專(zhuān)利名稱(chēng)：一種復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生態(tài)制劑，具體地說(shuō)是涉及包含多種益生菌的復(fù)合微生態(tài) 制劑及其應(yīng)用，屬于微生態(tài)制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療藥物基本仍采用抗生素，但由于長(zhǎng)期、大量使用抗 生素，耐藥性、菌群失調(diào)、免疫力下降、疾病復(fù)發(fā)率高、藥物殘留等種種弊端日益嚴(yán)重，同時(shí) 也嚴(yán)重危害動(dòng)物機(jī)體及人類(lèi)健康。當(dāng)前，世界各國(guó)對(duì)抗生素各自采取了禁用或限制使用的 措施，如歐盟從2006年全面禁止使用抗生素；世界衛(wèi)生組織(WTO)提出了“在食用動(dòng)物中 減少抗生素使用的全球原則”；我國(guó)已啟動(dòng)“飼料安全工程”，并禁用了一批毒性和殘留較大 的藥物。在此形式下，改變養(yǎng)殖觀念、預(yù)防重于治療，并開(kāi)發(fā)應(yīng)用無(wú)毒、無(wú)藥殘的新型綠色飼 料添加劑是必然趨勢(shì)。微生態(tài)制劑是目前常用和研究較多的一種綠色、安全的飼料添加劑，此類(lèi)制劑是 由動(dòng)物有益菌經(jīng)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)得到的，包含有很多有益微生物及其代謝產(chǎn)物構(gòu)成的活菌 制劑，可以直接飼喂動(dòng)物。微生態(tài)制劑通過(guò)維持腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡而發(fā)揮作用，具有防 病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)生長(zhǎng)、增加體重等多種功能，且無(wú)污染，無(wú)殘留，不產(chǎn)生抗藥性，是 一種綠色、安全的飼料添加劑。目前，市場(chǎng)上的微生態(tài)制劑存在以下幾個(gè)方面的主要質(zhì)量問(wèn)題(1)活菌含量低， 而研究表明，如果一種菌在盲腸內(nèi)容物中的濃度低少107個(gè)/g，則該菌產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn) 物不足以影響宿主，難以滿(mǎn)足治療需要；(2)水分含量偏高，這是影響微生態(tài)制劑質(zhì)量的重 要因素之一；(3)不耐抗生素；(4)對(duì)胃酸和膽鹽不穩(wěn)定，致使只有少數(shù)菌株進(jìn)入腸道后仍 具有活性，達(dá)不到發(fā)揮作用所需的活菌數(shù)量。由于微生態(tài)制劑存在的這些質(zhì)量問(wèn)題，從而影 響了其在動(dòng)物上的應(yīng)用效果，限制了微生態(tài)制劑的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種活菌含量高、水分含量低、包含具有耐胃酸、耐膽鹽、 耐高溫及耐受常用抗生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶及抑制病原菌等益生功能的多種益生菌 的微生態(tài)制劑。本發(fā)明的另一目的在于提供該微生態(tài)制劑的用途。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種復(fù)合微生態(tài)制劑，該制劑包含地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)CGMCC No. 2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、糞腸球菌 (Enterococcus faecium) CGMCC No. 2386 菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2388菌粉中的任三種或四種。其中，所述的地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母具有良好的耐胃酸、耐膽鹽、耐高 溫、耐受常用抗生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶、抑制病原菌等益生功能，為申請(qǐng)人從健康動(dòng)物腸道或糞便中分離、選育得到，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定，并于2008年3 月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，保藏號(hào) 分別為CGMCC No. 2383、CGMCC No. 2386、CGMCC No. 2388。嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌可以按常規(guī)方法分離得到，也可從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)得到，本 發(fā)明為從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)得到。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌 粉、釀酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 0.8 2. 5 1. 5 2. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母 菌粉，上述各成分的重量配比為1 3. 5 0.8 3. 5 0.8 3. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉， 上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 1.5 2. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌 粉，上述各成分的重量配比為1 1.5 2 2. 5 2 2. 5。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑還可進(jìn)一步包含載體，載體為石粉、葡萄糖、硫酸鉀鋁、 玉米芯粉中的任一種或兩種。本發(fā)明的另一目的在于提供該復(fù)合微生態(tài)制劑在畜禽飼料添加劑中的應(yīng)用。該復(fù) 合微生態(tài)制劑可以根據(jù)畜禽及其所處生長(zhǎng)階段不同確定包含的益生菌種類(lèi)、載體種類(lèi)及其 比例，以更有針對(duì)性的制成各畜禽通用型或?qū)Ｓ眯偷奈⑸鷳B(tài)制劑，從而更好的發(fā)揮微生態(tài) 制劑的功能，如本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢 桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉，載體為石粉，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 1.5 2.5 1.5 2. 5 3. 5 4. 5，即可制成豬通用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌數(shù)達(dá)2 5X109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、 釀酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 0.8 1.2 1.5 2.5 15 20，即制成仔豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌含量5 9X108cfu/g;復(fù)合 微生態(tài)制劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉、硫酸鉀鋁和石粉， 上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 0.8 1.2 4. 