中是有效的，其IC5Q為241nM。這比具 有0.9nM的IC5q的4084F DNAps的效力的有效性低大致兩個數(shù)量級，表明磷酸二酯形式的游 離DNA是TLR活化的相對差的抑制劑（圖4)。
[0220]重要的是，這些數(shù)據(jù)證實免疫調(diào)節(jié)序列的預處理對于構(gòu)建體有效不是必需的。這 是重要區(qū)別，因為它使得當臨床中存在炎性癥狀時該技術能夠既被用作預防又被用作急性 治療。
[0221] 有趣的是，Po形式的AST-015對硫代磷酸酯活化TLR9的含有CpG的DNA顯示低納摩 爾效力，而其相應的游離DNA等價物在阻斷這種活化方面無效。ps形式的AST-015對其游離 DNA等價物是等效的（equipotent)。這證實免疫調(diào)節(jié)DNA能夠被載入SNA構(gòu)建體而不失去其 活性并且與游離DNA等價物所預期的相比具有不同的效力。鑒于該數(shù)據(jù)，可以以堿基序列的 選擇性修飾設計寡核苷酸構(gòu)建體。例如可以進行在特異性位點選擇性并入硫代磷酸酯主鏈 和并入親脂性劑(諸如膽固醇、十八烷基和/或軟脂?；┮源龠M膜結(jié)合(參見表2)。這允許 利用SNA結(jié)構(gòu)的有利性質(zhì)(諸如增強的在生物流體中的降解抗性、增強的生物分布和構(gòu)建體 體內(nèi)快速攝取)以相比于目前的游離DNA治療方法開發(fā)更有效的療法。
[0222] 實施例5irSNA能夠拮抗多種TLR
[0223] SNA構(gòu)建體適合并入定制的調(diào)節(jié)序列以用作范圍更廣的TLR的拮抗劑。將這些構(gòu)建 體與拮抗劑的目前現(xiàn)有技術遞送進行比較。為了完成這一點，設計新的TLR7/8/9的拮抗劑 序列，并與由Dynavax 23,24開發(fā)的目前臨床相關序列進行效力上的比較(表3)。使用如上所述 的相同系統(tǒng)，將RAW-Blue細胞以濃度漸增的4084F、IRS869、IRS954或者AST開發(fā)的4084F7/8 (所有的均具有硫代磷酸酯主鏈化學物質(zhì))孵育兩小時以允許攝取和內(nèi)體內(nèi)化。然后以〇.5μ M的活化TLR9的具有硫代磷酸酯主鏈的CpG 1668 DNA或者以5μΜ的活化TLR7/8的單鏈RNA即 ssRNA 0664攻擊細胞過夜，使用上述顯色測定測量TLR的活化。結(jié)果示于圖5中。
[0224] 有趣的是，被并入AST-015的4084F序列對TLR9與現(xiàn)有技術Dynavax序列IRS869和 IRS954 (IC5Q: 4084F = 2 · 8nM; IRS869 = 3 · OnM; IRS954 = 9 · 4nM) -樣有效，而AST開發(fā)的TLR7/ 8/9拮抗劑4084F7/8具有更弱但仍然有效的196nM的IC5Q(圖5A)。重要的是，4084F7/8相對 (versus)其具有和Dynavax序列具有相同效力的堿基序列對應物4084F獲得了拮抗TLR7/8 活化的能力（IC5Q :4084F>10,000nM;IRS869 = 4,775nM;IRS954 = 3，134nM;4084F7/8 = 3， 956nM)(圖 5B)。
[0225] 重要的是，該實施例證實可以通過堿基序列的修飾設計拮抗內(nèi)體TLR范圍的特異 性序列?；谶@些數(shù)據(jù)，本領域技術人員可以開發(fā)SNA形式的既是特異性TLR拮抗劑又是廣 譜TLR拮抗劑，其將與它們的游離DNA對應物或目前現(xiàn)有技術經(jīng)臨床測試的構(gòu)建體相比同等 地或優(yōu)于其而執(zhí)行功能。
[0226] 實施例6:各種toll樣受體激動劑活性的脂質(zhì)體球形核酸拮抗作用。
[0227] 通過形成由常規(guī)脂質(zhì)體擠出方法所形成的由D0PC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰 膽堿)組成的脂微團核心制備脂質(zhì)體3嫩。00?(：微團形成之后，序列4084?(5'-〇01'扣扣*八* T*g*G*G*A*A-3'（SEQ ID NO: 121)，*表示硫代磷酸酯）或4084F-Ext(5'-T*G*C*T*T*G*A*C* A*〇OT*G*G*A*T*G*G*G*A*A-3 '）（SEQ ID NO: 122)的寡核苷酸被附接至脂質(zhì)基團3 '端，諸 如二硬脂基或生育酸并通過簡單混合被并入微團，接著通過切向流過濾(tangential flow filtration)純化以獲得大約~100條核苷酸/SNA的純化的脂質(zhì)體SNA。