核糖)的堿基。優(yōu)選核苷的 實例包括核糖核苷和脫氧核糖核苷。核苷還包括被連接至氨基酸或氨基酸類似物的堿基， 所述氨基酸或氨基酸類似物可以包含游離羧基、游離氨基或保護基團。合適的保護基團是 本領(lǐng)域眾所周知的（參見P.G.M.Wuts和T.W.Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis"，2nd Ed.,Wiley-Interscience,New York,1999)。
[0165] 術(shù)語"核苷酸"包括進一步包含磷酸基團或磷酸類似物的核苷。
[0166] 本文中使用的術(shù)語"鍵"包括天然存在的、未修飾的磷酸二酯部分(-0-(P02J-0-)， 其共價連接相鄰核單體。本文中使用的術(shù)語"取代鍵(substitute Iinkage)"包括共價連接 相鄰核單體的天然磷酸二酯基團的任何類似物或衍生物。取代鍵包括磷酸二酯類似物，例 如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、和? -乙氧基磷酸二酯(？11：117(?7。1108。110(1丨68七61')、？-乙氧 基磷酸二酯(？-6丨11(?7口1108口110(1丨68丨61')、？-烷氧基磷酸三酯、膦酸甲酯和不含磷的鍵，例如 縮醛和酰胺。這樣的取代鍵是本領(lǐng)域已知的（例如Bjergarde等人1991 .Nucleic Acids Res · 19:5843;Caruthers等人1991 .Nucleosides Nucleotides · 10 :47)。在某些實施方案 中，優(yōu)選不易水解的鍵，諸如硫代磷酸酯鍵。
[0167] 在一些方面，本發(fā)明的多核苷酸包含3'和5'末端(除了環(huán)形寡核苷酸）?？梢酝ㄟ^ 例如修飾3'或5'鍵基本上保護多核苷酸的3'和5'末端免受核酸酶降解(參見美國專利號5， 849,902和WO 98/13526)?？梢酝ㄟ^包含"封閉基團（blocking group)"使寡核苷酸具有抗 性。本文中使用的術(shù)語"封閉基團"是指能夠被附接至寡核苷酸或核單體的取代基(例如除 了 OH基團），作為用于合成的保護基團或連接基團（例如FITC、丙基(CH2-CH2-CH 3 )、二醇(-0-CH2-CH2-O-)、磷酸（P〇32-)、膦酸氫基（hydrogen phosphonate)或亞磷酰胺 (phosphoramidite))。"封閉基團"也包括保護寡核苷酸的5'和3'末端的"封端基團"或"阻 止外切核酸酶的基團"，包括修飾的核苷酸和非核苷酸外切核酸酶抗性結(jié)構(gòu)。
[0168] 示例性封端基團包括帽結(jié)構(gòu)(例如7-甲基鳥苷帽）、倒位的核單體，例如具有3^3' 或5' -5'端倒位（inversion)(參見例如Ortiagao等人 1992 .Antisense Res .Dev · 2:129)、勝 酸甲酯、亞磷酰胺、非核苷酸基團（例如非核苷酸接頭(linker)、氨基接頭、綴合物)等。3'末 端核單體可以包含修飾的糖部分。3'末端核單體包含能夠任選地被封閉基團取代的3'-0， 所述封閉基團防止3'-外切核酸酶降解寡核苷酸。例如，3'-羥基可以通過3' 43'核苷酸間 鍵被酯化成核苷酸。例如，烷氧基可以是甲氧基、乙氧基或異丙氧基，并且優(yōu)選乙氧基。任選 地，在3'末端被3' 43'連接的核苷酸可以通過取代鍵進行連接。為了減少核酸酶降解，5'最 末端鍵可以是修飾的鍵，例如硫代磷酸酯鍵或P-烷氧基磷酸三酯鍵。優(yōu)選地，兩種5' 最末端3Z-5'鍵是修飾的鍵。任選地，5'末端羥基部分可以用含磷的部分進行酯化，例如磷 酸酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯。
[0169] 在一些方面，多核苷酸可以包含DNA和RNA二者。
[0170] 在一些方面，連續(xù)多核苷酸的至少一部分通過取代鍵(例如硫代磷酸酯鍵)進行連 接。由于它們針對血清蛋白具有更高的親和力，取代鍵的存在可以改善藥物動力學(xué)。
[0171] 納米級構(gòu)建體的寡核苷酸優(yōu)選在長6至100個堿基的范圍中。但是，如果存在足夠 多的免疫調(diào)芐基序，任何大小大于6個核苷酸(甚至許多長kb)的核酸能夠誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明 的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，核酸的大小范圍在8至100個核苷酸之間并且在一些實施方案中在8至 50個核苷酸之間或8至30個核苷酸之間。
