一種應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的pcr擴(kuò)增體系及文庫(kù)構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序 技術(shù)中的PCR擴(kuò)增體系及文庫(kù)構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化修飾是一種基因表達(dá)調(diào)控的重要手段，對(duì)個(gè)體的正常發(fā)育起至關(guān)重要 的作用，若甲基化調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)問題，可使機(jī)體功能發(fā)生異常，導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，因此 DNA甲基化的檢測(cè)對(duì)一些基因相關(guān)疾病的研究具有重要意義。DNA甲基化主要發(fā)生于GC含 量較高的CpG島。甲基化測(cè)序的方法有很多種，如全基因組甲基化測(cè)序，甲基化DNA免疫共 沉淀測(cè)序，甲基結(jié)合蛋白測(cè)序，簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序等。
[0003] 重亞硫酸鹽測(cè)序（Bisulfite-Seq)即是將Bisulfite處理與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié) 合，從而來(lái)繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，用于研究特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型 之間的關(guān)聯(lián)，為疾病發(fā)生、治療相關(guān)的研究提供研究基礎(chǔ)。通過全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序 (WGBS)可以檢測(cè)甲基化狀態(tài)：DNA樣品經(jīng)重亞硫酸氫鹽處理后，非甲基化的胞嘧啶（C)轉(zhuǎn)化 為尿嘧啶（U)，甲基化的胞嘧啶保持不變；鹽處理的DNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后，尿嘧啶（U)全 部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T);對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并與未處理的序列比對(duì)，檢測(cè)甲基化的位點(diǎn)
[0004] 在重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建過程中，目的片段經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，需進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。但是，按照目前常規(guī)方法，經(jīng)鹽處理后大部分的DNA已破壞，純化后的DNA濃度已經(jīng)很 低，經(jīng)分裝每管的DNA濃度更低，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物少，甚至達(dá)不到2100檢測(cè)濃度的最低要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種應(yīng)用于重亞硫酸鹽測(cè)序的PCR擴(kuò)增體系，通過對(duì) 體系組成的改變，提高PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物濃度，為測(cè)序提供足夠的上機(jī)量。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種應(yīng)用于重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建方法，該文 庫(kù)構(gòu)建方法包含了利用上述的PCR擴(kuò)增體系對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增的步驟，使所構(gòu)建的文庫(kù) 達(dá)到上機(jī)測(cè)序量的要求。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽 測(cè)序的PCR擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系包含下述組份：
[0008] 超純水19μ 1 ;DNA模板15μ 1 ;反應(yīng)緩沖液5μ 1 ;上游引物2. 5μ 1 ;下游引物 2. 5 μ 1 ;2· 5mM dNTP 5 μ 1 ;熱啟動(dòng) DNA 聚合酶 1 μ 1〇
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的PCR擴(kuò)增 體系中，反應(yīng)緩沖液為Pfu Turbo Cx反應(yīng)緩沖液，熱啟動(dòng)DNA聚合酶為Pfu Turbo Cx熱啟 動(dòng)DNA聚合酶。
[0010] 本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的上述應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的PCR擴(kuò)增體 系，相對(duì)于常規(guī)的重亞硫酸鹽測(cè)序的PCR擴(kuò)增體系，在反應(yīng)體系組成的成分配比上進(jìn)行了 改變，將該種體系用于重亞硫酸鹽測(cè)序過程中對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)提高PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物的濃度的目的。
[0011] 本發(fā)明的實(shí)施方式還提供了一種應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建方 法，該方法包含下述步驟：
[0012] (1)將待測(cè)基因組DNA樣品片段化，然后對(duì)DNA片段進(jìn)行純化；
[0013] (2)將所述DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，得到經(jīng)末端修復(fù)的DNA片段；
[0014] (3)在所述經(jīng)末端修復(fù)的DNA片段的3'端添加堿基A，得到具有甲基化接頭的連 接產(chǎn)物；
[0015] (4)對(duì)所述具有甲基化接頭的連接產(chǎn)物進(jìn)行片段選擇，回收目的片段；
[0016] (5)將所述目的片段進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，得到鹽處理后的目的片段；
[0017] (6)對(duì)所述鹽處理后的目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物：