用所示TLR的激動劑 (咪喹莫特(TLR7,圖7B)、CpG 1826(CpG，TLR9,圖7D)、細菌脂多糖(LPS，TLR4,圖7C)、或者所 有的三種同時（圖7A))孵育RAW-Blue巨噬細胞（InViv〇Gen)4小時，接著用所示脂質(zhì)體SNA或 PBS孵育過夜并參考未處理的。數(shù)據(jù)示于圖7中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種構(gòu)建體均能夠阻斷所有三種 激動劑的刺激。

[0232] 參考文獻
[0233] (I)Hornung，VRothenfusser，SBritsch，SKrug，AJahrsdorfer，B·; GiesejT.；Endres,S.；Hartmann,G.J Immuno12002，168，4531·
[0234] (2)Stacey，K.J.;Sweet，M.J.;Hume，D.A.J Immunoll996，157,2116.
[0235] (3)Zarember,K.A.；Godowski,P.J.J Immunol2002,168,554.
[0236] (4)Bauer,M.；Redecke,V.；Ellwart,J.ff.；Scherer,B.；Kremer,J.P.；ffagner,H.； Lipford,G.B.J Immuno12001,166,5000.
[0237] (5)Bauer,S.；Kirschning,C.J.；Hacker,H.；Redecke,V.；Hausmann,S.；Akira, S.；ffagner,H.；Lipford,G.B.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America2001,98,9237.
[0238] (6)Diebold,S.S.；Massacrier,C.；AkirajS.；Paturel,C.；MoreI,Y.；Reis e Sousa,C.European journal of immunology2006,36,3256.
[0239] (7)Forsbach ,A. ； Nemor in , J. G. ；Montino,C. ；Muller,C. ； Samulowi tz , U.； Vicari,A.P.；Jurk,M.；Mutwiri,G.K.；Krieg,A.M.；Lipford,G.B.；Vollmer,J.J Immunol2008，180，3729.
[0240] (8)Heil，F(xiàn) .；Hemmi,H.；Hochrein,H.；Ampenberger,F.；Kirschning,C.；Akira, S.；Lipford,G.；ffagner,H.；Bauer,S.Science2004,303,1526.
[0241] (9)Krieg,A.M.Journal of clinical immunologyl995,15,284.
[0242] (IO)Kr ieg，A.M. ;Yi，A.K· ; Matson，S. ; Waldschmidt，T · J" ·; Bishop，G · A ·; TeasdalejR.；Koretzky,G.A.；Klinman,D.M.Naturel995,374,546.
[0243] (11)ffest, A.P.；Koblansky, A. A.；Ghosh ,S. Annual review of cell and developmental biology2006,22,409.
[0244] (12)Peter，M. ;Bode，K. ;Lipford，G.B. ;Eberle，F(xiàn). ;Heeg，K. ;Dalpke， A.H.Immunology2008,123,118.
[0245] (13)Lenert，P. ;Yi，A .K.；Krieg,A.M.；Stunz,L.L.；Ashman,R.F.Antisense& nucleic acid drug development2003,13,143.
[0246] (H)Stunz ,L.L. ；Lenert ,P. ；PeckhamjD. ；Yi ,A.K. ；Haxhinasto ,S. ；ChangjM.； KriegjA.M.；Ashman,R.F.European journal of immunology2002,32,1212.