5 5. 5 1. 5 2. 5，即制成 母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌含量2 5X 109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含枯草 芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌僂和玉米芯粉，上述各成分的重量配比為 3 3. 5 3 3. 5 2. 5 3. 5 0. 5 1. 5，即制成飼料廠(chǎng)豬產(chǎn)品專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制 劑，益生菌總菌含量可達(dá)2 5X101(lCfU/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含糞腸球菌菌粉、地衣芽 孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比為1 0.8 1.2 1.5 2.5 15 20，即制成雛禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌含量5 9X108cfu/g;復(fù)合 微生態(tài)制劑包含嗜酸乳桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和石粉，上述各成分 的重量配比為1 1.5 2 2. 5 2 2. 5 5 5. 5，即制成肉禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài) 制劑，總有益菌數(shù)達(dá)2X 109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含地衣芽孢桿菌菌粉、枯草芽胞桿菌 菌粉、釀酒酵母菌粉和石粉，上述各成分的重量配比為1 1 1.2 1 1.2 7 8， 即制成蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑，總有益菌數(shù)達(dá)2 5X 109cfu/g ；復(fù)合微生態(tài)制劑包含 枯草芽孢桿菌菌粉、地衣芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌粉和玉米芯粉，上述各成分的重量配比 為3 3 3. 5 3 3. 5 0. 5 1. 5，即制成飼料廠(chǎng)雞產(chǎn)品專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑，益
4生菌總菌含量可達(dá)2 5X 101Qcfu/g。本發(fā)明中所選育的地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母與枯草芽孢桿菌和嗜酸乳 桿菌在制備中采用液體深層高密度發(fā)酵技術(shù)和噴干或者凍干一系列的后處理加工工藝技 術(shù)制成菌粉，制劑中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫及耐受常用抗 生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶及抑制病原菌等益生功能。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑能提高飼料利用效率，增加肉蛋奶等產(chǎn)量，促進(jìn)動(dòng)物生 長(zhǎng)，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus 1 icheniformis)CGMCC No. 2383、糞腸球菌 (Enterococcus faecium) CGMCC No. 2386 菌粉、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CGMCC No. 2388菌種的分離、選育及其菌粉的制備過(guò)程如下1、增菌培養(yǎng)將健康動(dòng)物(豬或者家禽)的新鮮糞便或腸道內(nèi)容物樣品接種于增 殖液體培養(yǎng)基中，在30 37°C恒溫培養(yǎng)增殖；2、分離純化對(duì)步驟1增菌培養(yǎng)物在增殖培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，從中挑取 各個(gè)具有特征形態(tài)的菌落再劃線(xiàn)培養(yǎng)和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離 的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后將斜面菌種保藏于4°C冰箱中，待用；其中所述增殖培養(yǎng)基為BPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、98號(hào)培養(yǎng)基中的一種；3、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良菌種的選育對(duì)步驟2所分離、純化的菌株進(jìn)行抗逆性篩選，可 以對(duì)所分離、純化的菌種直接進(jìn)行抗逆性能測(cè)定，從中篩選出抗逆性強(qiáng)的天然優(yōu)良菌種；或 通過(guò)梯度培養(yǎng)逐漸增加溶液的酸性(至PH為1.5左右)及膽汁鹽濃度，選出具有耐酸及耐 膽汁特性的菌株；或通過(guò)傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法、現(xiàn)代基因工程技術(shù)，定向選育出抗逆 性強(qiáng)的菌種；再做菌種鑒定及生物學(xué)性能測(cè)定1)耐酸性測(cè)定將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中活化，30 37°C靜置培養(yǎng)8 20h，按5 10%接種量分別接種于pH值2. 0,3. 0,4. 0的人工模擬胃液中，Oh計(jì)數(shù)作對(duì)照， 2h、6h取樣用磷酸緩沖液按10倍系列稀釋?zhuān)M(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率；其中所述種子培養(yǎng)基為BPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、98號(hào)培養(yǎng)基中的一種；2)耐膽鹽測(cè)定將斜面菌種接種于培養(yǎng)基中，30 37°C靜置培養(yǎng)8_24h活化，按 5 10%接種量分別接種于0. 03%,0. 1%,0. 2%,0. 3%不同濃度的豬膽鹽溶液中，Oh計(jì)數(shù) 作對(duì)照，2h、6h取樣用生理鹽水按10倍系列稀釋計(jì)數(shù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率；3)耐高溫測(cè)定將斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，30 37°C培養(yǎng)16_24h活化，分 別于50°C 80°C水浴處理15 30min，處理前的做對(duì)照，計(jì)算存活率；4)耐藥性測(cè)定采用藥敏性紙片法；5)產(chǎn)酶測(cè)定采用中華人民共和國(guó)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，工業(yè)用α-淀粉酶制劑(QB/ Τ1805. 