[0172] 在一些實施方案中，免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸具有修飾的主鏈，諸如硫代磷酸酯(PS)主 鏈。在其他實施方案中，免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸具有磷酸二酯(PO)主鏈。在又一些其他實施方案 中，免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸具有混合的PO和PS主鏈。
[0173] 與本發(fā)明相關(guān)的形式(modality)(包括核酸相互作用復(fù)合物的拮抗劑和抗原）可 以通過本領(lǐng)域任何已知的手段被附接至納米顆粒核心。用于將寡核苷酸附接至納米顆粒的 方法被詳細描述于并通過引用并入自美國專利公開號2010/0129808。
[0174] 可以對納米顆粒進行官能化以附接多核苷酸。備選地或另外，多核苷酸可以被官 能化。官能化的一個機制是烷基硫醇法(alkanethiol method)，從而在附接至金納米顆粒 或包含其他金屬、半導(dǎo)體或磁性材料的納米顆粒之前用烷基硫醇在寡核苷酸的3 '或5 '末端 對寡核苷酸進行官能化。這樣的方法被描述于例如Whitesides ,Proceedings of the Robert A.Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry，Houston，Tex ·，pages 109-121 (1995)和Mucic等人Chem· Commun · 555-557 (1996)中。寡核苷酸還可以使用其他官能團（諸如硫代磷酸酯(phosophorothioate)基團） (如被描述于并通過引用并入自美國專利號5,472,881)或者取代的烷基硅氧烷(如被描述 于并通過引用并入自 BurwelI，Chemical Technology，4，370-377( 1974)和Matteucci和 Caruthers，J. Am .Chem. Soc ·，103,3185-3191(1981))被附接至納米顆粒。在一些情況下，多 核苷酸通過用5'或3'硫代核苷(thionucleoside)終止該多核苷酸被附接至納米顆粒。在其 他情況下，如描述于并通過引用并入自美國專利號6，361，944、6，506，569、6，767，702和6， 750,016和PCT公開號WO 1998/004740、W02001/000876、W0 2001/051665和WO 2001/ 073123,使用老化過程將多核苷酸附接至納米顆粒。
[0175] 在一些情況下，核酸和/或抗原被共價附接至納米顆粒核心，諸如通過金-硫醇鍵。 間隔子序列可以被包括在附接部位和攝取控制部分和/或結(jié)合部分之間。在一些實施方案 中，間隔子序列包含或由寡核苷酸、肽、聚合物或低聚乙烯組成。
[0176] 可以用多種化學(xué)物質(zhì)設(shè)計納米級構(gòu)建體。例如，可以使用DTPA (二硫醇亞磷酰胺） 鍵。DTPA抵抗硫醇產(chǎn)生的熒光(flare)的胞內(nèi)釋放并可以用于提高信噪比。
[0177] 由本文中所述方法產(chǎn)生的綴合物比其他方法產(chǎn)生的那些顯著更穩(wěn)定。該增加的穩(wěn) 定性是由于納米顆粒核心表面上或形成冠部表面的寡核苷酸的密度增加。通過在表面活性 劑(例如大致為〇.01%的十二烷基硫酸鈉(SDS)、吐溫或聚乙二醇(PEG))的存在下進行鹽加 成，可以在大約一小時中進行鹽老化過程。
[0178] 表面密度可以取決于納米顆粒的大小和類型并取決于寡核苷酸的長度、序列和濃 度?？梢愿鶕?jù)經(jīng)驗確定足以使納米顆粒穩(wěn)定的表面密度和針對納米顆粒和寡核苷酸的期望 的組合獲得該表面密度的必要條件。一般而言，具有至少10皮摩爾/cm的表面密度將足以提 供穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸綴合物。優(yōu)選地，表面密度為至少15皮摩爾/cm。因為如果表面 密度過大，則可以減弱綴合物的寡核苷酸與靶雜交的能力，表面密度任選地不大于大約35-40皮摩爾/cm 2。還提供方法，其中寡核苷酸以至少10pmol/cm2、至少15pmol/cm2、至少 20pmol/cm 2、至少 25pmol/cm2、30pmol/cm2、至少 35pmol/cm2、至少 40pmol/cm2、至少 45pmol/ cm2、至少50pmol/cm2或50pmol/cm2或更多的表面密度結(jié)合至納米顆粒。