[0247] (15)Krieg,J.；Hartmann,S.；Vicentini, A.；Glasner,ff.；Hess,D.；Hofsteenge, J.Molecular biology of the celll998,9,301.
[0248] (16)Lenert，P·;Rasmussen，W·;Ashman，R·F·;Ballas，Z·K·DNA and ceII biology2003,22,621.
[0249] (17)Gursel, I.；GurseI,M.；Yamada,H.；Ishii,K.J.；Takeshita,F.；K1inman, D.M.J Immunol2003,171,1393.
[0250] (18)Goh,F.G.；Midwood,K.S.Rheumatology(Oxford)2012,51,7.
[0251 ] (19)Chabaud,M.；Durand,J.M.；Buchs,N.；Fossiez,F.；Page,G.；Frappart,L.； Miossec,P.Arthritis and rheumatisml999,42,963.
[0252] (20)van den BergjW-B^MiossecjP-Nature reviews .Rheumatology2009,5 , 549.
[0253] (21)Emery,P. ；Fleischmann ,R. ；Filipowicz-Sosnowska ,A. ； Schechtman, J.； Szczepanski,L.；Kavanaugh,A.；Racewicz,A.J.；van Vollenhoven,R.F.；Li,N.F.； Agarwal,S.；Hessey,E.ff.；Shaw,T.M.Arthritis and rheumatism2006,54,1390.
[0254] (22)YangjG.；WanjM.；Zhang,Y.；Sun jL.；SunjR.；Hu,D.；ZhoujX.；ffang,L.；ffu, X.；Yu,Y.Immunology2010,131,501.
[0255] (23)Kanzler,H. ；Barrat,F.J. ；Hessel,E.M. ；Coffman,R.L.Nature medicine2007，13，552·
[0256] (24)Barrat,F.J.；Meeker,T.；Gregorio,J.；Chan,J.H.；Uematsu,S.；Akira,S.； Chang,B.；Duramad,0.；Coffman,R.L. The Journal of experimental medicine2005,202, 1131.
[0257] (25)Krieg,A.M.；ffu,Τ.；WeeratnajR.；Efler,S.M.；Love-Homan,L.；Yang jL.；Yi, A.KShort，DDavis，H.L·Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americal998,95,12631.
[0258] 等價物
[0259] 本領域技術人員將認識到（或者能夠使用不超過常規(guī)實驗確定)本文中所述的本 發(fā)明的特定實施方案的許多等價物。這樣的等價物旨在由以下權利要求書所涵蓋。
[0260] 本文中所公開的所有參考文獻(包括專利文件)被通過引用全文并入。
【主權項】
1. 納米級構(gòu)建體，其包含： 核酸相互作用復合物的拮抗劑的冠部，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑的表面 密度為至少0 · 3pmol/cm2〇2. 納米級構(gòu)建體，其包含： 核酸相互作用復合物的拮抗劑的冠部，以及被并入所述冠部的抗原，其中所述抗原的 表面密度為至少0 · 3pmol/cm2〇3. 權利要求2所述的納米級構(gòu)建體，其中所述抗原包括至少兩種不同類型的抗原。4. 納米級構(gòu)建體，其包含： 并入了核酸相互作用復合物的至少兩種拮抗劑的冠部，其中所述拮抗劑選自由TLR 3、 7/8和/或9的拮抗劑組成的組。5. 權利要求1 _4任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑 含有間隔子。6. 權利要求1 _5任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑 是RNA或DNA。7. 權利要求6所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑是雙鏈RNA 或雙鏈DNA。8. 權利要求6所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑是單鏈 RNA〇9. 權利要求1 -8任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑 的表面密度為至少15pmol/cm2〇10. 權利要求1-8任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑 的表面密度為至少45pmol/cm2〇11. 權利要求6所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸相互作用復合物的拮抗劑為未甲基 化的脫氧核糖核酸。12. 權利要求11所述的納米級構(gòu)建體，其中所述未甲基化的脫氧核糖核酸含有優(yōu)化的 免疫調(diào)節(jié)序列。