一種黃連木植株性別鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃連木植株性別鑒定方法，步驟包括：利用黃連木植株分生組織進(jìn)行染色體制片并染色標(biāo)記，獲得黃連木植株的核型，通過觀察雌雄植株核型的差異，實現(xiàn)性別鑒定，解決了黃連木開花結(jié)果前沒有穩(wěn)定有效的性別鑒定方法的問題。本發(fā)明的重要應(yīng)用前景是通過對黃連木不同性別植株的鑒定，特別是苗期雌雄鑒定，實現(xiàn)黃連木植株性別比例的調(diào)節(jié)，對培育性別比例合理的高產(chǎn)黃連木能源林、大幅提高黃連木的單位面積產(chǎn)量具有重要意義。
【專利說明】一種黃連木植株性別鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是指一種黃連木植株的性別鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃連木(Pistacia chinensis Bunge)是一種重要的多年生木本油料植物,分布范圍廣，可在荒山荒地等邊際性土地上種植，適宜大面積造林，而且種子含油率高達(dá)40%以上。黃連木種子油脂是生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，被認(rèn)為是未來生態(tài)能源林建設(shè)和生物質(zhì)柴油產(chǎn)業(yè)優(yōu)先發(fā)展樹種，因此提高黃連木產(chǎn)量對解決我國生物能源原料供應(yīng)不足以及成本高等問題具有重要的意義。由于黃連木發(fā)展前景看好，目前針對黃連木的研究越來越多，但基本集中在資源調(diào)查、育苗、病蟲害防治、栽培技術(shù)等宏觀方面的研究，有關(guān)遺傳基礎(chǔ)、豐產(chǎn)技術(shù)等方面的研究較少。
[0003]黃連木為雌雄異株植物，天然次生林中的雌雄株的比例大約為1:1，而10%左右的雄株即可以保證充足的花粉供應(yīng)，因而天然次生林中雄株過剩，能結(jié)果的雌株比例低，同時黃連木童期長，8?12年才能開花結(jié)果，而在開花結(jié)果前沒有有效的雌雄株的鑒定方法，導(dǎo)致黃連木單位面積產(chǎn)量低。因而研究黃連木穩(wěn)定實用的性別鑒定技術(shù)，特別是苗期雌雄鑒定技術(shù)，對于培育性別比例合理的高產(chǎn)黃連木能源林、大幅提高黃連木的單位面積產(chǎn)量具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種黃連木植株性別鑒定的技術(shù)。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]一種黃連木植株性別鑒定方法，包括以下步驟:
[0007]( I)取黃連木植株分生組織進(jìn)行染色體制片；
[0008](2)對上述制片進(jìn)行染色標(biāo)記處理，鏡檢并采集圖像；
[0009](3)依據(jù)染色體特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對上述采集圖像中的染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建核型；
[0010](4)觀察雌雄植株染色體核型差異，實現(xiàn)性別鑒定，其中，由15對形狀特征一致的染色體組成的染色體核型為雌株核型，由14對形狀特征一致的常染色體和I對形狀特征有差異的異型同源染色體組成的染色體核型為雄株核型。
[0011]所述步驟(I)的染色體制片，包括以下步驟:
[0012]I)、取黃連木植株分生組織在卡諾氏固定液中固定I?3天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為50?80%的酒精中保存?zhèn)溆?，卡諾氏固定液為體積比為3:1的無水乙醇與冰醋酸的混合液；
[0013]2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一滴體積分?jǐn)?shù)為30?60%的醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片；
[0014]3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
[0015]所述步驟(I)的分生組織選自根尖、芽尖和花序分生組織中的一種。
[0016]所述步驟(2)的染色標(biāo)記處理為吉姆薩(Giemsa)染色，包括以下步驟:
[0017]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后，用100%酒精浸泡過夜，再用0.1?0.3M的HCl在40?70°C水浴中浸泡2?5分鐘；
[0018]b、放在裝有蒸餾水的染色缸中，流水中沖洗3?5次；
[0019]C、將制片轉(zhuǎn)移至裝有Ba (OH)2飽和液的染色缸中，30?40°C溫箱中溫浴3?20分鐘，自來水沖洗I?5次；
[0020]d、再轉(zhuǎn)移至2 X SSC緩沖液的染色缸中浸泡10?60min，自來水沖洗I?5次；
[0021]e、用吉姆薩染色液染色30?60min,加蓋玻片,鏡檢并采集圖像。
[0022]所述步驟(2)的染色標(biāo)記處理為DAPI (4,6- 二脒基_2_苯基吲哚)染色，包括以下步驟:
[0023]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后用體積分?jǐn)?shù)為30?60%的醋酸溶液沖洗制片；
