鈣0. 3克水1000ml，復(fù)合維生素100毫克瓊脂粉18克蒸餾水1000毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，其特征在于所述性狀優(yōu)良菌絲的菌管，為菌絲生長(zhǎng)整齊，菌落毛毯狀平整，氣生菌絲不徒長(zhǎng)，菌絲轉(zhuǎn)色快，色素分泌多的菌管。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，其特征在于所述復(fù)合維生素采用21金維他。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，其特征在于菌落培養(yǎng)溫度為18-20°C ±2°C，光照強(qiáng)度在1500勒克斯到6000勒克斯。
全文摘要
北冬蟲(chóng)夏草可結(jié)實(shí)性母種資源選育方法，是為了解決目前北冬蟲(chóng)夏草人工栽培中因菌種退化問(wèn)題而導(dǎo)致的生產(chǎn)用母種種源栽培后不能穩(wěn)定出草，從而制約北蟲(chóng)草大規(guī)模生產(chǎn)所出現(xiàn)的技術(shù)問(wèn)題而設(shè)計(jì)的。該方法以特殊的鮮北蟲(chóng)草子實(shí)體為組分材料，采用無(wú)害性表面消毒劑處理材料，在孢子分離后獲得菌落，通過(guò)可結(jié)實(shí)性菌絲評(píng)價(jià)篩選等技術(shù)評(píng)價(jià)程序，獲得具有遺傳穩(wěn)定性的北蟲(chóng)草可結(jié)實(shí)性種源。該種源具有極高的結(jié)實(shí)性，從而可應(yīng)用于北冬蟲(chóng)夏草大規(guī)模工廠化栽培中。對(duì)人工生產(chǎn)功能性北蟲(chóng)草具有重要價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A01G31/00GK102640659SQ20111004373
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月22日
發(fā)明者張治平, 張紅, 徐方旭, 朱明光, 王升厚 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)師范大學(xué)