溶液,蓋上柱子管蓋，室溫孵育2min ;
[0050] (7) 12000rpm離心2min,將溶液重新吸入柱子再離心，棄掉柱子，蓋緊管蓋。
[0051] 4.末端修復(fù)
[0052] (61)
[0053] 調(diào)槍至100 μ 1,上下吹打10次混勻，蓋緊管蓋；
[0054] 將PCR管放入30°C的PCR儀中，蓋緊熱蓋，孵育30min。
[0055] (2) AMPure XP Beads 純化
[0056] a將AMPure XP Beads震蕩均勻，取160 μ 1至產(chǎn)物PCR管中，調(diào)槍至200 μ 1，上下 吹打10次混勻，室溫孵育15min ;
[0057] b將PCR管置磁力架上，室溫孵育15min，珠子吸附成團(tuán)，溶液變透明，用槍將上清 液移去，不要碰到珠子；
[0058] c加入200 μ 1 80%的乙醇，室溫孵育30s，棄掉廢液；
[0059] d重復(fù)步驟c 一次；
[0060] e保持PCR管在磁力架上，室溫孵育10-15min，觀察到珠子有裂紋后，將PCR管取 下；
[0061] f加入17. 5 μ 1 Resuspension Buffer,用槍上下吹打10次混勻，蓋好管蓋，室溫 孵育2min ;
[0062] g將PCR管置于磁力架上，室溫孵育5min，溶液變透明；
[0063] h轉(zhuǎn)移15 μ 1上清液至新PCR管中（_20°C保存過夜或進(jìn)行下一步驟）。
[0064] 5. 3,端加 A
[0065] 準(zhǔn)備：A-Tailing Control、A_Tailing Mix、Resuspension Buffer置于冰上解凍； 0. 3ml PCR 管，設(shè)置 37 °C PCR 恒溫。
[0066]
[0067] 調(diào)槍至30 μ 1，上下吹打10次混勻，蓋緊管蓋；
[0068] 將PCR管放入37°C的PCR儀中，蓋緊熱蓋，孵育30min，取出后立即進(jìn)行下一步驟。
[0069] 6.接頭連接
[0070] (1)
[0071] 調(diào)槍至37. 5 μ 1，上下吹打10次混勻，蓋緊管蓋；
[0072] 將PCR管放入30°C的PCR儀中，蓋緊熱蓋，孵育lOmin取出；
[0073] 加入 5μ 1 Stop Ligation Buffer,調(diào)槍至 42. 5μ 1，上下吹打 10 次混勻。
[0074] (2)AMPure XP Beads 一次純化
[0075] a將AMPure XP Beads震蕩均勻，取42. 5μ 1至產(chǎn)物PCR管中，調(diào)槍至85μ 1，上下 吹打10次混勻，室溫孵育15min ;
[0076] b將PCR管置磁力架上，室溫孵育15min，珠子吸附成團(tuán)，溶液變透明，用槍將上清 液移去，不要碰到珠子；
[0077] c加入200μ 1 80%的乙醇，室溫孵育30s，棄掉廢液；
[0078] d重復(fù)步驟c 一次；
[0079] e保持PCR管在磁力架上，室溫孵育10-15min，觀察到珠子有裂紋后，將PCR管取 下；
[0080] f加入52. 5 μ IResuspension Buffer,用槍上下吹打10次混勻，蓋好管蓋，室溫孵 育 2min ;
[0081] g將PCR管置于磁力架上，室溫孵育5min，溶液變透明；
[0082] h轉(zhuǎn)移50 μ 1上清液至新PCR管中。
[0083] (3) AMPure XP Beads 二次純化
[0084] a將AMPure XP Beads震蕩均勻，取50 μ 1至一次純化產(chǎn)物PCR管中，調(diào)槍至 100 μ 1,上下吹打10次混勻，室溫孵育15min ;
[0085] b將PCR管置磁力架上，室溫孵育15min，珠子吸附成團(tuán)，溶液變透明，用槍將上清 液移去，不要碰到珠子；
[0086] c加入200 μ 1 80%的乙醇，室溫孵育30s，棄掉廢液；
[0087] d重復(fù)步驟c 一次；
[0088] e保持PCR管在磁力架上，室溫孵育10_15min，觀察到珠子有裂紋后，將PCR管取 下；
[0089] f加入22. 5 μ IResuspension Buffer,用槍上下吹打10次混勻，蓋好管蓋，室溫孵 育 2min ;
[0090] g將PCR管置于磁力架上，室溫孵育5min，溶液變透明；
[0091] h轉(zhuǎn)移20 μ 1上清液至新PCR管中（-20°C保存過夜或進(jìn)行下一步驟）。
[0092] 7.凝膠回收（片段選擇）