1-1993)，工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法(QB/T1803-1993)對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶 活力測(cè)定；采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)用蛋白酶制劑(QB/T1805. 3-1993)，對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行蛋 白酶活力測(cè)定；6)產(chǎn)酸測(cè)定采用離子色譜法對(duì)糞腸球菌CGMCC No. 2386進(jìn)行有機(jī)酸產(chǎn)量測(cè)定；7)抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法(又稱(chēng)管碟法)對(duì)常見(jiàn)致病菌進(jìn)行抑菌測(cè)定；本發(fā)明所選育的地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383在人工模擬胃液(pH2. 0 4. 0)中 處理6h，存活率在49. 5%以上；在豬膽鹽溶液(濃度0. 3-3g/kg)處理6h，存活率為100%;50 80°C處理15 30min，存活率為100% ；對(duì)青霉素G、阿莫西林、大觀霉素、紅霉素、吉 他霉素、桿菌肽鋅、林可霉素7種抗生素有耐藥性；對(duì)大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、雞白 痢沙門(mén)氏菌三種致病菌均有較好的抑制作用，抑菌圈直徑在12 20mm;產(chǎn)蛋白酶活力為 1000u/ml ；產(chǎn)淀粉酶活力為800u/ml。本發(fā)明所選育的糞腸球菌CGMCC No. 2386在人工模擬胃液(pH2. O 4. 0)中處 理6h，存活率在18.0%以上；在豬膽鹽溶液(濃度0. 3-3g/kg)處理6h，存活率為12.6% 以上；50 80°C處理15 30min，存活率為0. 43%；對(duì)青霉素G、頭孢噻肟、慶大霉素、大觀 霉素、新霉素、紅霉素、吉他霉素、桿菌肽鋅、林可霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方 磺胺甲基異惡唑13種抗生素有耐藥性；對(duì)大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門(mén)氏菌 三種致病菌均有很好的抑制作用，抑菌圈直徑在16 21mm ；乳酸、乙酸、異丁酸總酸產(chǎn)量為 4. 2g/L，乳酸產(chǎn)率達(dá)到89.4%。本發(fā)明所選育的釀酒酵母CGMCC No. 2388在人工模擬胃液(pH2. O 4. 0)中處理 6h，存活率在15. 4%以上；在豬膽鹽溶液(濃度0. 3-3g/kg)處理6h，存活率為11. 5%以上； 50 80°C處理15 30min，存活率為0. 19% ；4、菌粉的制備地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383菌粉的制備方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將地衣芽孢桿菌菌種接種于BPY平板培養(yǎng)基上，于30_37°C培 養(yǎng)12_24h，使地衣芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種于斜面培養(yǎng)基上，于 30-37 °C 培養(yǎng) 24-36h ；2) 一級(jí)種子的制備將步驟1)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接茄子瓶BPY斜面培 養(yǎng)基上，于30 37°C培養(yǎng)12 16h，使其處于對(duì)數(shù)中后期，得一級(jí)種子；3) 二級(jí)種子的制備將步驟2)制備的一級(jí)種子用無(wú)菌水制成菌懸液，接種到裝有 1-1. 6M3 BPY種子培養(yǎng)基的2M3種子罐中，溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速200 250rpm，罐壓0. 05Mpa, 通風(fēng)比1 0.6 0.8 (14. 4 19. 2M3/h)，培養(yǎng)10 14h，為二級(jí)種子液;4)地衣芽孢桿菌發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級(jí)種子液按照3 10%的接 種量接種到裝有12 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速220 300rpm， 罐壓0. 05Mpa，通風(fēng)比1 0.6 0.8，培養(yǎng)16 20h，至芽孢形成率90%以上，活菌數(shù)為 1 2Χ101(ι(^ιι/πι1，則中止發(fā)酵，得地衣芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮1 2%，豆粕1 2%，氯化鈉0. 2 0. 8%，硫酸鎂 0. 01 0. 05% ；5)地衣芽孢桿菌菌粉的制備在步驟4)制備的發(fā)酵液中加入20 25%的填充 物，混勻，進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度120 130°C，排風(fēng)溫度40 50°C，霧化器轉(zhuǎn)速15000 ISOOOrpm,得到水分含量< 5%的地衣芽孢桿菌菌粉。所述的填充物為米糠、沸石粉、稻殼粉中的任一種。B、糞腸球菌CGMCC No. 2386菌粉的制備方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將糞腸球菌菌種接種于MRS平板培養(yǎng)基上，于32 37°C培養(yǎng) 12 24h，使糞腸球菌菌復(fù)壯，并形成單菌落；挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于32 37°C 培養(yǎng) 24 36h ；2) 一級(jí)種子的制備將步驟1)培養(yǎng)的糞腸球菌斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝有250ml 300ml MRS培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于32 37°C培養(yǎng)12 16h，轉(zhuǎn)速100 150rpm，使 其處于對(duì)數(shù)中后期，為一級(jí)種子；3) 二級(jí)種子的制備將步驟2)培養(yǎng)的乳酸桿菌一級(jí)種子轉(zhuǎn)接到裝有1. 2 1. 6L MRS培養(yǎng)基的2. OL三角瓶中，于32 37°C靜止培養(yǎng)12 16h，為二級(jí)種子液；4)發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級(jí)種子液按照3 6%的接種量接種到裝有 12 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度35 37°C，轉(zhuǎn)速120 160rpm，罐壓0. 05Mpa，培 養(yǎng)16 20h，至活菌數(shù)為2 5 X 109cfu/ml，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1 2 %，大豆蛋白胨1 2 %，硫酸銨0. 5 1. 0 %， 氯化鈉0. 2 0. 8%，硫酸鎂0. 01 0. 05% ；5)糞腸球菌菌粉的制備將步驟4)制備的發(fā)酵液，3500 5000rpm離心，得到菌 泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為15 20%的凍干保護(hù)劑，混勻，于-25°C -45°C冷 凍干燥，得到水分含量< 5%的糞腸球菌菌粉。所述的凍干保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖、麥芽糊精和谷氨酸鈉的混合物，按 照脫脂奶粉甘油蔗糖麥芽糊精谷氨酸鈉=2 0. 