專利名稱：：一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子育種領(lǐng)域，涉及一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，具體涉及一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。
背景技術(shù)：
：棉花是世界性的重要經(jīng)濟(jì)作物。中國是棉花的生產(chǎn)大國，消費(fèi)大國和紡織大國。作為棉花生產(chǎn)大國，我國主產(chǎn)棉區(qū)覆蓋16個(gè)省、市(自治區(qū))，常年植棉面積7000-8000萬畝，總產(chǎn)約600萬噸，占世界總產(chǎn)的四分之一。然而在棉花的生長期內(nèi)受到各種不同病害的威脅，如被稱為棉花“癌癥”的黃萎病，它在全球都有分布且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(CaiYF,HeXH,MoJC,etal.MolecularresearchandgeneticengineeringofresistancetoVerticilliumwiltincotton:Areview[J].AfrJBiotech，2009，8:7363-7372.)。棉花黃萎病是黃萎病菌經(jīng)土壤傳播、侵染到棉花植株最終引發(fā)維管束疾病的一種真菌性病害，具有危害嚴(yán)重、分布范圍大、寄主種類多及存活時(shí)間長等特點(diǎn)，可造成棉花大量減產(chǎn)甚至絕收(YangC,GuoWZ,LiGY,etal.QTLsmappingforVerticilliumwiltresistanceatseedlingandmaturitystagesforinG.barbadenseL[J].PlantSci,2008,174290-298)ο黃萎病菌屬于真菌的半知菌亞門(Deutermycotina)淡色孢科(Monilaceae)輪枝菌屬(Verticillium)，屬內(nèi)有若干種；其中危害棉花的有黑白輪枝菌(VerticilliumalboatrumReinke&Berthier)和大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaKlebahn)，它們在形態(tài)、特征、寄主范圍以及生長特征方面都有所差異。應(yīng)用傳統(tǒng)育種方法和轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病品種是目前最有效和可行的控制棉花黃萎病危害的方法。陸地棉是4個(gè)栽培種中種植最廣泛的棉種，它的產(chǎn)量占到當(dāng)年棉花產(chǎn)量的95%，所以是遺傳研究和育種的主要對象，但是大部分的陸地棉品種均感或耐黃萎病(ChenZJ,SchefflerBE,Dennis,Eetal.Towardsequencingcotton(Gossypium)genomes[J],PlantPhysiol,2007,145:1303-1310.)。海島棉是另一個(gè)四倍體栽培種，它的纖維比陸地棉“長、強(qiáng)、細(xì)”，同時(shí)它高抗或抗黃萎病，因此海島棉是重要的棉優(yōu)質(zhì)纖維和抗黃萎病基因的重要來源。育種家們一直想通過海陸種間雜交的方式把海島棉中抗黃萎病的基因?qū)氲疥懙孛拗腥?，但是由于連鎖累贅和雜交后代不容易穩(wěn)定等原因限制了抗病品種的培育。分子標(biāo)記技術(shù)在提高棉花抗黃萎病育種中的應(yīng)用大大減少了育種過程中選擇的盲目性，快速實(shí)現(xiàn)外源優(yōu)良種質(zhì)向栽培品種滲透，拓寬了品種的遺傳基礎(chǔ)。國內(nèi)外研究人員對黃萎病抗性進(jìn)行了大量的QTL定位研究，有的已經(jīng)用于標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐。'^^W^^i^AM(Chromosomesegmentintrogressionlines,CSIL)交，回交和分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselection,MAS)構(gòu)建的覆蓋作物整個(gè)基因組的一系列近等基因系。它的基因組內(nèi)只有來自供體親本的一個(gè)純合的染色體片段，而基因組的其余部分與輪回親本相同。它是進(jìn)行基因組研究，特別是QTL定位和分子設(shè)計(jì)育種的理想材料。萬建民(萬建民.作物分子設(shè)計(jì)育種.作物學(xué)報(bào)，2006，32(3)=455-462.)已利用由粳稻Asominori(輪回親本)和秈稻IR24(非輪回親本)構(gòu)建的染色體片段置換系進(jìn)行了分子育種的實(shí)踐。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，包含如下步驟(1)以保藏號為CGMCCNO.5574的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095為母本，保藏號為CGMCCNO.5575的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2，每代都是單株收獲；(2)分子標(biāo)記輔助第一次選擇=F2種植，應(yīng)用CTAB法提取DNA，采用所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095對應(yīng)的分子標(biāo)記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM對應(yīng)的分子標(biāo)記引物對BNL1034、NAU1366、BNL3171進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇同時(shí)含有上述7個(gè)來源于海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株自交獲得F3，種子按單株收獲；其中分子標(biāo)記引物對NA似6