[0093] 準(zhǔn)備：2%瓊脂糖凝膠、100bp DNA Marker、6XLoding Buffer、EP 管、凝膠純化試 劑盒。
[0094] (1)加4 μ 1 6XLoding Buffer到含有接頭連接產(chǎn)物的PCR管中，震蕩混勻；
[0095] (2)將24 μ 1樣品加入2%凝膠點(diǎn)樣孔中，并點(diǎn)入5-10 μ 1 100bp DNA Marker， 120V電泳60min左右。
[0096] (3)電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，保存至項(xiàng)目文件夾中；
[0097] (4)在紫外燈下切膠，選擇300-450bp的范圍，轉(zhuǎn)入1. 7ml EP管中，稱重；
[0098] (5)加入3個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A溶液（100mg = 100 μ 1)置70°C干式加熱 器中融化膠塊；
[0099] (6)加入0· 5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B溶液，混勻后轉(zhuǎn)入2ml收集管上 的過濾柱中（每次不超過700 μ 1)，DNA片段< 400bp，加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇，震蕩混 勻；
[0100] (7) lOOOOrpm離心lmin，棄收集管中的廢液；
[0101] (8)加入500 μ 1 W1溶液至柱子中，lOOOOrpm離心lmin，棄去廢液；
[0102] (9)加入700 μ 1 W2溶液至柱子中，lOOOOrpm離心lmin，棄去廢液；
[0103] (10)重復(fù)步驟（9) 一次；
[0104] (11) 12000rpm 空離 2min ;
[0105] (12)將柱子放入新的1. 7ml EP管中，打開管蓋，室溫晾3min ;
[0106] (13)加入30 μ 1 Elute溶液，蓋緊管蓋，室溫孵育2min ;
[0107] (14) 12000rpm離心2min，將液體重新吸入柱子，再離心一次，棄去柱子，蓋緊管 蓋。
[0108] (15)取3 μ 1回收樣品加1 μ 1 6XLoding Buffer混勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中， 點(diǎn)3 μ 1 2000bp Marker，120V電泳20min，在成像系統(tǒng)拍照保存，剩余樣品在-20°C保存或 進(jìn)行下一步驟。
[0109] 8.鹽處理
[0110] (1)鹽處理試劑按下表混合后震蕩混勻，稍離心；
[0111]
[0112] DNA solution 和 RNase-free water 的總體積是 20 μ 1。
[0113] (2)放入PCR儀中，鹽處理?xiàng)l件見下表：
[0114]
[0115] 9.純化
[0116] (1)從PCR儀取出鹽處理后的產(chǎn)物，稍離心，轉(zhuǎn)入新的1. 5ml EP管中；
[0117] (2)加入 310 μ 1 含有 RNase-free-water-carrier RNA 的 Buffer BL，震蕩離心；
[0118] (3)加入 250 μ 1 酒精（96% -100% )，震蕩 15s，稍離心；
[0119] (4)將液體轉(zhuǎn)入EpiTect吸附柱中，最大轉(zhuǎn)速離心lmin，棄掉廢液，柱子放回收集 管中；
[0120] (5)加入500 μ 1已加入乙醇的Buffer BW，最大轉(zhuǎn)速離心lmin,棄掉廢液；（6)加 入500μ1已加入乙醇的Buffer BD,蓋好蓋子，室溫孵育20min，最大轉(zhuǎn)速離心lmin,棄掉 廢液；
[0121] (7)加入500 μ 1已加入乙醇的Buffer BW，最大轉(zhuǎn)速離心lmin,棄掉廢液；
[0122] (8)重復(fù)步驟（7) -次；
[0123] (9)將吸附柱放入新的2ml收集管中，最大轉(zhuǎn)速離心lmin ;
[0124] (10)將吸附柱放入新的1. 5ml EP管中，打開蓋子，56°C孵育5min ;
[0125] (11)將吸附柱放入新的1. 5ml EP管中，加入20 μ 1 Buffer EB, 12000rpm離心 lmin ；
[0126] (12)再加入20μ lBuffer EB,最大轉(zhuǎn)速離心lmin,棄掉柱子；