專利名稱：棉花半配合育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉花的育種方法，具體是涉及轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的育種方法。
從國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的選育過(guò)程看，一般外源基因利有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法以及基因槍穿透等方法將抗蟲基因?qū)朊藁ㄖ?，由于基因的互作效?yīng)，棉花的特征、特性以及農(nóng)藝性狀都會(huì)產(chǎn)生分離和變異，需要通過(guò)系統(tǒng)選育或雜交、回交等技術(shù)加以穩(wěn)定，一般，從外源基因?qū)朊藁ǖ匠蔀榭剐院拓S產(chǎn)性均穩(wěn)定的商品化品種，需要7-8年時(shí)間，Harris預(yù)測(cè)，如果Bt毒素同時(shí)在棉花、玉米和高梁上開(kāi)展使用防治夜蛾科害蟲，那么可能在25-75代(3-9年)的時(shí)間內(nèi)，就會(huì)由于害蟲抗性的產(chǎn)生，而使這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)變成無(wú)用。因此，昆蟲產(chǎn)生抗性是對(duì)植物轉(zhuǎn)基因工程的一個(gè)挑戰(zhàn)。如何縮短轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的選育過(guò)程，加速轉(zhuǎn)基因棉花的穩(wěn)定，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的使用時(shí)間，是急待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的育種方法，該育種方法能夠快速穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，縮短轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的育種過(guò)程。
半配合生殖(Semigamy)是介于受精(fertilization)和無(wú)融合生殖(apomixis)之間的一種特殊的生殖類型，植物授粉后，雄配子核進(jìn)入卵細(xì)胞，但并不與卵細(xì)胞融合，而是彼此獨(dú)立分裂，最后形成鑲嵌有來(lái)源于父本和母本組織的異質(zhì)胚，這種生殖方式稱為半配合生殖。
自Turcotte和Feaster(1967年)發(fā)現(xiàn)棉花半配合材料后，三十多年來(lái)，關(guān)于半配合材料的研究只停留在了細(xì)胞遺傳和胚胎發(fā)育等基礎(chǔ)理論方面。由于半配合材料的自交后代或用它作親本雜交的后代均能產(chǎn)生一定比率(6％-20％)的單倍體，也引起了棉花遺傳育種專家的注意。單倍體在遺傳和育種上具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，例如單倍體經(jīng)染色體加倍后，可以得到兩套染色體完全一樣的純合系，由于染色體純合，后代便不會(huì)再產(chǎn)生分離。
利用單倍體的上述特性，如果在雜交育種中把雜種一代或二代已發(fā)生基因重組的單倍體配子或植株的染色數(shù)經(jīng)人工或自然加倍，就可以得到穩(wěn)定的純合二倍體，而不必再進(jìn)行多代連續(xù)選育得到穩(wěn)定系，大大縮短了育種進(jìn)程。
本發(fā)明選擇棉花半配合材料VSG作母本，與轉(zhuǎn)基困抗蟲棉低代材料作父本雜交，將F1中具有轉(zhuǎn)基因的單倍體進(jìn)行染色體加倍，培育出了純合二倍體的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
作為母本的棉花半配合材料VSG屬海島棉(G barbadense L)，株高80-100cm，生育期135-140天，葉片3-5列，缺刻較深，顏色發(fā)黃，主莖節(jié)間長(zhǎng)10-15cm，果枝節(jié)間長(zhǎng)15cm左右，植株松散，呈塔型，單鈴籽棉重3g左右，纖維長(zhǎng)度35-37mm，衣分28％-30％，籽指10g左右。由于受顯性基因Se的控制，其自交或雜交后代中會(huì)出現(xiàn)6％-20％的單倍體。本發(fā)明所采用的棉花半配合材料VSG由河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所引進(jìn)。
本發(fā)明首先選擇轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料95-1作父本與VSG雜交，由于受母本VSG所含的Se基因的控制，在F1中產(chǎn)生了10％左右的具有轉(zhuǎn)Bt基因的單倍體。