正/反向序列為SEQIDNO.3/SEQIDNO.4，NAU5061正/反向序列為SEQIDNO.7/SEQIDNO.8，NAU5024正/反向序列為SEQIDNO.5/SEQIDN0.6,BNL1026正/反向序列為SEQIDNO.1/SEQIDNO.2，BNL1034正/反向序列為SEQIDNO.9/SEQIDNO.10，NAU1366正/反向序列為SEQIDNO.13/SEQIDNO.14，BNL3171正/反向序列為SEQIDNO.11/SEQIDNO.12；(3)分子標(biāo)記輔助第二次選擇種植F3，每株提取DNA后，再利用所述的分子標(biāo)記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU1366,BNL3171確定F3單株的基因型，同時(shí)具有7個(gè)來源于上述海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株即為抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。所述的分子育種方法還包括步驟將步驟C3)篩選到的抗多個(gè)黃萎病菌種的F3種植在溫室，利用致病力不同的黃萎病菌株進(jìn)行抗病性篩選獲得抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。有益效果本發(fā)明所提供的一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，與傳統(tǒng)的回交聚合育種技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)傳統(tǒng)的回交聚合育種技術(shù)存在雜交工作量大、選擇可靠性差、育種周期長的缺陷。通過分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀，可在2-3年內(nèi)快速高效培育出多抗的棉花新品系。本發(fā)明以海島棉染色體片段導(dǎo)入系——IL095和ILlM為材料，通過分子標(biāo)記輔助選擇獲得了抗多個(gè)黃萎病菌種的棉花新品系“南農(nóng)海導(dǎo)5號”，“南農(nóng)海導(dǎo)5號”抗棉花黃萎病的相對病指為15.51%-20.97%。圖1分子標(biāo)記輔助選擇抗多個(gè)黃萎病菌種的棉花新品系。圖2IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號接種3個(gè)落葉型的黃萎病菌株后的相對病指。A為IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號接種黃萎病菌株V991后的相對病指，B為IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號接種黃萎病菌株V07DF2后的相對病指，C為IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號接種黃萎病菌株D8092后的相對病指。生物材料保藏證明IL095為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.5574；ILlM為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.5575。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1選擇親本南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室棉花研究所以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-I為輪回親本，抗病、優(yōu)質(zhì)的海島棉海71M品系為供體親本(非輪回親本)，在回交高世代結(jié)合覆蓋全基因組的SSR分子標(biāo)記輔助選擇，培育了國內(nèi)首套陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-I背景的海島棉染色體片段導(dǎo)入系174個(gè)，其基因組的覆蓋率達(dá)83.5%。黃萎病菌株V991和V07DF2是長江棉區(qū)致病力不同的2個(gè)落葉型菌株(菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存)，黃萎病菌株D8092是黃河棉區(qū)的中等致病力的落葉型菌株(菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所保存)。利用V991、V07DF2和D80923個(gè)不同致病力的菌株在溫室接菌海島棉染色體片段導(dǎo)入系，篩選出抗V991、V07DF2和D80923個(gè)菌種的導(dǎo)入系IL095和抗V07DF2和D80922個(gè)菌株的導(dǎo)入系IL154。導(dǎo)入系IL095抗3個(gè)菌種的相對病指分別是24.55%(V991),27.45%(V07DF2)和25.16%(D8092)。導(dǎo)入系IL154抗3個(gè)菌種的相對病指分別是35.60%(V991)、19.56%(V07DF2)和14.05%(D8092)。導(dǎo)入系IL095為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.5574；導(dǎo)入系IL154為陸地棉(Gossypiumhirsutum.),2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCN0.5575。實(shí)施例2(1)2008年夏季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站分別種植IL095和ILlM各一行，IL095(CGMCCN0.5574)為母本，ILlM(CGMCCN0.5575)為父本配制雜交組合產(chǎn)生F1,成熟后全部混收。2008年冬季在海南三亞種植3行F1，自交獲得F2，成熟后全部混收。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。