[0018] 其中，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系包含下述組份：
[0019] 超純水19μ 1 ;DNA模板15μ 1 ;反應(yīng)緩沖液5μ 1 ;上游引物2. 5μ 1 ;下游引物 2. 5 μ 1 ;2· 5mM dNTP 5 μ 1 ;熱啟動(dòng) DNA 聚合酶 1 μ 1 ;
[0020] (7)分離純化所述擴(kuò)增產(chǎn)物，得到全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序文庫(kù)。
[0021] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu) 建方法中，步驟（1)中的待測(cè)基因組DNA樣品的用量為5 μ g以上，且待測(cè)基因組DNA來(lái)源 于細(xì)菌或病毒。
[0022] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu) 建方法中，步驟（1)中將待測(cè)基因組DNA樣品片段化時(shí)，采用超聲打斷儀對(duì)待測(cè)基因組DNA 進(jìn)行打斷。
[0023] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu) 建方法中，步驟（4)中采用2%的瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)具有甲基化接頭的連接產(chǎn)物進(jìn) 行片段選擇。
[0024] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu) 建方法中，步驟（6)中對(duì)鹽處理后的目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C5 分鐘；98°C 30秒；以98°C 10秒、65°C 30秒、72°C 30秒為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行12個(gè)循環(huán)；72°C 5 分鐘；最后在4 C下保存。
[0025] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu) 建方法中，步驟（7)中采用磁珠法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。
[0026] 此外，在本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建 方法中，所述的全重亞硫酸鹽測(cè)序?yàn)椴捎酶咄繙y(cè)序儀進(jìn)行的測(cè)序。
[0027] 本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的上述應(yīng)用于全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建方 法中，由于使用了改進(jìn)的PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行對(duì)目的片段的PCR擴(kuò)增，達(dá)到了以下效果：（1) 使擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物量有了明顯的增加，用2100芯片進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到上機(jī)測(cè)序的要求；（2) 只用一個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增，減少了擴(kuò)增反應(yīng)中所用到的試劑的消耗量； (3)為后續(xù)純化步驟減少工作量，很大程度上提高了工作效率。
【附圖說明】
[0028] 圖1是實(shí)施例1中對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的凝膠電泳圖；
[0029] 圖2是對(duì)比實(shí)驗(yàn)例中采用常規(guī)方法對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的凝膠電泳 圖；
[0030] 圖3是用2100芯片對(duì)實(shí)施例1制備得到的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0031] 圖4是用2100芯片對(duì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)例中采用常規(guī)方法制備得到的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè) 的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的各實(shí) 施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實(shí)施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請(qǐng)而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基 于以下各實(shí)施方式的種種變化和修改，也可以實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方 案。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 本實(shí)施例所使用的試劑、試劑盒：
[0035] (1)安捷倫（Agilent):高保真 CX 熱啟動(dòng) DNA 聚合酶（Pfu Turbo cx Hotstart DNA Polymerase)
[0036] (2)德國(guó)凱杰（QIAGEN):亞硫酸氫鹽處理試劑盒（EpiTect Bisulfite Kit)
[0037] (3) Illumine DNA 建庫(kù)試劑盒（TruSeq DNA Sample Preparation Low Throughput (LT)Kit)
[0038] 1. DNA起始量定量
[0039] 注：本試驗(yàn)所使用的DNA起始量為5 μ g。
[0040] 2 · DNA 片段化
[0041] (1)提前將超聲打斷儀打開降溫至6°C以下；
[0042] (2) DNA樣品（虎紋蛙病毒（TFV) DNA)用1 X TE稀釋至130 μ 1，用槍吹打混勻，轉(zhuǎn) 移全部溶液至潔凈干燥霧化杯中，打斷至200bp。
[0043] 3. DNA片段的純化
[0044] (1)在片段化的DNA中加入3倍體積的PCR-A溶液，混勻轉(zhuǎn)入純化柱每次最多 700 μ 1，lOOOOrpm 離心 lmin,棄掉廢液；
[0045] (2)加入 700 μ 1 W2 溶液，lOOOOrpm 離心 lmin,棄掉廢液；
[0046] (3)重復(fù)一次步驟（2);
[0047] (4) 12000rpm 空離 2min ;
[0048] (5)打開管蓋室溫晾3min后，將柱子轉(zhuǎn)到一個(gè)新的1. 5ml管上；
[0049] (6)加入55 μ 1 Elute