[0179] 本發(fā)明的方面涉及將納米級構(gòu)建體遞送至受試者用于治療和/或診斷用途。顆粒 可以單獨進行施用或者在任何適當(dāng)?shù)乃幬飳W(xué)載體(諸如液體(例如鹽水）、或粉末）中用于體 內(nèi)施用。它們還可以用更大的載體顆粒或在施用裝置內(nèi)進行共遞送。顆?？梢员慌渲?。本發(fā) 明的制劑可以藥學(xué)上可接受的溶液的形式被施用，所述溶液可以常規(guī)地含有藥學(xué)上可接受 的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體、佐劑和任選地其他治療成分。在一些實施方案 中，與本發(fā)明相關(guān)的納米級構(gòu)建體與諸如洗劑(例如羊毛脂制劑(aquaphor))的物質(zhì)混合并 被施用至受試者的皮膚，從而該納米級構(gòu)建體通過受試者的皮膚進行遞送。應(yīng)當(dāng)理解的是， 本領(lǐng)域已知的任何遞送納米顆粒的方法可以與本發(fā)明的方面相容。
[0180] 對于治療用途，可以任何將顆粒遞送至期望細胞的模式將有效量的顆粒施用至受 試者。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段完成施用藥物組合物。施用途徑包括但不限 于口服、腸胃外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、鼻內(nèi)、舌下、氣管內(nèi)、吸入、眼、陰道、皮膚、直腸和 通過直接注射。
[0181] 因此，本發(fā)明在一個方面涉及核酸相互作用復(fù)合物的拮抗劑高效介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作 用的發(fā)現(xiàn)。核酸相互作用復(fù)合物的這些拮抗劑治療性和預(yù)防性用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以治療癌 癥、感染性疾病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、自身免疫性疾病和其他基于炎性的疾病。
[0182] 根據(jù)其他方面，本發(fā)明是治療受試者的方法，其涉及向受試者施用有效量的如本 文中所述的納米級構(gòu)建體以降低免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，受試者患有感染性疾病、癌 癥、自身免疫性疾病、哮喘、或變應(yīng)性疾病、炎性疾病、代謝性疾病、心血管疾病或者受試者 是組織或器官移植的候選者或者接受者。
[0183] 代謝性疾病的實例包括、但不限于I型糖尿病、糖代謝、氨基酸代謝、有機酸代謝、 脂肪酸氧化和線粒體代謝、撲啉代謝、嘌呤或嘧啶代謝、類固醇代謝、溶酶體線粒體功能、過 氧化物酶體功能、溶酶體貯積的紊亂、尿素循環(huán)障礙(例如N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥、氨 甲酰磷酸合成酶缺乏癥、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥、精氨琥珀酸酸尿(crginosuccinic aciduria)、瓜氨酸血癥(citrullinaemia)、精氨酸酶缺乏癥）、氨基酸障礙(例如非酮性高 甘氨酸血癥(Non-ketotic hyperglycinaemia)、酪氨酸血癥（tyrosinaemia) (I型）、楓糖尿 癥）、有機酸血癥(例如異戊酸血癥、甲基丙二酸血癥、丙酸血癥、I型戊二酸酸尿、Ι&Π型戊 二酸血癥）、線粒體障礙(例如羧化酶缺陷、線粒體肌病、乳酸性酸中毒(丙酮酸脫氫酶復(fù)合 物缺陷）、先天性乳酸性酸中毒、線粒體呼吸鏈缺陷、胱氨酸貯積癥、戈謝病、法布里病、Π型 糖原IC積癥(Pompe's disease)、I型粘多糖積癥(mucopolysaccharoidosis I)、11型粘 多糖貯積癥、VI型粘多糖貯積癥）。