[0024]b、依次轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為70%、95%、100%的酒精中梯度脫水，各I?lOmin，晾干；
[0025]C、力口 300 ?500ul 的 100ug/ml 的 DAPI 染色液，染色 2 ?5min ；
[0026]d、DAPI緩沖液沖洗，晾干，加蓋玻片，熒光顯微鏡下鏡檢并采集圖像，其中，所述DAPI緩沖液為體積比為8:5的0.lmol/L檸檬酸溶液與0.lmol/L磷酸氫二鈉溶液的混合液。
[0027]所述步驟(3)的染色體特征包括染色體的長度、著絲點位置、臂比和有無隨體。
[0028]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種黃連木植株性別鑒定方法，所述方法是利用雌雄植株核型差異進(jìn)行性別鑒定，由于材料選自分生組織，因此在植株生長各個時期均可實現(xiàn)鑒定，解決了黃連木開花結(jié)果前沒有穩(wěn)定有效的性別鑒定問題。通過對黃連木植株性別的鑒定，可以按需要繁育和種植黃連木不同性別的植株，因而在品種等其他因素不變的情況下，使得黃連木能源林單位面積產(chǎn)量大幅提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是雄株根尖細(xì)胞染色體吉姆薩染色核型圖；
[0030]圖2是雄株根尖細(xì)胞染色體DAPI染色核型圖；
[0031]圖3是雌株根尖細(xì)胞染色體吉姆薩染色核型圖；
[0032]圖4是雌株根尖細(xì)胞染色體DAPI染色核型圖。
【具體實施方式】
[0033]下面根據(jù)實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明技術(shù)構(gòu)思以及內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0034]實施例1
[0035]1、染色體制片:
[0036]I)、將根尖組織在卡諾氏固定液中固定2天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為75%酒精中保存?zhèn)溆?
[0037]2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一小滴體積分?jǐn)?shù)為50%醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片；
[0038]3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
[0039]2、吉姆薩染色:
[0040]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片，用100%酒精浸泡過夜后用0.2M的HCl在60°C水浴中浸泡3分鐘；
[0041]b、放在裝有蒸餾水的染色缸中，流水中沖洗4次；
[0042]C、將制片轉(zhuǎn)移至裝有Ba(OH)2飽和液的染色缸中，37°C溫箱中溫浴10分鐘，自來水沖洗4次；
[0043]d、再轉(zhuǎn)移至裝有2XSSC緩沖液(購于上海生工生物工程公司)的染色缸中浸泡20min，自來水沖洗3次；
[0044]e、吉姆薩染色液(購于上?？婆d生物科技有限公司)中染色40min，加蓋玻片，鏡檢并采集圖像。
[0045]3、核型分析:
[0046]如圖1和3所示，依據(jù)染色體長度、著絲點位置、臂比和有無隨體等特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建核型。其中圖1包含14對同型同源染色體和I對異型性染色體(位于右下角的I對染色體)，為雄株核型圖；圖3包含15對同源染色體，為雌株核型圖。
[0047]實施例2
[0048]1、染色體制片:
[0049]I)、將根尖組織在卡諾氏固定液中固定I天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為50%酒精中保存?zhèn)溆?
[0050]2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一小滴體積分?jǐn)?shù)為30%醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片；
[0051]3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
[0052]2、吉姆薩染色:
[0053]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后，在100%酒精浸泡過夜后用0.1M的HCl在40°C水浴中浸泡2分鐘；
[0054]b、放在裝有蒸餾水的染色缸中，流水中沖洗3次；
[0055]C、將制片轉(zhuǎn)移至裝有Ba(OH)2飽和液的染色缸中，30°C溫箱中溫浴3分鐘，自來水沖洗I次；
[0056]d、再轉(zhuǎn)移至裝有2 X SSC緩沖液的染色缸中浸泡lOmin，自來水沖洗I次；
[0057]e、吉姆薩染色液中染色30min,加蓋玻片,鏡檢并采集圖像。
[0058]3、核型分析:
[0059]依據(jù)染色體長度、著絲點位置、臂比和有無隨體等特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建核型；其中，由15對形狀特征一致的染色體組成的核型為雌株核型，由14對形狀特征一致的常染色體和I對形狀特征有差異的異型同源染色體組成的核型為雄株核型。
[0060]實施例3
[0061]1、染色體制片:
[0062]I)、將芽尖組織在卡諾氏固定液中固定3天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為80%酒精中保存?zhèn)溆?
