專利名稱：大豆轉(zhuǎn)基因植株原位叢生芽再生培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆轉(zhuǎn)基因植株再生培養(yǎng)方法，特別是一種大豆轉(zhuǎn)基因植株原位叢生芽再生培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物基因轉(zhuǎn)化的成功，取決于是否具有良好的受體系統(tǒng)，即是否具有較強(qiáng)的植物再生能力和高頻的轉(zhuǎn)化率，經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，趙恢武等在《走向21世紀(jì)的植物分子生物學(xué)》446～447頁，撰文“植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究進(jìn)展”，該文提出在植物轉(zhuǎn)化中要建立的組織培養(yǎng)體系要提供大量的外源基因可被導(dǎo)入的再生感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)選擇轉(zhuǎn)化材料來源容易，組培時(shí)間短的組織培養(yǎng)體系。用基因槍這種轉(zhuǎn)化方法效率太低，只有0.3％左右。書中第5頁還提到有人選用子葉，子葉節(jié)等作為外植體，大豆轉(zhuǎn)基因植株獲得成功。但由于缺乏一個(gè)高效的再生植株體系，大豆的基因改良仍受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容
和
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有大豆植株再生能力低和低頻的轉(zhuǎn)化率，提供一種大豆轉(zhuǎn)基因植株原位叢生芽再生培養(yǎng)方法，使其解決在生物技術(shù)中大豆再生苗和轉(zhuǎn)化苗少的難點(diǎn)，達(dá)到芽點(diǎn)多，再生苗率強(qiáng)，通過一定選擇壓力和特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成高頻的轉(zhuǎn)化植株的效果。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分生組織的方式，去除萌發(fā)的大豆無菌苗的頂尖生長(zhǎng)點(diǎn)，保留二片子葉，并造成頂端部份表皮破傷，進(jìn)行農(nóng)桿菌感染和共培養(yǎng)，除菌后，用一定量的硫酸卡那霉素加入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，促使其產(chǎn)生叢生的不定芽，芽生長(zhǎng)快，且封頂芽少，植株生長(zhǎng)健壯，各種間再生差異小，培養(yǎng)時(shí)間縮短，轉(zhuǎn)化率提高，并消除種子基因型間差異達(dá)到廣譜性。得到較多的再生苗和轉(zhuǎn)化的大豆植株。
以下對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步的描述，方法步驟如下(1)種子經(jīng)過消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上萌發(fā)3-5天，除去頂芽并制造傷口保留二片子葉，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.3mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天。
(2)使用帶有B.t.(蘇云金芽孢桿菌基因)、gna(雪花蓮凝集素基因)或pta(半夏凝集素基因)基因農(nóng)桿菌感染外植體10分鐘，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3~4天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+cb500mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基除菌2~3周。
(3)除菌后的外植體放在MSB+KM80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)按一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽，伸長(zhǎng)到1～2cm時(shí)切除子葉，并伸長(zhǎng)到3～4cm。
(4)切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50~80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
本發(fā)明具有突質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，與選用子葉、子葉節(jié)等外植體培養(yǎng)大豆轉(zhuǎn)基因再生植株相比，本發(fā)明能產(chǎn)生叢生的不定芽、芽生長(zhǎng)快且封頂芽少，這些再生不定芽能更易伸長(zhǎng)，植株具有較高的轉(zhuǎn)化率，培養(yǎng)時(shí)間80～110天，縮短20～30天，與基因槍相比，轉(zhuǎn)化率更是大幅度提高，并能消除大豆種子基因型間的差異，達(dá)到廣譜性。此方法可用于大豆轉(zhuǎn)各種基因，能快速得到較高頻率的大豆轉(zhuǎn)化植株。
結(jié)合本發(fā)明的內(nèi)容提供以下三個(gè)實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)品種為合豐35，各50粒；種子經(jīng)過消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上萌發(fā)3天，除去頂芽并制造傷口保留二片子葉，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.3mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天；感染具有B.t.基因農(nóng)桿菌10分鐘(OD600nm0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基除菌2周；除菌后的外植體放在MSB+KM80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)按一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽。伸長(zhǎng)到1cm時(shí)切除子葉，并伸長(zhǎng)到3cm；切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50~80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。獲得轉(zhuǎn)B.t.基因的大豆植株合豐35號(hào)35株。與子葉節(jié)再生的方法相比較，再生率提高了50％。
實(shí)施例2