5 1. 0 0. 5 1. 0 0. 5 1. 5 0. 5 1. 0的比例混合而成。C、釀酒酵母CGMCC No. 2388菌粉的制備方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將冰箱保藏的釀酒酵母斜面菌種采用劃線(xiàn)接種的方法在98號(hào) 平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種，于28 32°C培養(yǎng)24 36h，使釀酒酵母復(fù)壯，并形成單菌落；挑取 單菌落于新鮮的98號(hào)斜面培養(yǎng)基上，于28 32°C培養(yǎng)24 36h，放置冰箱備用；2) 一級(jí)種子的制備將步驟1)培養(yǎng)好的釀酒酵母新鮮斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝有 200 250ml 98號(hào)培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于28 32°C培養(yǎng)12 16h，轉(zhuǎn)速100 150rpm，使其處于對(duì)數(shù)中后期，為一級(jí)種子；3) 二級(jí)種子的制備將步驟2)培養(yǎng)好的釀酒酵母種子液轉(zhuǎn)接到裝有1. 0 1. 2L 98號(hào)培養(yǎng)基的2. OL三角瓶中，于28 32°C靜止培養(yǎng)12 16h，為二級(jí)種子液；4)發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級(jí)種子按照3 10%的接種量接種到裝有 15 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度28 32°C，轉(zhuǎn)速150 200rpm，罐壓0. 05Mpa，培 養(yǎng)12 16h中止發(fā)酵，此時(shí)活菌數(shù)為1 3X109cfu/ml ；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為紅糖1 2%，大豆蛋白胨1 2%，酵母膏0. 2 0. 5%， 氯化鈉0.5 1.0%，硫酸鎂0.01 0. 05%，磷酸氫二鉀0.2 0.5% ；5)釀酒酵母菌粉的制備將步驟4)制備的發(fā)酵液，2000 3000rpm離心，得到菌 泥，加入與菌泥的重量/體積百分比為10 15%的凍干保護(hù)劑，混勻后于-25°c -45°c冷 凍干燥，得到水分含量< 5%的釀酒酵母菌粉；所述的凍干保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、麥芽糊精按照2 0.5 1 1 2比例 混合而成。通過(guò)下列實(shí)施例將更具體的說(shuō)明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說(shuō)明本 發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、優(yōu)良菌種的的分離、篩選、選育及鑒定
1)增菌培養(yǎng)將健康動(dòng)物(豬或者家禽)的新鮮糞便、腸道內(nèi)容物樣品接種于BPY 液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫培養(yǎng)增殖48h ；2)地衣芽孢桿菌的分離純化對(duì)步驟1)增菌培養(yǎng)物100°C水浴5min，然后在BPY 培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，從中挑取各個(gè)具有特征形態(tài)的菌落再劃線(xiàn)培養(yǎng)和分離，直至 為純菌落為止，革蘭氏染色鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于 4°C冰箱中，待用；菌落形態(tài)菌落表面粗糙，不光澤，乳白色不透明，邊緣不整齊，直徑2_3mm，隨著 培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，變?yōu)榧t褐色；鏡檢細(xì)胞為桿菌1. 6 3. 8 μ mXO. 6 1. 2 μ m，革蘭氏陽(yáng) 性，芽孢中生，橢圓形，不膨大，初步確定為地衣芽孢桿菌；3)糞腸球菌的分離純化對(duì)步驟1)增菌培養(yǎng)基在MRS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線(xiàn)培 養(yǎng)，從中挑取各個(gè)具有特征形態(tài)的菌落再劃線(xiàn)培養(yǎng)和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色 鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于4°C冰箱中，待用；菌落形態(tài)菌落圓整，表面光滑，呈乳白色，大小l_3mm ；細(xì)胞圓形或卵圓形，直徑 0. 5 1. Oum，大多數(shù)成短鏈或?qū)Γ锾m氏染色陽(yáng)性；4)釀酒酵母的分離純化對(duì)步驟1)增菌培養(yǎng)基在98號(hào)培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線(xiàn)培 養(yǎng)，從中挑取各個(gè)具有特征形態(tài)的菌落再劃線(xiàn)培養(yǎng)和分離，直至為純菌落為止，革蘭氏染色 鏡檢，將分離的疑似純菌落接種試管斜面中增殖，然后保存于4°C冰箱中，待用；菌落形態(tài)菌落為軟而濕潤(rùn)，乳酪色、有光澤、平坦或稍凸起、邊緣整齊；細(xì)胞為球 形或卵形，直徑5 10um，繁殖方式芽殖；對(duì)步驟3)或者4)所分離、純化的糞腸球菌或者釀酒酵母菌株進(jìn)行抗逆性篩選，可 以對(duì)所分離、純化的菌種直接進(jìn)行抗逆性能測(cè)定，從中篩選出抗逆性強(qiáng)的天然優(yōu)良菌種；或 通過(guò)梯度培養(yǎng)逐漸增加溶液的酸性(至PH為1.5左右)及膽汁鹽濃度，選出具有耐酸及耐 膽汁特性的菌株；或通過(guò)傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法、現(xiàn)代基因工程技術(shù)，定向選育出抗逆 性強(qiáng)的菌種；并對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，最后對(duì)選育出的菌株進(jìn)行抗逆性性能測(cè)定。實(shí)施例2、3株優(yōu)良菌種的抗逆性和生物學(xué)性能測(cè)定3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383、糞腸球菌CGMCC No.2386、釀酒酵母 CGMCC No. 2388的生物學(xué)性能和抗逆性能測(cè)定1)地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383培養(yǎng)物的制備將冰箱保藏的斜面菌種接種到 BPY種子培養(yǎng)基中活化，37°C、200rpm培養(yǎng)18h，得到芽孢率在95%以上的培養(yǎng)物；2)糞腸球菌CGMCC No. 2386培養(yǎng)物的制備將冰箱保藏的斜面菌種接種到MRS種 子培養(yǎng)基中活化，35°C、IOOrpm培養(yǎng)16h，即得；3)釀酒酵母CGMCC No. 2388培養(yǎng)物的制備將冰箱保藏的斜面菌種接種到98號(hào) 種子培養(yǎng)基中活化，30°C、150rpm培養(yǎng)16h，即得；4)耐酸性測(cè)定將上述制備的培養(yǎng)物按5%接種量分別接種于pH值2.0、3.0、4.0 的人工模擬胃液中，Oh計(jì)數(shù)作對(duì)照，2h、6h取樣用磷酸緩沖液按10倍系列稀釋?zhuān)M(jìn)行平板活 菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。本發(fā)明選育的3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383、糞腸球菌CGMCC No. 2386、 釀酒酵母CGMCC No. 2388在胃酸中存活率結(jié)果見(jiàn)表1。人工模擬胃液的制備量取9. 5% 10. 5%濃鹽酸16. 4毫升，加蒸餾水至1000毫