[0063]2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一小滴體積分?jǐn)?shù)為60%醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片；
[0064]3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
[0065]2、吉姆薩染色:
[0066]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后，在100%酒精浸泡過夜后用0.3M的HCl在70°C水浴中浸泡5分鐘；
[0067]b、放在裝有蒸餾水的染色缸中，流水中沖洗5次；
[0068]C、將制片轉(zhuǎn)移至裝有Ba(OH)2飽和液的染色缸中，40°C溫箱中溫浴20分鐘，自來水沖洗5次；
[0069]d、再轉(zhuǎn)移至裝有2 X SSC緩沖液的染色缸中浸泡60min，自來水沖洗5次；
[0070]e、吉姆薩染色液中染色30min,加蓋玻片,鏡檢并采集圖像。
[0071]3、核型分析:
[0072]依據(jù)染色體長度、著絲點位置、臂比和有無隨體等特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建核型；其中，由15對形狀特征一致的染色體組成的核型為雌株核型，由14對形狀特征一致的常染色體和I對形狀特征有差異的異型同源染色體組成的核型為雄株核型。
[0073]實施例4
[0074]1、染色體制片:
[0075]I)、將根尖組織在卡諾氏固定液中固定2天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為75%酒精中保存?zhèn)溆?
[0076]2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一小滴體積分?jǐn)?shù)為50%醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片；
[0077]3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
[0078]2、DAPI 染色:
[0079]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后用體積分?jǐn)?shù)為40%的醋酸溶液沖洗制片;
[0080]b、依次轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為70%、95%、100%的酒精中梯度脫水，各6min，晾干；
[0081]C、加400ul的100ug/ml的DAPI染色液(購于北京泛博生物化學(xué)有限公司)，染色3min ；
[0082]d、DAPI緩沖液沖洗，晾干，加蓋玻片，熒光顯微鏡下鏡檢并采集圖像，其中，所述DAPI緩沖液為體積比為8:5的0.lmol/L檸檬酸溶液與0.lmol/L磷酸氫二鈉溶液的混合液。
[0083]3、核型分析:
[0084]如圖2和4所示，依據(jù)染色體長度、著絲點位置、隨體的有無以及臂比等特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建核型。其中圖2包含14對同型同源染色體和I對異型性染色體(位于右下角的I對染色體)，為雄株核型圖；圖4包含15對同源染色體，為雌株核型圖。
[0085]實施例5
[0086]1、染色體制片:
[0087]I)、將根尖組織在卡諾氏固定液中固定I天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為50%酒精中保存?zhèn)溆?
[0088]2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一小滴體積分?jǐn)?shù)為30%醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片；
[0089]3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
[0090]2、DAPI 染色:
[0091]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后用體積分?jǐn)?shù)為30%的醋酸溶液沖洗制片;
[0092]b、依次轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為70%、95%、100%的酒精中梯度脫水，各lmin，晾干；
[0093]C、加 300ul 的 100ug/ml 的 DAPI 染色液，染色 5min ；
[0094]d、DAPI緩沖液沖洗，晾干，加蓋玻片，熒光顯微鏡下鏡檢并采集圖像，其中，所述DAPI緩沖液為體積比為8:5的0.lmol/L檸檬酸溶液與0.lmol/L磷酸氫二鈉溶液的混合液。
[0095]3、核型分析:
[0096]依據(jù)染色體長度、著絲點位置、臂比和有無隨體等特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建核型；其中，由15對形狀特征一致的染色體組成的核型為雌株核型，由14對形狀特征一致的常染色體和I對形狀特征有差異的異型同源染色體組成的核型為雄株核型。
[0097]實施例6
[0098]1、染色體制片:
[0099]I)、將芽尖組織在卡諾氏固定液中固定3天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為80%酒精中保存?zhèn)溆?