試驗(yàn)品種為合豐35號(hào)50粒；種子經(jīng)過消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上萌發(fā)4天，除去頂芽并制造傷口保留二片子葉，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.3mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天；感染具有g(shù)na基因農(nóng)桿菌10分鐘(OD600nm0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基除菌3周；除菌后的外植體放在MSB+KM80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)按一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽。伸長(zhǎng)到2cm時(shí)切除子葉，并伸長(zhǎng)到4cm；切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50~80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根20天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。獲得轉(zhuǎn)gna基因的大豆植株合豐35號(hào)37株。與子葉節(jié)再生的方法相比較，再生率提高了55％。
實(shí)施例3試驗(yàn)品種為合豐35號(hào)50粒；種子經(jīng)過消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上萌發(fā)5天，除去頂芽并制造傷口保留二片子葉，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.3mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天；感染具有pta基因農(nóng)桿菌10分鐘(OD600nm0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基除菌2.5周；除菌后的外植體放在MSB+KM80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)按一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽。伸長(zhǎng)到2cm時(shí)切除子葉，并伸長(zhǎng)到4cm；切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50~80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根18天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。獲得轉(zhuǎn)pta基因的大豆植株合豐35號(hào)30株。與子葉節(jié)再生的方法相比較，再生率提高了60％。
權(quán)利要求
1.一種大豆轉(zhuǎn)基因植株原位叢生芽再生培養(yǎng)方法，其特性在于采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分生組織的方式，去除萌發(fā)的大豆無菌苗的頂尖生長(zhǎng)點(diǎn)，保留二片子葉，并造成頂端部份表皮破傷，進(jìn)行農(nóng)桿菌感染和共培養(yǎng)，除菌后，用硫酸卡那霉素加入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到較多的再生苗和轉(zhuǎn)化的大豆植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種大豆轉(zhuǎn)基因植株原位叢生芽再生培養(yǎng)方法，其特征是方法步驟如下(1)種子經(jīng)過消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上萌發(fā)3~5天，除去頂芽并制造傷口保留二片子葉，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.3mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天；(2)使用帶有蘇云金芽孢桿菌基因、雪花蓮凝集素基因或半夏凝集素基因基因農(nóng)桿菌感染外植體10分鐘，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3~4天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基除菌2~3周；(3)除菌后的外植體放在MSB+KM80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)按一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽，伸長(zhǎng)到1～2cm時(shí)切除子葉，并伸長(zhǎng)到3～4cm；(4)切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50~80mg/L，PH5.8，培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
全文摘要
一種大豆轉(zhuǎn)基因植株原位叢生芽再生培養(yǎng)方法屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分生組織的方式，去除萌發(fā)的大豆無菌苗的頂尖生長(zhǎng)點(diǎn)，保留二片子葉，進(jìn)行農(nóng)桿菌感染和共培養(yǎng)，除菌后，用硫酸卡那霉素加入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到較多的再生苗和轉(zhuǎn)化的大豆植株。本發(fā)明利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分化生組織區(qū)的方式，在不同生長(zhǎng)期采用不同培養(yǎng)基，促使其產(chǎn)生叢生的不定芽，芽生長(zhǎng)快，且封頂芽少，植株生長(zhǎng)健壯，各種間再生差異小，培養(yǎng)時(shí)間縮短，轉(zhuǎn)化率提高，并消除種子基因型間差異達(dá)到廣譜性。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1411706SQ0215078
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2002年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月28日
發(fā)明者馬曉紅, 武天龍, 邱承祥 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)