8升，做基礎(chǔ)人工胃液，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)PH值2. 0、3. 0、4. 0，各取10mL(9mL)，分裝于試管 中，100°C下蒸汽滅菌15分鐘，在無(wú)菌條件下，每IOmL液體中加入0. IOOg胃蛋白酶。表13株菌種在人工模擬胃液中的存活率 5)耐膽鹽測(cè)定將上述制備的3株菌種的培養(yǎng)物，按5%接種量分別接種于 0. 03%,0. 1%,0.2%,0.3%不同濃度的豬膽鹽溶液中，Oh計(jì)數(shù)作對(duì)照，2h、6h取樣用生理 鹽水按10倍系列稀釋計(jì)數(shù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。本發(fā)明所選育的3株菌種地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383、糞腸球菌CGMCC No. 2386、釀酒酵母CGMCC No. 2388在膽鹽中存活率結(jié)果見(jiàn)表2。膽鹽的制備0.85%生理鹽水中各9mL，分裝于試管中，121°C下蒸汽滅菌30分鐘， 在無(wú)菌條件下，制成0. 03%、0. 1%、0. 2%、0. 3%不同濃度的豬膽鹽溶液。表2 3株菌種在不同濃度豬膽鹽中處理6h的存活率存活率(%) 6)耐高溫測(cè)定將上述制備的3株菌種的培養(yǎng)物，分別于501、601、701、801水 浴處理15min、30min，計(jì)算存活率。表33株菌種在不同高溫下處理不同時(shí)間的存活率(％ ) 7)耐藥性測(cè)定采用藥敏紙片法。表43株菌種的耐藥性測(cè)定結(jié)果 8)產(chǎn)酶測(cè)定采用中華人民共和國(guó)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，工業(yè)用α-淀粉酶制劑(QB/ Τ1805. 1-1993)，工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法(QB/T1803-1993)對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶 活力測(cè)定；采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)用蛋白酶制劑(QB/T1805. 3-1993)，對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行蛋 白酶活力測(cè)定。地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383淀粉酶活力為800u/ml ；蛋白酶活力為1000u/ml。9)產(chǎn)酸測(cè)定采用離子色譜法對(duì)糞腸球菌CGMCC No. 2386發(fā)酵液進(jìn)行了產(chǎn)酸測(cè)定。產(chǎn)酸結(jié)果表明，糞腸球菌CGMCC No. 2386總有機(jī)酸量為4. 2g/L，其中乳酸量為 3. 76g/L，乙酸量為0. 39g/L，還有少量的異丁酸。10)抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法對(duì)常見(jiàn)致病菌進(jìn)行抑菌測(cè)定。a、在裝有IOmL營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的試管中活化三株致病菌K99、金黃色葡萄球菌、 雞白痢沙門(mén)氏菌，37°C恒溫培養(yǎng)20h ；b、雙層平板的制備取直徑90mm的平板，注入滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂15 20mL，水平放 置使之凝固，作為底層，另取營(yíng)養(yǎng)瓊脂(冷至50°C左右)與37°C 240h培養(yǎng)的指示菌液適量 (50mL培養(yǎng)基加SmL左右)混勻，吸取IOmL澆在底層培養(yǎng)基上，水平放置使之凝固，作為菌 層；C、加樣品用無(wú)菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯，打開(kāi)皿蓋，放在培養(yǎng)基上。在牛津杯 中加滿(mǎn)相同量的發(fā)酵液上清液(約200uL)，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)。將加完樣的雙碟小心放入 370C恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)16-18h后，取出測(cè)量抑菌圈大小。表53株菌種對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌結(jié)果 實(shí)施例3、地衣芽孢桿菌CGMCC No. 2383菌粉的制備1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將地衣芽孢桿菌菌種接種于BPY平板培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng) 24h，使地衣芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種于斜面培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng) 36h ；2) 一級(jí)種子的制備將步驟1)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接茄子瓶斜面培養(yǎng)基 上，于37°C培養(yǎng)12h，使其處于對(duì)數(shù)中后期，得一級(jí)種子；所述的斜面培養(yǎng)基為BPY固體培養(yǎng)基；3) 二級(jí)種子的制備將步驟2)制備的一級(jí)種子用無(wú)菌水制成菌懸液，接種到裝 有1. 6M3BPY種子培養(yǎng)基的2M3種子罐中，溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm,罐壓0. 05Mpa,通風(fēng)比 1 0. 6 0. 8 (14. 4 19. 2M3/h)，培養(yǎng) 10 14h,為二級(jí)種子液；4)地衣芽孢桿菌發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級(jí)種子液按照10%的接種量 接種到裝有16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度37°C，轉(zhuǎn)速220rpm，罐壓0. 05Mpa，通風(fēng)比 1 0.6 0.8，培養(yǎng)20h，至芽孢形成率90%以上，活菌數(shù)為1 2X101QCfu/ml，則中止發(fā) 酵，得地衣芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮2%，豆粕1%，氯化鈉0.8%，硫酸鎂0.01%。5)地衣芽孢桿菌菌粉的制備在步驟4)制備的發(fā)酵液中加入25%的填充物米 糠，混勻，進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度120 130°C，排風(fēng)溫度40 50°C，霧化器轉(zhuǎn)速15000 ISOOOrpm,得到水分含量< 5%的地衣芽孢桿菌菌粉。所述的填充物為米糠、沸石粉、稻殼粉中的任一種。