[0184] 心血管疾病是指心臟和血管系統(tǒng)的許多紊亂。通常，心血管疾病選自由以下組成 的組:心臟肥大；心肌梗死；中風(fēng);動脈硬化；以及心力衰竭。在一些情況下，心血管疾病與炎 癥相關(guān)，諸如與動脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥。
[0185] 核酸相互作用復(fù)合物的拮抗劑在本發(fā)明的一些方面用作疫苗，所述疫苗用于治療 具有發(fā)展成以下疾病的風(fēng)險的受試者或患有以下疾病的受試者:變態(tài)反應(yīng)或哮喘、感染性 生物的感染或者其中特定癌癥抗原已被鑒定的癌癥。在該情況下，疫苗可以是致耐受性 (tolorigenic)疫苗。這些可以用免疫抑制劑（immunosuppresant)進行施用。它特別用于治 療變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病。核酸相互作用復(fù)合物的拮抗劑還可以在沒有 用于感染、變態(tài)反應(yīng)或癌癥防護的抗原或變應(yīng)原的情況下進行給予，并且在該情況下，重復(fù) 劑量可能允許更長期的防護。本文中使用的具有風(fēng)險的受試者是其具有暴露于引起感染的 病原體或癌癥或變應(yīng)原的風(fēng)險或具有發(fā)展成癌癥的風(fēng)險的受試者。
[0186] 患有感染的受試者是已被暴露于感染性病原體并在體內(nèi)具有急性或慢性可檢測 的病原體水平的受試者。免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸可以被用于降低與感染相關(guān)的免疫應(yīng)答。當(dāng)受 試者具有發(fā)展成膿毒癥(sepsis)的風(fēng)險時，這是特別期望的。本發(fā)明的構(gòu)建體用于預(yù)防與 感染(諸如膿毒癥)相關(guān)的異常(aberrant)應(yīng)答。
[0187] 患有變體反應(yīng)的受試者是患有或者具有發(fā)展成響應(yīng)于變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險 的受試者。變態(tài)反應(yīng)是指對物質(zhì)(變應(yīng)原）的獲得性超敏反應(yīng)。變應(yīng)病況(condi t ion)包括但 不限于濕疹、變應(yīng)性鼻炎或鼻炎(coryza)、花粉癥(hay fever)、結(jié)膜炎、支氣管哮喘、蕁麻 疹(麻疹(hives))和食物變態(tài)反應(yīng)，以及其他特應(yīng)性病況。
[0188] 患有癌癥的受試者是具有可檢測的癌細胞的受試者。特別地，癌癥是與慢性炎癥 相關(guān)的癌癥，例如與由感染引起的炎癥相關(guān)的癌癥或者諸如慢性炎性腸病的病況與大量癌 癥相關(guān)。增加癌癥風(fēng)險或進展的慢性炎癥的一些觸發(fā)器(trigger)包括感染(例如針對胃癌 和粘膜淋巴瘤的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori);分別針對頸部癌和肝癌的乳頭瘤病 毒和肝炎病毒）、自身免疫性疾病(例如針對結(jié)腸癌的炎性腸病)和具有不確定來源的炎性 病況(例如針對前列腺癌的前列腺炎）。本發(fā)明的構(gòu)建體有助于控制慢性炎癥、減少引起或 惡化癌癥的觸發(fā)器。
[0189] 受試者應(yīng)當(dāng)是指人或脊椎動物，包括但不限于狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、火雞、 雞、靈長類動物例如猴、和魚(水產(chǎn)養(yǎng)殖品種)例如鮭魚。因此，本發(fā)明還可以被用于治療非 人受試者中的癌癥和腫瘤、感染和變態(tài)反應(yīng)/哮喘。
[0190] 本文中使用的術(shù)語"治療（treat、treated或treating)"在針對諸如感染性疾病、 癌癥、變態(tài)反應(yīng)或哮喘的紊亂使用時是指預(yù)防性治療(其提高受試者對疾病發(fā)展(例如病原 體的感染)的抗性或者換句話說降低受試者會發(fā)展成疾病(例如變成被病原體感染)的可能 性）以及受試者已經(jīng)發(fā)展成疾病之后為了抵抗疾病(例如降低或消除感染)或防止疾病變得 惡化的治療。
