專利名稱：一種以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種萱草的組織培養(yǎng)兩步成苗的簡易快繁方法，特別是涉及到以 幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
萱草(HemerocalIis. sp)是百合科多年生的草本植物，該植物“觀為花，食為菜， 用為藥”，具有用途廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、栽培容易、管理簡單、收益快、效益高、經(jīng)濟(jì)壽命長等特 點(diǎn)。所有這些，對于美化環(huán)境，增進(jìn)人民體質(zhì)，開發(fā)山區(qū)經(jīng)濟(jì)，增加出口等均具有重要意義， 市場對其需求不斷增加。在自然界，該屬植物可采用播種、分株等方式進(jìn)行繁殖，由于該植 物雜種性強(qiáng)，種子繁殖難以保持優(yōu)良性狀，而且部分品種結(jié)實(shí)率低或種子萌芽率低，因此生 產(chǎn)中很少采用有性繁殖的方式。分株繁殖較為常用，且植株容易存活，但因其萌蘗能力不 強(qiáng)、增殖速度慢，一般1株萱草每年僅可繁殖1 5株，因而難以適應(yīng)市場商品化生產(chǎn)的需 求。植物組織培養(yǎng)作為上世紀(jì)發(fā)展起來的一門新技術(shù)，已一躍成為一種大規(guī)模批量工 廠化生產(chǎn)種苗的新方法，并在花卉生產(chǎn)上得到越來越廣泛的應(yīng)用。采用該技術(shù)繁殖萱草， 可大幅提高種苗的質(zhì)量和產(chǎn)量，是解決優(yōu)良品種大量繁殖的最有效途徑，不僅可以克服常 規(guī)繁殖方法的不足，提高繁殖系數(shù)，加快其繁殖速度，還可打破季節(jié)局限，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗， 滿足市場的需求。目前，萱草的組培育苗主要通過“愈傷組織的誘導(dǎo)、產(chǎn)生不定芽一芽的增 殖一組培苗生根”三個階段來完成，并根據(jù)不同階段配制相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶，步驟較為繁 瑣，生產(chǎn)成本較高。因此，如何簡化培養(yǎng)步驟，降低生產(chǎn)成本成為促進(jìn)萱草組培苗生產(chǎn)的當(dāng) 務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有組織培養(yǎng)技術(shù)中存在的問題，提供一種以幼嫩花梗為外 植體的、用“叢生芽的誘導(dǎo)一組培苗生根”兩步法實(shí)現(xiàn)萱草的組織培養(yǎng)快繁方法，該方法可 以大量快速地繁殖出品質(zhì)優(yōu)良的萱草組培苗。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案是先將作為外植體的萱草幼嫩花梗進(jìn) 行消毒處理，然后將其切割成1 1. 5cm后接種到誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上；2. 5 3個月后選 擇苗高4 6cm、4片葉子以上的無菌苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；當(dāng)組培苗每株 生根3條以上、不定根長達(dá)2 4cm時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3 4天后，將組培苗從培養(yǎng) 瓶中取出，洗去培養(yǎng)基，將其移栽至滅菌的栽培基質(zhì)中；上述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-芐氨基嘌呤 (6-BA)2 10mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0 2mg、α-萘乙酸(NAA)O. 2 lmg、瓊脂 4. 5g和蔗糖30g, pH值調(diào)節(jié)至5. 8 ；上述生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 0. 1 2. Omg、瓊脂4. 5g和蔗糖15 30g, pH值調(diào)節(jié)至5. 8 ；上述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度在 愈傷組織階段為ΙΟΟΟΙχ，待誘導(dǎo)出后幼苗為20001x ；上述生根培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度為 22001x。上述解決方案中可采用的外植體消毒處理的滅菌劑有70 75%乙醇、次氯酸鈉 溶液、氯化汞溶液等，本發(fā)明優(yōu)選的方法是先用加入少量洗衣粉的水浸泡5分鐘后，用流水 沖洗2 3小時；在無菌條件下(在水平超凈工作臺上)，將花梗在75%的酒精中浸泡10 秒后，在0. 的升汞溶液中浸泡15分鐘，用無菌水仔細(xì)沖洗8次。上述解決方案中的最佳誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-BA 4mg、2，4-D Img, NAA 0. 5mg。采用這種激素配比的培養(yǎng)基配方，經(jīng)過2. 5 3個月的培養(yǎng)， 不定芽的增殖率最高，可以達(dá)到5. 2，而且芽生長迅速、健壯；上述解決方案中的最佳生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 1. Omg、瓊脂4. 5g和蔗糖15g。