父本95-1屬陸地棉(G hirsutum L)，是由山西省農(nóng)科院棉花所利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源抗蟲基因Bt導(dǎo)入晉棉7號(hào)獲得的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉低代材料。由于外源基因的導(dǎo)入，產(chǎn)生基因互作效應(yīng)，植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中生理代謝失調(diào)，后代產(chǎn)生分離，抗蟲性及其他性狀均表現(xiàn)不穩(wěn)定。株高50-100cm，主莖節(jié)間長(zhǎng)5-10cm，果枝節(jié)間長(zhǎng)3-15cm，株型有塔型、筒型等，葉片大小不一，深綠色，5裂葉，生育期110-140天，單鈴籽棉重3-5g，纖維長(zhǎng)度25-32mm，衣分30-40％，籽指8-11g，抗蟲性株間差異較大，需經(jīng)多年連續(xù)選擇培育才可穩(wěn)定。
進(jìn)而我們選擇轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料95-1與轉(zhuǎn)CPTI基因抗蟲棉低代材料9701進(jìn)行成對(duì)雜交，產(chǎn)生出了具有Bt+CPTI轉(zhuǎn)基因的雜種一代，再用雜種一代作為父本，與半配合材料VSG進(jìn)行雜交，在F1中出現(xiàn)了具有Bt+CPTI雙價(jià)轉(zhuǎn)基因的單倍體。
CPTI基因?yàn)轸挂鹊鞍酌富?，是一種抑制蛋白酶基因，它可以破壞昆蟲的消化系統(tǒng)神經(jīng)，從而導(dǎo)致昆蟲食性下降而死亡。CPTI基因首先由中中農(nóng)科院生物技術(shù)研究所得到，山西省農(nóng)科院棉花所將其導(dǎo)入晉棉12號(hào)，得到了轉(zhuǎn)CPTI基因抗蟲棉低代材料9701。9701株高80-100cm，生長(zhǎng)期130-135天，株型呈筒形，葉片大，深綠色，5裂葉，主莖節(jié)間長(zhǎng)5-10cm，果枝節(jié)間長(zhǎng)10cm左右，單鈴籽棉重5g左右，纖維長(zhǎng)度29-30mm，衣分38％-40％，籽指10g左右。生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，抗枯黃萎病和棉鈴蟲。
在得到具有轉(zhuǎn)基因的單倍體后，需對(duì)其培育以進(jìn)行染色體加倍。在單倍體的培育過(guò)程中，由于單倍體一般都生長(zhǎng)緩慢、瘦弱，因此在生長(zhǎng)過(guò)程中要加強(qiáng)水肥管理，改善生長(zhǎng)發(fā)育條件。為了擴(kuò)大單倍體的群體和改善單倍體的營(yíng)養(yǎng)狀況，本發(fā)明采用了嫁接的方法，用兩個(gè)不同的棉花品種為親本進(jìn)行雜交，以雜交一代植侏作砧木，用單倍體的幼芽作接穗進(jìn)行嫁接。由于雜交一代具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，生理代謝也較旺盛，嫁接后的單倍體可以得到比原來(lái)單倍體母體植株上更為充足的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生長(zhǎng)健壯，有利于下一步的染色體加倍。
作為單倍體嫁接砧木雜交一代的兩個(gè)親本，可以選擇兩個(gè)非抗蟲棉品種，也可以選擇一個(gè)或兩個(gè)都是抗蟲棉品種，甚至可以將抗蟲棉的低代材料作為親本。例如本發(fā)明選擇非抗蟲棉品種晉棉21號(hào)與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉低代材料GR-2作為親本，雜交產(chǎn)生的雜交一代植株作為砧木嫁接單倍體幼芽。
染色體加倍的處理方法有兩種幼苗加倍和枝條加倍，幼苗加倍是在23-26℃的環(huán)境溫度下，將單倍體幼苗的頂尖浸入0.03-0.05％的秋水仙堿溶液中浸泡6小時(shí)。枝條加倍則是將單倍體幼嫩枝條的生長(zhǎng)點(diǎn)浸入由0.03-0.05％秋水仙堿和5％二甲基亞砜組成的混合溶液中浸泡12-24小時(shí)，浸泡時(shí)環(huán)境溫度應(yīng)保持在28-30℃。
單倍體經(jīng)染色體加倍后，成為純合二倍體。對(duì)純合二倍體進(jìn)行抗蟲性測(cè)定、品質(zhì)鑒定和產(chǎn)量比較試驗(yàn)后，即成為一個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的穩(wěn)定純合系。
本發(fā)明采用半配合育種方法選育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，只需2-3代就可以得到轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的穩(wěn)定系，而一般的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉由于基因的互作效應(yīng)，需要通過(guò)系統(tǒng)選育或雜交，回交等技術(shù)加以穩(wěn)定，需要連續(xù)選育5-7代才能得到穩(wěn)定系。因此，利用半配合育種方法大大縮短了育種進(jìn)程，提高了育種效率。
由于采用半配合育種方法得到的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉穩(wěn)定系的基因純合，不易產(chǎn)生變異和退化，穩(wěn)定性能比一般品種好，生產(chǎn)應(yīng)用的時(shí)間也較長(zhǎng)。