13. 權利要求1 -12任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述納米級構(gòu)建體含有納米顆粒 核心，所述納米顆粒核心是金屬的。14. 權利要求13所述的納米級構(gòu)建體，其中該金屬核心選自由金、銀、鉑、鋁、鈀、銅、鈷、 銦、鎳及其混合物組成的組。15. 權利要求13所述的納米級構(gòu)建體，其中所述納米顆粒核心包含金。16. 權利要求1-16任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述納米級構(gòu)建體是可降解的。17. 權利要求1-16任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述納米級構(gòu)建體的直徑是平均 直徑lnm至大約250nm、平均直徑大約lnm至大約240nm、平均直徑大約lnm至大約230nm、平均 直徑大約lnm至大約220nm、平均直徑大約lnm至大約210nm、平均直徑大約lnm至大約200nm、 平均直徑大約lnm至大約190nm、平均直徑大約lnm至大約180nm、平均直徑大約lnm至大約 170nm、平均直徑大約lnm至大約160nm、平均直徑大約lnm至大約150nm、平均直徑大約lnm至 大約140nm、平均直徑大約lnm至大約130nm、平均直徑大約lnm至大約120nm、平均直徑大約 lnm至大約llOnm、平均直徑大約lnm至大約100nm、平均直徑大約lnm至大約90nm、平均直徑 大約lnm至大約80nm、平均直徑大約lnm至大約70nm、平均直徑大約lnm至大約60nm、平均直 徑大約lnm至大約50nm、平均直徑大約lnm至大約40nm、平均直徑大約lnm至大約30nm或者平 均直徑大約1 nm至大約20nm或者平均直徑大約1 nm至大約1 Onm。18. 納米級構(gòu)建體，其包含： 核酸相互作用復合物的拮抗劑的球形冠部，其中所述拮抗劑是具有至少一個核苷酸間 磷酸二酯鍵的核酸。19. 權利要求18所述的納米級構(gòu)建體，其中所述詰抗劑是CpG寡核苷酸。20. 權利要求18-19任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述核酸的每個核苷酸間鍵是磷 酸二酯鍵。21. 權利要求1-20任一項所述的納米級構(gòu)建體，其中所述冠部是球形冠部。22. 包含權利要求1-21任一項的納米級構(gòu)建體和載體的疫苗。23. 用于向細胞遞送治療劑的方法，其包括向所述細胞遞送權利要求1-21任一項所述 的納米級構(gòu)建體。24. 用于調(diào)控靶分子的表達的方法，其包括向細胞遞送權利要求1-21任一項所述的納 米級構(gòu)建體。25. 權利要求24所述的方法，其中所述靶分子是選自由TLR3、7、8和9組成的組的TLR。26. 用于拮抗TLR的方法，其包括向細胞遞送權利要求1-21任一項所述的納米級構(gòu)建 體。27. 治療受試者的方法，其包括 向所述受試者施用有效量的權利要求1-21任一項所述的納米級構(gòu)建體以降低免疫應 答。28. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有感染性疾病。29. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有炎癥誘導的癌癥。30. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有自身免疫性疾病。31. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有變態(tài)反應。32. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有變應性疾病。33. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有炎性疾病。34. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有代謝性疾病。35. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者患有心血管疾病。36. 權利要求27所述的方法，其中所述受試者是組織或器官移植的候選者或者接受者。37. 調(diào)節(jié)受試者中免疫應答的方法，其包括 向所述受試者施用有效量的權利要求18-21任一項所述的納米級構(gòu)建體以調(diào)節(jié)免疫應 答。
【專利摘要】本發(fā)明的方面涉及納米級構(gòu)建體及其相關方法和組合物。本發(fā)明的組合物有效用于治療對免疫細胞活化水平敏感的紊亂，諸如自身免疫性疾病或其他基于炎癥的疾病或紊亂。
【IPC分類】A61K47/48, A61P35/00, A61P37/00, A61P31/00, A61P37/04, A61P37/08
【公開號】CN105658241
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】S·格亞茲諾夫, C·C·馬德爾, T·L·哈洛, A·F·拉多維克莫雷諾, C·李施, S·安安塔木拉
【申請人】?？宋骺坠煞萦邢薰?br>【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年7月25日