一種奶牛乳腺上皮細(xì)胞永生化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞原代培養(yǎng)、單克隆細(xì)胞獲得、western blot檢測(cè)E6、E7病毒在奶牛乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá)和建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMEC, Bovine mammary epithelial cell)具有合成和分泌乳蛋白的功能，對(duì)微生物入侵乳腺組織具有防御作用。同時(shí)，它是乳腺組織重要的反應(yīng)細(xì)胞。因此，進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和細(xì)胞永生化被視為奶牛泌乳營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和奶牛乳房炎發(fā)病機(jī)制研究重要細(xì)胞模型。
[0003]國(guó)內(nèi)外基本上采用酶消化法分離培養(yǎng)原代培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(Wang M Z, Xu BL, Wang H R, et al./‘Effects of arginine concentrat1n on the in vitro express1nof casein and mTOR pathway related genes in mammary epithelial cells from dairycattle”，PLos One, 2014(5):e95985)，此方法能夠快速獲得原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞且成纖維細(xì)胞較少。然而，獲得的奶牛乳腺上皮細(xì)胞由于經(jīng)過(guò)高濃度酶長(zhǎng)時(shí)間消化，細(xì)胞膜的受體蛋白受到嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，無(wú)法很好地實(shí)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生理功能。
[0004]在國(guó)內(nèi)進(jìn)行的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)相關(guān)試驗(yàn)(陳建暉，佟慧麗，李慶章等，“奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立”2009，40 (5):743-747)中，這些細(xì)胞只能進(jìn)行有限的傳代培養(yǎng)，并不能很好的保存奶牛乳腺上皮細(xì)胞系。與之相比，國(guó)外的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系傳代次數(shù)較多。然而，在利用奶牛乳腺上皮細(xì)胞系進(jìn)行傳代過(guò)程中，隨著細(xì)胞傳代數(shù)的增加，奶牛乳腺上皮細(xì)胞系將會(huì)失去乳腺組織生理功能，如:染色體的核型改變，呈現(xiàn)單倍體或多倍體。染色體數(shù)目改變都將造成試驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差，甚至使得有些奶牛乳腺上皮細(xì)胞系根本不能表達(dá)乳蛋白，這樣就失去了利用奶牛乳腺上皮細(xì)胞來(lái)研究泌乳營(yíng)養(yǎng)調(diào)控及其泌乳機(jī)制的意義。因此，建立功能性的永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞系迫在眉睫。
[0005]病毒法是使得細(xì)胞永生化的方法之一，能夠有效地將靶基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)基因方法相比，此方法對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒害、感染效率高且能穩(wěn)定表達(dá)。目前使細(xì)胞永生化的病毒基因較多，如，hTERT、SV40、HPV16E6E7等病毒基因。其中，HPV E6和E7病毒基因是來(lái)自于女性宮頸癌細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物，能夠使人上皮細(xì)胞永生化(Tsao S A, Wang X H, Liu Y, “Establishment of two immortalized nasopharyngealepithelial cell lines using SV401arge T and HPV16E6/E7viral oncogenes，，.B1chimica et B1physica Acta, 2002 (1590): 150-158)。HPV E6 和 E7 病毒基因分別使得人類上皮細(xì)胞永生化的兩個(gè)重要信號(hào)通路pRb_pl6INK4a和p53失活，從而使細(xì)胞分別繞過(guò)Ml和M2期，最終使細(xì)胞具有無(wú)限增值的能力。然而，目前尚無(wú)HPV E6和E7能夠使奶牛乳腺上皮細(xì)胞永生化的報(bào)道。