四、具體實(shí)施例以半配合材料VSG為母本，以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉低代材料為父本進(jìn)行雜交，得到單倍體植株337株。其中轉(zhuǎn)Bt基因單倍體239株，轉(zhuǎn)(Bt+CPTI)雙價(jià)基因單倍體98株。經(jīng)染色體加倍后，共計(jì)獲得轉(zhuǎn)Bt基因加倍單倍體49株，轉(zhuǎn)(Bt+CPTI)雙價(jià)基因加倍單倍體21株。
通過(guò)田間株行、株系品比鑒定，從生育期、株高、單鈴籽棉重、衣分、籽指、皮棉產(chǎn)量等方面進(jìn)行全面考察分析，并通過(guò)網(wǎng)室抗蟲性鑒定和經(jīng)農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心棉纖維品質(zhì)測(cè)定，從49個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因加倍單倍體株系中篩選出三個(gè)穩(wěn)定系DHR-1、DHR-2、DHR-3，從21個(gè)轉(zhuǎn)(Bt+CPTI)雙價(jià)加倍單倍體株系中篩選出兩個(gè)穩(wěn)定系DHR-4、DHR-5。其中DHR-2在進(jìn)一步通過(guò)區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)后，2002年2月已通過(guò)山西省品種審定委員<p>表2

上述品比試驗(yàn)中，對(duì)照95-1為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料，晉棉10號(hào)為非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。四個(gè)穩(wěn)定系中，DHR-1、DHR-3、DHR-4、抗蟲性與95-1相差不大，DHR-5的抗蟲性略高于95-1。
針對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉穩(wěn)定系DHR-2進(jìn)行品比試驗(yàn)，在接蟲網(wǎng)室隔離條件下，全生育期不治棉鈴蟲，二年平均皮棉產(chǎn)量58.8kg/畝，比對(duì)照晉棉21號(hào)(非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉)增產(chǎn)53.6％，在常規(guī)開(kāi)放栽培條件下，全生育期防治棉鈴蟲，二年平均皮棉產(chǎn)量61.3kg/畝，比對(duì)照晉棉21號(hào)增產(chǎn)8.3％。2000年在五個(gè)點(diǎn)參加生產(chǎn)試驗(yàn)，小區(qū)面積0.5畝，五個(gè)點(diǎn)均增產(chǎn)，平均皮棉產(chǎn)量76.5kg/畝，比對(duì)照晉棉21號(hào)增產(chǎn)12.8％，2001年擴(kuò)大到八個(gè)點(diǎn)參加生產(chǎn)試驗(yàn)，平均皮棉產(chǎn)量88.7kg/畝，八個(gè)點(diǎn)均表現(xiàn)增產(chǎn)，比對(duì)照晉棉21號(hào)增產(chǎn)29.2％。經(jīng)田間鑒定，DHR-2生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，生長(zhǎng)整齊而穩(wěn)健，單株結(jié)鈴多，棉鈴大而均勻，抗蟲性強(qiáng)。DHR-2株型緊湊，株高70-80cm，生育期119天，單鈴籽棉重5g左右，籽指10.2g，衣分38-40％，葉色深綠，中等大，生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，后期葉絮集中，霜前花率80％以上，纖維結(jié)白，經(jīng)農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)檢驗(yàn)測(cè)試中心測(cè)定，2.5％跨長(zhǎng)30.3mm，整齊度47.4％，比強(qiáng)度21.1CN/tex，伸長(zhǎng)率9.7％，與克隆值402，反射率79.4％，黃度8.6，環(huán)縷紗強(qiáng)129，氣紗品質(zhì)1895，達(dá)到國(guó)家95育種攻關(guān)指標(biāo)，附合紡織工業(yè)要求。
經(jīng)網(wǎng)室鑒定，DHR-2的2代棉鈴蟲百株幼蟲15頭，對(duì)照晉棉10號(hào)百株幼蟲63頭，比對(duì)照減少76.2％，DHR-2百株被害蕾41個(gè)，對(duì)照晉棉10號(hào)百株被害蕾267個(gè)，比對(duì)照減少84.6％，達(dá)到了高抗水平。2000年和200年在2代棉鈴蟲發(fā)生高峰期時(shí)，分別對(duì)13個(gè)點(diǎn)進(jìn)行生產(chǎn)調(diào)查，DHR-2 2代棉鈴蟲百株幼蟲兩年平均11.1頭，對(duì)照晉棉21號(hào)為40.2頭，DHR-2比對(duì)照減少71.3％，百株被害蕾DHR-2兩年平均為45.9個(gè)，對(duì)照晉棉21號(hào)為240個(gè)，DHR-2比對(duì)照減少72.4％，達(dá)到高抗水平。DHR-2于2002年2月通過(guò)山西省品種審定委員會(huì)審定，命名為晉棉34號(hào)。