[0191] 本文中使用的抗原是能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的分子?？乖ǖ幌抻诩毎?、細胞提 取物、蛋白質(zhì)、多肽、肽、多糖、多糖綴合物、多糖和其他分子的肽和非肽模擬物、小分子、月旨 質(zhì)、糖脂、糖類、病毒和病毒提取物和多細胞生物諸如寄生物和變應(yīng)原。術(shù)語抗原大致包括 任何類型的分子，其被宿主免疫系統(tǒng)識別為外源的?？乖ǖ幌抻诎┌Y抗原、微生物抗 原和變應(yīng)原。
[0192] 本文中使用的癌癥抗原是與腫瘤或癌細胞表面相關(guān)的化合物(諸如肽或蛋白質(zhì)） 并且當(dāng)在MHC分子中的抗原提呈細胞的表面上表達時其能夠激發(fā)免疫應(yīng)答。癌癥抗原可以 通過以下方法從癌癥細胞制備:通過例如Cohen等人，1994，Cancer Research，54:1055中所 述的制備癌細胞的粗提物、通過部分純化抗原、通過重組技術(shù)或者通過已知抗原的從頭合 成。癌癥抗原包括但不限于重組表達的抗原、整個腫瘤或癌癥或其免疫原性部分。這樣的抗 原可以被分離或重組制備或通過本領(lǐng)域已知的任何其他手段制備。
[0193] 本文中使用的微生物抗原是微生物的抗原并且包括但不限于病毒、細菌、寄生物 和真菌。這樣的抗原包括完整的微生物以及其天然分離物和片段或衍生物，以及還包括與 天然微生物抗原相同或相似并誘導(dǎo)特異性針對該微生物的免疫應(yīng)答的合成的化合物。如果 化合物誘導(dǎo)對天然微生物抗原的免疫應(yīng)答(體液的和/或細胞的），那么該化合物類似于天 然微生物抗原。這樣的抗原被常規(guī)用于本領(lǐng)域并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所眾所周知的。
[0194] 變應(yīng)原是指能夠誘導(dǎo)易感受試者中變態(tài)反應(yīng)性或哮喘性應(yīng)答的物質(zhì)(抗原）。變應(yīng) 原的列表是巨大的并可以包括花粉、昆蟲毒液、動物皮肩塵、真菌孢子和藥物（例如青霉 素）。天然的、動物的和植物的變應(yīng)原的實例包括但不限于特異性針對以下屬的蛋白質(zhì):犬 (Canine)(家犬（Cani s familiar is));塵螨屬（Dermatophago i des )(例如粉塵螨 (Dermatophagoides farinae));貓屬（Felis)(家貓（Felis domesticus)); Ambrosia (Ambrosia artemiisfoIia);黑麥草屬（Lolium)(例如多年生黑麥草(LoIium perenne)或 多花黑麥草（Lol ium mult if Iorum));柳杉屬（Cryptomeria)(日本柳杉（Cryptomeria japonica));鏈格抱屬(Alternaria)(鏈格抱(Alternaria alternata));樺木(Aider);梢 木屬（Alnus)(歐洲梢木（Alnus gu Itinoasa));樺木屬（Betula)(垂枝樺（Betula verrucosa));櫟屬（Quercus)(美洲白櫟（Quercus alba));木犀欖屬（Olea)(橄欖（Olea europa));蒿屬(Artemisia)(北艾(Artemisia vulgaris));車前屬（Plantago)(例如長葉 車前（Plantago Ianceolata));墻草屬（Parietaria)(例如Parietaria off icinalis或 Parietaria judaica);小臟（Blattella)(例如德國小臟（Blattella germanica));蜜蜂 (Apis)(例如Apis mult if Iorum);桕木屬（Cupressus)(例如地中海桕木（Cupressus sempervirens)、綠干桕（Cupressus arizonica)和大果桕木（Cupressus macrocarpa));刺 桕屬（Juniperus)(例如Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、