(2)分子標(biāo)記輔助選擇2009年夏季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站種植50行F2,每行10-12株，每株采集3-4片未展開的葉片放入1.5ml的印pendorf管中，并加入預(yù)冷的新鮮配制的提取緩沖液600μ1，電鉆研磨，應(yīng)用CTAB法(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis[J].PlantMolBiolR印，1993，11，2:122-127)提取DNA，采用IL095(CGMCCNO.5574)和IL154(CGMCCNO.5575)導(dǎo)入片段上的分子標(biāo)記(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系10μ1，DNA模板1μ1，94°C預(yù)變性5min，94°C變性0.5min，57°C復(fù)性0.5min，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為0.5倍TBE，170V恒壓電泳1.5小時(shí)。選擇含有7個(gè)分子標(biāo)記的50個(gè)單株自交獲得F3，種子按單株收獲。(3)2009年冬季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室將每一F3種植1行，每行15_25株，每株采集葉片，提取DNA后，利用表1提供的分子標(biāo)記確定F3株行的基因型，選擇7個(gè)標(biāo)記都是純合的株行(同時(shí)具有表1中來源于上述海島棉的7個(gè)分子標(biāo)記條帶)。表1IL095和IL154導(dǎo)入片段的SSR分子標(biāo)記權(quán)利要求1.一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，其特征在于包含如下步驟(1)以保藏號為CGMCCNO.5574的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095為母本，保藏號為CGMCCNO.5575的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2,每代都是單株收獲；(2)分子標(biāo)記輔助第一次選擇F2種植，應(yīng)用CTAB法提取DNA，采用所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095對應(yīng)的分子標(biāo)記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM對應(yīng)的分子標(biāo)記引物對BNL1034、NAU1366、BNL3171進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇同時(shí)含有上述7個(gè)來源于海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株自交獲得F3，種子按單株收獲；其中分子標(biāo)記引物對NA似6正/反向序列為SEQIDNO.3/SEQIDNO.4，NAU5061正/反向序列為SEQIDNO.7/SEQIDNO.8，NAU5024正/反向序列為SEQIDNO.5/SEQIDN0.6，BNL1026正/反向序列為SEQIDNO.1/SEQIDNO.2，BNL1034正/反向序列為SEQIDNO.9/SEQIDNO.10，NAU1366正/反向序列為SEQIDNO.13/SEQIDNO.14，BNL3171正/反向序列為SEQIDNO.11/SEQIDNO.12；(3)分子標(biāo)記輔助第二次選擇種植F3，每株提取DNA后，再利用所述的分子標(biāo)記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU1366、BNL3171確定F3單株的基因型，同時(shí)具有7個(gè)來源于上述海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株即為抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，其特征在于所述的分子育種方法還包括步驟將步驟C3)篩選到的抗多個(gè)黃萎病菌種的F3種植在溫室，利用致病力不同的黃萎病菌株進(jìn)行抗病性篩選獲得抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。全文摘要本發(fā)明屬于分子育種領(lǐng)域，涉及一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。該方法是以保藏號為CGMCCNo.5574的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095為母本，保藏號為CGMCCNo.5575的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL154為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2，每代都是單株收獲；再以分子標(biāo)記輔助選擇獲得抗多菌種的棉花新品系。利用這一方法，已經(jīng)培育出抗多菌種的棉花新品系“南農(nóng)海導(dǎo)5號”。通過分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀，可在2-3年內(nèi)快速高效培育出抗多菌種的棉花新品系?！澳限r(nóng)海導(dǎo)5號”抗棉花黃萎病的相對病指為15.51％-20.97％。文檔編號A01H1/02GK102517396SQ20111045096公開日2012年6月27日申請日期2011年12月29日優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日發(fā)明者張?zhí)煺?王鵬,郭旺珍申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)