因而，將上述人上皮細(xì)胞的永生化方法應(yīng)用到奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有以下幾點(diǎn)難點(diǎn)和疑點(diǎn):1)在利用病毒法將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)時(shí)，病毒骨架上的包膜糖蛋白Vsvg是否能夠結(jié)合奶牛乳腺上皮細(xì)胞脂質(zhì)，雖然目前研究中，Vsvg蛋白能夠結(jié)合大多數(shù)人或小鼠上皮細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，但是尚未見(jiàn)其能夠結(jié)合奶牛乳腺上皮細(xì)胞膜上的脂質(zhì)的報(bào)道；2)由于病毒的滴度低，加上原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞“無(wú)法快速分離導(dǎo)致細(xì)胞繁殖慢”的特點(diǎn)，會(huì)造成感染細(xì)胞效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的難點(diǎn)和疑點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種高效率地利用HPV E6和E7病毒基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞進(jìn)行永生化的方法，以及一種建立生長(zhǎng)速度快和穩(wěn)定連續(xù)傳代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的方法，從而獲得具有生理功能的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，為奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和奶牛乳房炎的發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞素材。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]本發(fā)明提供了一種奶牛乳腺上皮細(xì)胞永生化方法，其特征在于，在采用HPV E6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞使其永生化時(shí)，添加泛嗜性和兼嗜性的病毒顆粒。與增加單一嗜性的病毒顆粒相比，這樣能夠與奶牛乳腺上皮細(xì)胞表面結(jié)合更多的跨膜分子，從而增加病毒感染效率。
[0009]其中，采用以下病毒法永生化原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，包括以下步驟:
[0010]I)接種奶牛乳腺上皮細(xì)胞；
[0011]2)待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度大約為50% -70%時(shí)，棄上清液，用PBS清洗細(xì)胞；
[0012]3)將泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液加入步驟2)中的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中；
[0013]4)將步驟3)中獲得的混合液離心，留取上清液；
[0014]5)將步驟4)中獲得的上清液放置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h ;
[0015]6)吸棄步驟5)中獲得混合液的上清液，加DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0016]7)待細(xì)胞密度匯合至70% -80%時(shí)，用抗生素篩選陽(yáng)性克隆。
[0017]可選地，可以在步驟3)中的泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液中添加聚凝胺以消除混合后病毒和細(xì)胞之間產(chǎn)生電荷排斥，使得病毒能夠更好地接觸細(xì)胞膜表面，增加感染效率。
[0018]可選地，可以在步驟4)中獲得的上清液中加入表皮生長(zhǎng)因子、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸元、催乳素和氫化可的松等刺激因子，促進(jìn)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠快速進(jìn)入細(xì)胞的分裂期。由于處于分裂期的細(xì)胞更容易被病毒感染，從而最終實(shí)現(xiàn)提高病毒轉(zhuǎn)基因效率的目的。
[0019]本發(fā)明還提供了一種建立永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0020](I)將采集到的奶牛乳腺組織在培養(yǎng)基中剪碎后，將其上清液接種在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行組織塊原代培養(yǎng)。與目前常用的酶消化法相比，這樣培養(yǎng)的細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞活力，增殖速度快，是一種獲得類似于奶牛體內(nèi)的原代乳腺細(xì)胞方法；
[0021](2)采用本發(fā)明上面敘述的病毒法感染原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，以使得奶牛乳腺上皮細(xì)胞永生化；
[0022](3)篩選陽(yáng)性克隆，使細(xì)胞在形態(tài)、遺傳、染色體穩(wěn)定性和生物學(xué)功能上保持一致，進(jìn)行細(xì)胞系的培養(yǎng)。
[0023]優(yōu)選地，在步驟(2)中，當(dāng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)就進(jìn)行病毒感染。與人的乳腺上皮細(xì)胞達(dá)到70%才進(jìn)行感染的情況相比，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%進(jìn)行病毒感染，能夠產(chǎn)生更多的陽(yáng)性克隆，為下一步成功進(jìn)行單克隆細(xì)胞創(chuàng)造條件。
[0024]本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了如下的有益效果:
[0025](I)在病毒感染奶牛乳腺上皮細(xì)胞過(guò)程中，由于原代細(xì)胞增值緩慢，并且不能夠快速分裂，細(xì)胞處于靜息期，這使得病毒很難感染細(xì)胞。在本發(fā)明提供的奶牛乳腺上皮細(xì)胞永生化方法中，使用泛嗜性和兼嗜性病毒顆粒同時(shí)感染奶牛乳腺上皮細(xì)胞。由于這兩種病毒顆?？梢愿腥炯?xì)胞膜表面不同的跨膜分子，進(jìn)而增加泛嗜性以及兼嗜性病毒顆粒的包膜糖蛋白結(jié)合細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)受體以及GALV和RAMl受體，從而提高病毒感染效率。同時(shí)，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，也可以在病毒的上清液內(nèi)加入表皮生長(zhǎng)因子、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸元、催乳素和氫化可的松，從而使原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠快速進(jìn)入細(xì)胞的分裂期。由于處于分裂期的細(xì)胞更容易被病毒感染，從而達(dá)到增加轉(zhuǎn)基因效率的目的。
[0026](2)本發(fā)明提供的建立永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的方法采用組織塊原代培養(yǎng)的方式，使得培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞活力，增殖速度快。此外，由于在此培養(yǎng)的過(guò)程中無(wú)需添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子，大大地節(jié)省了成本。
[0027](6)采用本發(fā)明的方法建立的永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞系可以永久性保存，避免了多次采集乳腺組織帶來(lái)的麻煩，可作為商品化的細(xì)胞系。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1是奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)電子顯微鏡圖(放大100倍)。其中，(a)是通過(guò)HPV16E6和E7永生化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞；(b)是未轉(zhuǎn)入HPV16E6和E7的第15代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。
[0029]圖2是奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18免疫熒光顯微鏡照片(放大200倍)。
[0030]圖3是奶牛乳腺上皮細(xì)胞染色體核型分析。
[0031]圖4是檢測(cè)HPV16E6和HPV16E7病毒蛋白在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)的Western blot結(jié)果。其中，BMEC:奶牛乳腺上皮細(xì)胞；Cask1:女性宮頸癌細(xì)胞；BMEC_E6E7:轉(zhuǎn)染入HPV16E6和E7的奶牛乳腺上皮細(xì)胞；β -actin: β -肌動(dòng)蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。
[0033]采用病毒法感染原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，將HPV16E6和Ε7病毒基因?qū)肽膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞中:1)接種I X 15個(gè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞于6孔板中，2)待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度大約為50%時(shí)，棄上清液，用2ml的PBS清洗細(xì)胞3次；3)將Iml的泛嗜性病毒液和Iml兼嗜性病毒液加入含有奶牛乳腺上皮細(xì)胞6孔板中；4)加入6 μ g/ml聚凝胺，以消除病毒和細(xì)胞之間的電荷差異，使病毒能夠更好地接觸細(xì)胞膜表面，增加感染效率。雖然聚凝胺對(duì)某些細(xì)胞有毒，但是對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞毒性并不大，左右擺動(dòng)6孔板，混合均勻；5)將六孔板放入離心機(jī)中，36°C離心90min ；6)在離心后的病毒上清液中加入終濃度為20ng/ml表皮生子因子、I μ g/mL氫化可的松、和4ug/ml催乳素(Sigma)和I倍胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸(Invitrigen) ;7)將6孔板放置37°C、5% Co2培養(yǎng)箱中孵育24h ;8)感染過(guò)夜之后，將上清液吸棄，加DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；9)待細(xì)胞密度匯合至70%時(shí)，用300?500 μ g/ml的G 418抗生素篩選陽(yáng)性克隆，連續(xù)篩選15天。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化進(jìn)行換液，一般每隔5天換液。I?3天奶牛乳腺上皮細(xì)胞在G 418抗生素作用下死亡不明顯，第4天之后，在G 418抗生素作用奶牛乳腺上皮細(xì)胞開(kāi)始慢慢死亡。第10天，未導(dǎo)入病毒基因的奶牛乳腺上皮細(xì)胞全部死亡。然而，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)還有一些奶牛乳腺上皮細(xì)胞開(kāi)始增殖且速度較快，出現(xiàn)