采用這種配比的培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)時，生根率較高，且根系 粗壯；上述解決方案中將組培苗移栽至滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中(等比例的壤土、粗沙和蛭石 混勻)，并適當(dāng)遮光，并保持溫度在18 22°C，相對濕度為80 85%，保持一周左右后逐 漸去掉遮陰設(shè)施、降低空氣濕度，待幼苗適應(yīng)環(huán)境后即可進(jìn)入大田管理，植株成活率可達(dá) 90%。本發(fā)明通過合理調(diào)節(jié)激素的種類配比和濃度，得到了健壯的萱草組培苗，經(jīng)過3 4 個月的培養(yǎng)，其增殖率達(dá)5. 2。移栽至大田后，生長良好，達(dá)到生產(chǎn)要求。因此，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是能在短時間內(nèi)大量繁殖出優(yōu)質(zhì)的萱草組培苗，從而滿 足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。另外實(shí)施本發(fā)明方法，減少了配制培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)瓶的步驟，因此簡單易 行、生產(chǎn)成本降低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明所述的以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方法，它是先 將作為外植體的萱草幼嫩花梗進(jìn)行消毒處理，然后將其切割成ι 1. 5cm后接種到誘導(dǎo)及 分化培養(yǎng)基上；2. 5 3個月后選擇苗高4 6cm、4片葉子以上的無菌苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng) 基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；當(dāng)組培苗每株生根3條以上、不定根長達(dá)2 4cm時，打開瓶蓋，在室內(nèi) 煉苗3 4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去培養(yǎng)基，將其移栽至滅菌的栽培基質(zhì)中；上述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-芐氨基嘌呤 (6-BA)2 10mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0 2mg、α-萘乙酸(NAA)O. 2 lmg、瓊脂 4. 5g和蔗糖30g, pH值調(diào)節(jié)至5. 8 ；上述生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 0. 1 2. Omg、瓊脂 4. 5g和蔗糖15 30g, pH值調(diào)節(jié)至5. 8 ；上述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度在 愈傷組織階段為ΙΟΟΟΙχ，待誘導(dǎo)出后幼苗為20001x ；上述生根培養(yǎng)條件為溫度25士 1°C，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度為22001x。上述解決方案中可采用的外植體消毒處理的滅菌劑有70 75%乙醇、次氯酸鈉 溶液、氯化汞溶液等，本發(fā)明優(yōu)選的方法是先用加入少量洗衣粉的水浸泡5分鐘后，用流水 沖洗2 3小時；在無菌條件下(在水平超凈工作臺上)，將花梗在75%的酒精中浸泡10 秒后，在0. 的升汞溶液中浸泡15分鐘，用無菌水仔細(xì)沖洗8次。上述解決方案中的最佳誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-BA 4mg、2，4-D Img, NAA 0. 5mg。采用這種激素配比的培養(yǎng)基配方，經(jīng)過2. 5 3個月的培養(yǎng)， 不定芽的增殖率最高，可以達(dá)到5. 2，而且芽生長迅速、健壯；上述解決方案中的最佳生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 1. Omg、瓊脂4. 5g和蔗糖15g。采用這種配比的培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)時，生根率較高，且根系 粗壯；上述解決方案中將組培苗移栽至滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中(等比例的壤土、粗沙和蛭石 混勻)，并適當(dāng)遮光，并保持溫度在18 22°C，相對濕度為80 85%，保持一周左右后逐 漸去掉遮陰設(shè)施、降低空氣濕度，待幼苗適應(yīng)環(huán)境后即可進(jìn)入大田管理，植株成活率可達(dá) 90%。實(shí)施例1，(一)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備，(1)配制①誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-BA 4mg、2，4_D Img、NAA 0. 5mg、瓊脂4. 5g和蔗糖30g, pH值調(diào)節(jié)至5. 8 ；②生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 1. Omg、瓊脂4. 