實(shí)施例4、糞腸球菌CGMCC No. 2383菌粉的制備1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將糞腸球菌菌種接種于MRS平板培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)24h，使 糞腸球菌菌復(fù)壯，并形成單菌落；挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)24h ；2) 一級(jí)種子的制備將步驟1)培養(yǎng)的糞腸球菌斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝有300mlMRS培 養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于37°C培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速lOOrpm，使其處于對(duì)數(shù)中后期，為一級(jí)種子；3) 二級(jí)種子的制備將步驟2)培養(yǎng)的糞腸球菌一級(jí)種子轉(zhuǎn)接到裝有1. 6LMRS培 養(yǎng)基的2. OL三角瓶中，于37°C靜止培養(yǎng)12h，為二級(jí)種子液；4)發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級(jí)種子液按照3%的接種量接種到裝有 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度37°C，轉(zhuǎn)速120rpm，罐壓0. 05Mpa,培養(yǎng)16h，至活菌數(shù)為 2X109cfu/ml，中止發(fā)酵；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖2%，大豆蛋白胨1%，硫酸銨0.5%，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0. 05%。5)糞腸球菌菌粉的制備將步驟4)制備的發(fā)酵液，5000rpm離心，得到菌泥，加入 與菌泥的重量/體積百分比為20%的凍干保護(hù)劑，混勻，于_45°C冷凍干燥，得到水分含量 <5%的糞腸球菌菌粉；所述的凍干保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖、麥芽糊精和谷氨酸鈉的混合物，按 照脫脂奶粉甘油蔗糖麥芽糊精谷氨酸鈉=2 1.0 1.0 1.5 1.0的比例 混合而成。實(shí)施例5、釀酒酵母CGMCC No. 2383菌粉的制備1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將冰箱保藏的釀酒酵母斜面菌種采用劃線(xiàn)接種的方法在98號(hào) 平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種，于30°C培養(yǎng)46h，使釀酒酵母復(fù)壯，并形成單菌落；挑取單菌落于 新鮮的98號(hào)斜面培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)36h，放置冰箱備用；2) 一級(jí)種子的制備將步驟1)培養(yǎng)好的釀酒酵母新鮮斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝有200ml 98號(hào)培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于30°C培養(yǎng)12 16h，轉(zhuǎn)速150rpm，使其處于對(duì)數(shù)中后期， 為一級(jí)種子；3) 二級(jí)種子的制備將步驟2)培養(yǎng)好的釀酒酵母種子液轉(zhuǎn)接到裝有1. 2L98號(hào)培 養(yǎng)基的2. OL三角瓶中，于30°C靜止培養(yǎng)12h，為二級(jí)種子液；4)發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級(jí)種子按照10%的接種量接種到裝有15 16M3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度30°C，轉(zhuǎn)速200rpm，罐壓0. 05Mpa,培養(yǎng)16h中止發(fā)酵，此 時(shí)活菌數(shù)為1. 5X109cfu/ml ；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為紅糖1%，大豆蛋白胨1%，酵母膏0.2%，氯化鈉0.5%，硫 酸鎂0. 01 %，磷酸氫二鉀0.2%。5)釀酒酵母菌粉的制備將步驟4)制備的發(fā)酵液，2000pm離心，得到菌泥，加入與 菌泥的重量/體積百分比為10 15%的凍干保護(hù)劑，混勻后于-25°c冷凍干燥，得到水分 含量<5%的釀酒酵母菌粉；所述的凍干保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、麥芽糊精按照2 0.5 1比例混合而成。實(shí)施例6、復(fù)合微生態(tài)制劑的制備表6復(fù)合微生態(tài)制劑的制備 實(shí)施例7、實(shí)施例6制備的仔豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)仔豬的功效試驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物選用35日齡斷奶，體重在9kg左右的長(zhǎng)白χ大白雜交仔豬作為試驗(yàn)動(dòng) 物，共120頭，試驗(yàn)豬來(lái)源于飼養(yǎng)管理規(guī)范、防疫措施嚴(yán)格的北京全利民豬場(chǎng)，一批選齊，出 生日期相差不超過(guò)7天。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用隨機(jī)單因子設(shè)計(jì)。試驗(yàn)分四組，每組有三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭斷 奶仔豬，組間和重復(fù)間體重差異不超過(guò)平均體重的5%。試驗(yàn)日糧采用玉米一豆粕型日糧作基礎(chǔ)日糧，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組I為 在基礎(chǔ)日糧上添加1%。仔豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑，試驗(yàn)組II為在基礎(chǔ)日糧上添加IOOg/ T預(yù)防拉稀的抗生素阿散酸，試驗(yàn)組III為在基礎(chǔ)日糧上添加1%。仔豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制 劑+添加100g/T預(yù)防拉稀的抗生素阿散酸?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表7。飼養(yǎng)管理采用地面平養(yǎng)飼養(yǎng)，各組間除日糧不同外，其它條件完全一致，按常規(guī) 進(jìn)行。人工投料、自由采食、自由飲水，保持豬舍清潔。試驗(yàn)期30天，預(yù)飼期7天。表7飼喂基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平 測(cè)試指標(biāo)及方法在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)早晨空腹對(duì)豬只稱(chēng)重，分別以重復(fù)組為單 位進(jìn)行全群稱(chēng)重、計(jì)算耗料量、日增重、料肉比、腹瀉率等指標(biāo)，并進(jìn)行差異性顯著檢驗(yàn)。試 驗(yàn)結(jié)果如下(1)生產(chǎn)性能試驗(yàn)仔豬的生產(chǎn)性能見(jiàn)表8。從表8可以看出，在平均日增重仔豬試驗(yàn)組I、試驗(yàn) 組II和試驗(yàn)組III比對(duì)照組分別提高7. 