權(quán)利要求
1.一種棉花半配合育種方法，其特征在于以棉花半配合材料VSG作母體，與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉低代材料父本雜交，再將子一代中具有轉(zhuǎn)基因的單倍體進(jìn)行染色體加倍，培育出純合二倍體的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花半配合育種方法，其特征在于以棉花半配合材料VSG作母體，以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料95-1作父本進(jìn)行雜交，得到轉(zhuǎn)Bt基因單倍體，染色體加倍后，培育出純合二倍體的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花半配合育種方法，其特征在于以棉花半配合材料VSG作母本，以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料95-1與轉(zhuǎn)CPTI基因抗蟲棉低代材料9701雜交的雜種一代作父本進(jìn)行雜交，得到轉(zhuǎn)(Bt+CPTI)基因單倍體，染色體加倍后，培育出純合二倍體的轉(zhuǎn)(Bt+CPTI)基因抗蟲棉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花半配合育種方法，其特征在于以兩個(gè)不同的棉花品種為親本進(jìn)行雜交，以雜交一代植株作砧木，將單倍體幼芽嫁接進(jìn)行單倍體的培育。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花半配合育種方法，其特征在于作為親本的兩個(gè)棉花品種中，有一個(gè)品種或兩個(gè)品種都是抗蟲棉品種或抗蟲棉低代材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花半配合育種方法，其特征在于將單倍體幼苗頂尖浸入0.03％-0.05％秋水仙堿溶液中6小時(shí)，進(jìn)行染色體加倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花半配合育種方法，其特征在于將單倍體幼嫩枝條的生長(zhǎng)點(diǎn)浸入0.03％-0.05％秋水仙堿與5％二甲基亞砜的混合溶液中12-24小時(shí)，進(jìn)行染色體加倍。
8.利用權(quán)利要求1或2育種方法得到的抗蟲棉品種，其特征在于將半配合材料VSG與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料95-1雜交，子一代單倍體經(jīng)染色體加倍后得到轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種晉棉34號(hào)。
9.利用權(quán)利要求1或2育種方法得到的抗蟲棉品種，其特征在于將半配合材料VSG與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料95-1雜交，子一代單倍體經(jīng)染色體加倍后得到轉(zhuǎn)基因抗蟲棉穩(wěn)定系DHR-1、DHR-3。
10.利用權(quán)利要求1或3育種方法得到的抗蟲棉品種，其特征在于將半配合材料VSG與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉低代材料95-1同轉(zhuǎn)CPTI基因抗蟲棉低代材料9701雜交的雜種一代進(jìn)行雜交，子一代單倍體經(jīng)染色體加掊后，得到轉(zhuǎn)基因抗蟲棉穩(wěn)定系DHR-4、DHR-5。
全文摘要
一種棉花半配合育種方法，利用半配合生殖特性，以棉花半配合材料VSG作母本，以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉低代材料作父本進(jìn)行雜交，在子一代中得到具有轉(zhuǎn)基因的單倍體，對(duì)單倍體進(jìn)行染色體加倍后，培育出純合二倍體的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。用本方法培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，只需2－3代即可得到穩(wěn)定純合系，大大縮短了育種過(guò)程。本方法已培育出不同轉(zhuǎn)基因的抗蟲棉穩(wěn)定系4個(gè)，以及一個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種晉棉34號(hào)。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1404721SQ0213112
公開(kāi)日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者牛永章, 郭寶德, 黃穗蘭, 張名昌, 張?jiān)? 冀麗霞 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳研究所