5g和蔗糖 15g，pH值調(diào)節(jié)至5.8 ；(2)分裝將配制后的培養(yǎng)基加熱至透明，趁熱分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中，每瓶約 70ml ；(3)滅菌培養(yǎng)基分裝后盡快將培養(yǎng)瓶口密封，并及時放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行消 毒滅菌。滅菌條件為121°C、0. IMPa下滅菌20分鐘。滅好的培養(yǎng)基從高壓鍋中取出后，放 在平整的臺面上，讓其自然冷卻凝固。( 二 )外植體的滅菌選擇生長健壯、無病蟲害的幼嫩萱草花梗為外植體材料，用 加入少量洗衣粉的水浸泡5分鐘后，用流水沖洗2 3小時；在無菌條件下(在水平超凈工 作臺上)，將花梗在75%的酒精中浸泡10秒后，用0. 的升汞溶液中浸泡15分鐘，用無菌 水仔細(xì)沖洗8次后備用。(三)接種將滅菌后的花梗在無菌條件下切成1 1.5cm左右的小段，接種于誘 導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上，每瓶接種1 2個材料。(四)培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室進(jìn)行幼苗的誘導(dǎo)，條件為溫度 25士 1°C，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度在愈傷組織階段為ΙΟΟΟΙχ，待誘導(dǎo)出幼苗后為 20001x。接種后15天，統(tǒng)計污染率為12.8%，誘導(dǎo)率為81%。培養(yǎng)2. 5 3個月后，增殖 率可以達(dá)到5. 2。(五)生根選擇苗高4 6cm、4片葉子以上的組培苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 溫度25士 1°C，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度為22001x，培養(yǎng)0. 5 1個月后，生根率達(dá)到89%，平均每株生根3. 2條，根系生長粗壯。(六)移栽待組培苗每株生根3條以上、不定根長達(dá)2 4cm時，進(jìn)入煉苗階段。 可在培養(yǎng)室中逐步打開培養(yǎng)瓶蓋，并增強(qiáng)光照，此過程需要3 4天。待組培苗適應(yīng)外界較 低的空氣濕度條件后，洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，移至滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中(等比例的壤土、 粗沙和蛭石混勻)，并適當(dāng)遮光，保持溫度在18 22°C，相對濕度為80 85%，保持一周左 右后逐漸去掉遮陰設(shè)施、降低空氣濕度，待幼苗適應(yīng)環(huán)境后即可進(jìn)入大田管理。植株成活率 可達(dá)90%。實(shí)施例2，外植體滅菌時將花梗在75%的酒精中浸泡10秒后，在0. 的升汞溶液中浸泡10 分鐘，其它步驟同實(shí)施例1。采用該滅菌方法，15天后外植體的污染率為33%，高于實(shí)施例 1。實(shí)施例3，外植體滅菌時將花梗在75%的酒精中浸泡10秒后，在0. 的升汞溶液中浸泡20 分鐘，其它步驟同實(shí)施例1。采用該滅菌方法，15天后外植體的污染率為2. 4%，低于實(shí)施例 1。但誘導(dǎo)率為25%，且后期增殖率為1. 3，均低于實(shí)施例1，且組培苗生長瘦弱，生根困難。實(shí)施例4，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-BA 2mg、2，4_D Img、NAA 0. 5mg，其它步驟同實(shí)施例1 ；誘導(dǎo)率為53%，培養(yǎng)2. 5 3個月后，增殖率可以達(dá)到3. 4。實(shí)施例5，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-BA 4mg、NAA 0. 5mg,其它步 驟同實(shí)施例1 ；誘導(dǎo)率為48%，培養(yǎng)2. 5 3個月后，增殖率可以達(dá)到2. 7。實(shí)施例6，誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-BA 4mg、2，4_D Img、NAA lmg，其它步驟同實(shí)施例1 ；誘導(dǎo)率為79%，培養(yǎng)2. 5 3個月后，增殖率可以達(dá)到5. 1。誘 導(dǎo)率和增殖率與實(shí)施例1差別不大，且組培苗生長健壯，但成本略高于實(shí)施例1。實(shí)施例7，生根培養(yǎng)基以V2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 1. Omg、蔗糖30g，其它步驟同 實(shí)施例1。采用該配方誘導(dǎo)組培苗生根，0. 5 1個月后，生根率達(dá)83%，每株平均生根2. 8 條，根系生長較粗壯。實(shí)施例8，生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 2. Omg、蔗糖30g，其它步驟同 實(shí)施例1。采用該配方誘導(dǎo)組培苗生根，0. 5 1個月后，生根率達(dá)88%，每株平均生根3. 9 條，根系生長較細(xì)弱，移栽后成活率低。實(shí)施例9生根培養(yǎng)基以V2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 2. Omg、蔗糖15g，其它步驟同 實(shí)施例1。采用該配方誘導(dǎo)組培苗生根，0. 5 1個月后，生根率達(dá)75%，每株平均生根2. 2 條，根系生長情況一般。