3%,7. 5%,9. 5% ；在料肉比方面試驗(yàn)組I、試驗(yàn)組II 和試驗(yàn)組III比對(duì)照組分別降低5. 5%,5. 2%,8. 0% ；在腹瀉率方面試驗(yàn)組I、試驗(yàn)組II和試 驗(yàn)組III比對(duì)照組分別降低67. 3%,47. 7%,70. 1%。試驗(yàn)組I與試驗(yàn)組II相比在日增重、料 肉比方面差異不顯著，但是在預(yù)防腹瀉方面差異顯著，說(shuō)明仔豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑可 以替代飼料中預(yù)防腹瀉的抗生素。試驗(yàn)組III在日增重、料肉比和腹瀉方面都好于試驗(yàn)組I、 試驗(yàn)組II和對(duì)照組，說(shuō)明仔豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑與抗生素合用有協(xié)同作用。在平均耗 料方面各組之間差異不顯著。表8試驗(yàn)仔豬的生產(chǎn)性能 實(shí)施例8、實(shí)施例6制備的母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)哺乳母豬的功效試驗(yàn)1、試驗(yàn)方法試驗(yàn)豬的選擇從豬場(chǎng)選擇臨產(chǎn)前1周左右分娩的母豬，選取健康無(wú)病、年齡、胎 次、體重基本一致的豬18頭隨機(jī)分成兩組，試驗(yàn)組和對(duì)照組各9頭。飼料組成對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組為在基礎(chǔ)日糧上添加1%。母豬專(zhuān)用型復(fù) 合微生態(tài)制劑。飼養(yǎng)管理試驗(yàn)在本場(chǎng)的同一產(chǎn)房?jī)?nèi)進(jìn)行，由同一飼養(yǎng)人員飼喂，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一 致，飼料采取干料加水拌濕后飼喂，在試驗(yàn)?zāi)肛i轉(zhuǎn)入產(chǎn)床時(shí)開(kāi)始飼喂試驗(yàn)料，日喂3次，自 由采食，以吃飽不剩料為原則。試驗(yàn)組和對(duì)照組分別統(tǒng)計(jì)耗料量、仔豬出生重和28天斷奶 體重，采取全天供水的辦法，任豬自由飲水。每日由飼養(yǎng)員清理糞便，打掃圈舍一次，隨時(shí)觀 察試驗(yàn)組的生長(zhǎng)和健康情況，不論是哺乳母豬還是仔豬，發(fā)生疾病，及時(shí)治療。2、試驗(yàn)結(jié)果及分析在試驗(yàn)期內(nèi)，添加飼喂0. 母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑的試驗(yàn)組28天斷奶均重 為8. 27kg，而未添加母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑的對(duì)照組28天斷奶均重為7. 54kg，試驗(yàn)組 比對(duì)照組多增重0. 73kg，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組差異顯著(ρ < 0. 05)，且試驗(yàn)組成活率明顯高于對(duì) 照組，其成活率分別為95. 83%和91. 67%。結(jié)果見(jiàn)表9。表9母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)哺乳母豬生產(chǎn)性能的影響 采食與健康情況整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，添加母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑的哺乳母豬 表現(xiàn)喜食、采食速度快、采食量比對(duì)照組略有增加，且毛色紅潤(rùn)光亮。耗材情況試驗(yàn)期間試 驗(yàn)組和對(duì)照組平均每頭哺乳母豬耗料6. 42kg和6. 31kg。試驗(yàn)組母豬在產(chǎn)仔8天后出現(xiàn)明顯的溢乳現(xiàn)象，表明母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑能夠提高母豬的泌乳量。試驗(yàn)后期，試驗(yàn)組 和對(duì)照組均有仔豬拉稀現(xiàn)象，肌注恩諾沙星和口服乳酶生治療后排糞正常，且試驗(yàn)仔豬毛 較稀，皮膚紅潤(rùn)，糞便減少且干燥，臭味也減少，說(shuō)明飼喂母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)于 調(diào)節(jié)哺乳母豬腸道內(nèi)微生物菌群平衡，防止仔豬腹瀉增強(qiáng)母豬的抗病能力，有一定作用。3、結(jié)論(1)母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑作為飼料添加劑可以提高哺乳母豬乳汁的分泌， 解決母豬乳汁不足的問(wèn)題；(2)在飼料中添加0. 母豬專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑可提高仔豬斷奶重和成活 率，經(jīng)濟(jì)效益顯著。實(shí)施例9、實(shí)施例6制備的蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)蛋雞的功效試驗(yàn)1、試驗(yàn)方法 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧隨機(jī)選用60周齡矮小蛋雞3000只，隨機(jī)分為2組，每組1500只， 按照隨機(jī)分組安排試驗(yàn)。試驗(yàn)日糧分別為I .空白對(duì)照組(基礎(chǔ)日糧組)；II .試驗(yàn)組(基礎(chǔ)日糧+0. 1% 蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑)?；A(chǔ)日糧其組成和營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表10。試驗(yàn)雞為三層籠養(yǎng)， 每籠3只，自由采食和飲水，按常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)管理，試驗(yàn)在北京密云水泉村蛋雞場(chǎng)進(jìn)行。表10基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分
注每千克日糧中維生素A12000IU，維生素D31500IU，維生素E25IU，維生素 K31. Omg,硫胺素5. 5mg,核黃素5. Omg,泛酸16mg，維生素B68. Omg,生物素0. 3mg,膽堿 500mg，葉酸 1. 8mg,維生素 B 120. 008mg,鐵 90mg，銅 20mg，碘 0. 45mg,錳 80mg，鋅 80mg，硒 0. 2mg，DL-蛋氨酸 1. 50g.測(cè)定指標(biāo)每天觀察記錄每重復(fù)產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、不合格蛋數(shù)和雞只死淘情況；每周 末統(tǒng)計(jì)耗料量；分別統(tǒng)計(jì)每組雞產(chǎn)蛋后期的產(chǎn)蛋率、蛋重、破損率、死亡率、采食量和料蛋 比。2、結(jié)果與分析2. 1、蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)矮小蛋雞生產(chǎn)性能的影響試驗(yàn)結(jié)果如表11所示，在產(chǎn)蛋后期，添加0. 蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑組II 產(chǎn)蛋率分別比空白對(duì)照組提高2. 53%，蛋重有所增加；在蛋雞死亡率和蛋殼破損率方面下 降。