[0100]2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一小滴體積分?jǐn)?shù)為60%醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片；
[0101]3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
[0102]2、DAPI 染色:
[0103]a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后用體積分?jǐn)?shù)為60%的醋酸溶液沖洗制片;
[0104]b、依次轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為70%、95%、100%的酒精中梯度脫水，各lOmin，晾干；[0105]c、加 500ul 的 100ug/ml 的 DAPI 染色液，染色 2min ；
[0106]d、DAPI緩沖液沖洗，晾干，加蓋玻片，熒光顯微鏡下鏡檢并采集圖像，其中，所述DAPI緩沖液為體積比為8:5的0.lmol/L檸檬酸溶液與0.lmol/L磷酸氫二鈉溶液的混合液。
[0107]3、核型分析:
[0108]依據(jù)染色體長度、著絲點位置、臂比和有無隨體等特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建核型；其中，由15對形狀特征一致的染色體組成的核型為雌株核型，由14對形狀特征一致的常染色體和I對形狀特征有差異的異型同源染色體組成的核型為雄株核型。
【權(quán)利要求】
1.一種黃連木植株性別鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取黃連木植株分生組織進(jìn)行染色體制片； (2)對上述制片進(jìn)行染色標(biāo)記處理，鏡檢并采集圖像； (3)依據(jù)染色體特征利用染色體圖像分析系統(tǒng)對上述采集圖像中的染色體進(jìn)行排序和編號，構(gòu)建獲得植株染色體核型； (4)觀察雌雄植株染色體核型差異，實現(xiàn)性別鑒定，其中，由15對形狀特征一致的染色體組成的染色體核型為雌株核型，由14對形狀特征一致的常染色體和I對形狀特征有差異的異型同源染色體組成的染色體核型為雄株核型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連木植株性別鑒定方法，其特征在于，所述步驟(I)的染色體制片，包括以下步驟: 1)、取黃連木植株分生組織在卡諾氏固定液中固定I?3天，然后移至體積分?jǐn)?shù)為50?80%的酒精中保存?zhèn)溆?，卡諾氏固定液為體積比為3:1的無水乙醇與冰醋酸的混合液； 2)、用鑷子取小塊組織，放在載玻片上，滴上一滴體積分?jǐn)?shù)為30?60%的醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕壓，使材料分散成一薄層，酒精燈火焰上烘烤，用拇指壓平蓋玻片； 3)、放置相差顯微鏡下觀察，選擇染色體清晰，數(shù)量完整，分散均勻，無斷裂重疊現(xiàn)象的制片于_80°C冰箱中儲存，冷凍12h以上備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連木植株性別鑒定方法，其特征在于，所述步驟(I)的分生組織選自根尖、芽尖和花序分生組織中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連木植株性別鑒定方法，其特征在于，所述步驟(2)的染色標(biāo)記處理為吉姆薩染色，包括以下步驟: a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后，用100%酒精浸泡過夜，再用0.1?0.3M的HCl在40?70°C水浴中浸泡2?5分鐘； b、放在裝有蒸餾水的染色缸中，流水中沖洗3?5次； C、將制片轉(zhuǎn)移至裝有Ba(OH)2飽和液的染色缸中，30?40°C溫箱中溫浴3?20分鐘，自來水沖洗I?5次； d、再轉(zhuǎn)移至2XSSC緩沖液的染色缸中浸泡10?60min，自來水沖洗I?5次； e、用吉姆薩染色液染色30?60min,加蓋玻片,鏡檢并采集圖像。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連木植株性別鑒定方法，其特征在于，所述步驟(2)的染色標(biāo)記處理為DAPI染色，包括以下步驟: a、將儲存的制片取出，迅速揭開蓋玻片后用體積分?jǐn)?shù)為30?60%的醋酸溶液沖洗制片; b、依次轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為70%、95%、100%的酒精中梯度脫水，各I?lOmin，晾干； C、力口 300?500ul的100ug/ml的DAPI染色液，染色2?5min ； d、DAPI緩沖液沖洗，晾干，加蓋玻片，熒光顯微鏡下鏡檢并采集圖像，其中，所述DAPI緩沖液為體積比為8:5的0.lmol/L檸檬酸溶液與0.lmol/L磷酸氫二鈉溶液的混合液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連木植株性別鑒定方法，其特征在于，所述步驟(3)的染色體特征包括染色體的長度、著絲點位置、臂比和有無隨體。
【文檔編號】G01N21/84GK103529037SQ201310467123
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】吳麗芳, 楊鳴雷 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院