權(quán)利要求
一種以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方法，其特征在于該方法是先將作為外植體的萱草幼嫩花梗進(jìn)行消毒處理，然后將其切割成1～1.5cm后接種到誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上；2.5～3個月后選擇苗高4～6cm、4片葉子以上的無菌苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；當(dāng)組培苗每株生根3條以上、不定根長達(dá)2～4cm時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3～4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去培養(yǎng)基，將其移栽至滅菌的栽培基質(zhì)中；上述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6 芐氨基嘌呤(6 BA)2～10mg、2，4 二氯苯氧乙酸(2，4 D)0～2mg、α 萘乙酸(NAA)0.2～1mg、瓊脂4.5g和蔗糖30g，pH值調(diào)節(jié)至5.8；上述生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 0.1～2.0mg、瓊脂4.5g和蔗糖15～30g，pH值調(diào)節(jié)至5.8；上述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度在愈傷組織階段為1000lx，待誘導(dǎo)出后幼苗為2000lx；上述生根培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度為2200lx。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方法， 其特征在于該方法采用的外植體消毒處理是先用加入少量洗衣粉的水浸泡5分鐘后，用 流水沖洗2 3小時；在無菌條件下，將花梗在75%的酒精中浸泡10秒后，用0. 的升汞 溶液浸泡15分鐘，無菌水仔細(xì)沖洗8次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方 法，其特征在于所述的誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-BA 4mg、2， 4-Dlmg、NAA 0. 5mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方法， 其特征在于所述的生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 1. Omg、瓊脂4. 5g和 蔗糖15g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方 法，其特征在于所述的生根后的組培苗移栽至滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中，并適當(dāng)遮光，保持溫度在 18 22°C，相對濕度為80 85%，保持一周左右后逐漸去掉遮陰設(shè)施、降低空氣濕度，待幼 苗適應(yīng)環(huán)境后即可進(jìn)入大田管理，植株成活率可達(dá)90 %。
全文摘要
一種以幼嫩花梗為外植體的萱草組織培養(yǎng)兩步成苗的快繁方法，該方法該方法是先將作為外植體的萱草幼嫩花梗進(jìn)行消毒處理，然后將其切割成1～1.5cm后接種到誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上；2.5～3個月后選擇苗高4～6cm、4片葉子以上的無菌苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；當(dāng)組培苗每株生根3條以上、不定根長達(dá)2～4cm時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3～4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去培養(yǎng)基，將其移栽至滅菌的栽培基質(zhì)中；上述誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)2～10mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0～2mg、α-萘乙酸(NAA)0.2～1mg、瓊脂4.5g和蔗糖30g，pH值調(diào)節(jié)至5.8；上述生根培養(yǎng)基為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每升添加NAA 0.1～2.0mg、瓊脂4.5g和蔗糖15～30g，pH值調(diào)節(jié)至5.8；它能在短時間內(nèi)大量繁殖出優(yōu)質(zhì)的萱草組培苗，從而滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求，并減少了配制培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)瓶的步驟，因此簡單易行、生產(chǎn)成本降低。
文檔編號A01H4/00GK101897297SQ201010231860
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者周海夢, 周盛梅, 孟凡國, 許衡 申請人:浙江清華長三角研究院生物技術(shù)與醫(yī)藥研究所