表11蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)矮小蛋雞生產(chǎn)性能的影響 3、結(jié)論(1)在飼料中添加0. 蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑能顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率， 產(chǎn)蛋率提高2. 53% ；(2)在飼料中添加0. 蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑能減少疾病的發(fā)生和降低蛋 雞的死亡率；(3)在飼料中添加0. 蛋禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑能能提高機(jī)體的免疫能力， 預(yù)防由于熱應(yīng)激或接種疫苗等方面引起的應(yīng)激反應(yīng)。綜上所述，本發(fā)明的微生態(tài)制劑添加到飼料中，對(duì)保證雞只健康狀態(tài)、協(xié)調(diào)促進(jìn)機(jī) 體消化吸收能力、提高蛋雞生產(chǎn)性能和飼料的消化利用率等均有很好的作用。實(shí)施例10、實(shí)施例6制備的肉禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)肉雞的功效試驗(yàn)1、試驗(yàn)材料與方法試驗(yàn)動(dòng)物與分組選用1日齡商品代艾維因混合健雛480只，采用完全隨機(jī)單因 子設(shè)計(jì)分4組進(jìn)行試驗(yàn)。每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30只(開(kāi)始體重組間差異不顯著，P > 0.05)。試驗(yàn)期49天。試驗(yàn)設(shè)計(jì)以維吉尼亞霉素作為抗生素對(duì)照，對(duì)照組基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組1 基礎(chǔ)日 糧+1%。肉禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑，試驗(yàn)組II 基礎(chǔ)日糧+5mg/kg維吉尼亞霉素。供試日糧與飼養(yǎng)管理本試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平各組完全相同(見(jiàn)表12)，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件各組完全一致。表12基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平 2、試驗(yàn)結(jié)果2. 1體增重各試驗(yàn)組的體增重均極顯著高于對(duì)照組(P < 0. 01〕，試驗(yàn)II組最高， 但與試驗(yàn)1組相比，差異不顯著(P > 0. 05)，兩個(gè)試驗(yàn)組體增重分別比對(duì)照組提高10. 24% 和12. 48%，說(shuō)明各試驗(yàn)組的增重效果均好于對(duì)照組。各階段增重效果詳見(jiàn)表13。表13.供試雞體重統(tǒng)計(jì)表單位g 2. 2采食量各組全期總采食量差異不顯著(P > 0. 05)，詳見(jiàn)表14。表14采食量統(tǒng)計(jì)表單位克/只 2. 3料重比、死亡率見(jiàn)表15表15料重比、死亡率分析表 各試驗(yàn)組料重比均明顯低于對(duì)照組(P < 0. 01)，分別比對(duì)照組降低了 7. 50%和 9. 58% ；死亡率各試驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組(P < 0. 01)，分別比對(duì)照組下降75. 65%和 82. 90% ；試驗(yàn)1組、試驗(yàn)II組之間差異不顯著。2. 4經(jīng)濟(jì)效益分析試驗(yàn)組1 多耗料多耗料(克/只)(4595. 9-4519. 75) X飼料價(jià)格(元/克) (0. 0028) = 0. 21322 元 菌粉成本全期耗菌粉(克/只)(4595. 90X0.1%)X菌粉價(jià)格(元/克)(0. 06) =0. 2757 元增重效益全期增重(克/只)(2073. 68-1880. 88) X銷(xiāo)售價(jià)格(元/克)(0. 01) =1. 928 元每只肉雞可多增收增重效益-多耗料成本_菌粉投入(1. 928-0. 21322-0. 2757) =1. 439 元3.結(jié)論
3. 1艾維因肉仔雞日糧中添加1%。肉禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑可使體增重提高 10. 24%、料重比降低7. 50%、發(fā)病死亡率下降75. 65%。3. 2艾維因肉仔雞日糧中添加1%。肉禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑組與添加5mg/kg維 基尼亞霉素組在體增重、料重比、發(fā)病死亡率等指標(biāo)上均差異不顯著(P > 0. 05)。3. 3艾維因肉仔雞日糧中添加1%。肉禽專(zhuān)用型復(fù)合微生態(tài)制劑可使每只雞增收 1. 439元，艾維因肉仔雞日糧中添加1%。凝結(jié)芽孢桿菌可使每只雞增收1. 308元。
權(quán)利要求
一種復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于包含糞腸球菌CGMCC No.2386菌粉、地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉、釀酒酵母CGMCC No.2388菌粉，上述各成分的重量配比為1∶0.8～1.2∶1.5～2.5。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于進(jìn)一步包含載體，載體為石粉、葡 萄糖、硫酸鉀鋁、玉米芯粉中的任一種或兩種。
3.權(quán)利要求1 2任一項(xiàng)所述的復(fù)合微生態(tài)制劑在制備畜禽飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用，具體地說(shuō)是涉及包含多種益生菌的復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用。該制劑包含地衣芽孢桿菌CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、糞腸球菌CGMCC No.2386菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、釀酒酵母CGMCC No.2388菌粉中的任三種或四種，制劑活菌含量高，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫及耐受常用抗生素等抗逆性能和產(chǎn)酸、產(chǎn)酶及抑制病原菌等益生功能。該制劑可根據(jù)畜禽及其所處生長(zhǎng)階段不同確定包含的益生菌種類(lèi)、載體種類(lèi)及其比例。本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑能提高飼料利用效率，增加肉蛋奶等產(chǎn)量，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，從而改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)。
文檔編號(hào)A23K1/00GK101904411SQ201010232600
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者劉宇, 姚琨, 孫占敏, 張玳華, 白玉卿, 莫云, 賈秋英, 趙軍, 趙雁青 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司