9] 本發(fā)明提供另一種毛酸漿內(nèi)酯的快速制備方法，其包括以下操作步驟：
[0020] 1)將毛酸漿全草用提取溶劑回流提取，得到提取液;所述的毛酸漿全草包括毛酸 漿的根、莖、葉、花及果實；所述的提取溶劑為醇或者體積百分數(shù)40~100%，優(yōu)選為50~ 99%的醇的水溶液;所述的醇為甲醇或乙醇;所述的提取液每次加入量相對于毛酸漿全草 重量的5~10倍，在40~100°C回流提取1~5次，每次1~5小時；
[0021] 2)將步驟1)中得到的提取液濃縮，用水分散后用小極性有機溶劑萃取萃取一次或 多次，除去小極性雜質(zhì);所述的小極性有機溶劑為石油醚、正己烷、環(huán)己烷中的任一種；
[0022] 3)將步驟2)中剩余水層部分通過大孔吸附樹脂吸附，并用乙醇和水組成的洗脫體 系梯度洗脫得含毛酸漿內(nèi)酯混合組分;所述大孔吸附樹脂型號可選48-8、0101、01130^05_ 17、冊0-100、冊0-300、冊0-600中的任一種;所說的乙醇-水組成的洗脫體系為梯度洗脫，洗 脫梯度具體為:先用3-10倍體積40~50 %乙醇水溶液洗脫得雜質(zhì)部分，再用3-10倍體積60 ~90%乙醇水溶液洗脫得含毛酸漿內(nèi)酯的第二混合組分;將得到的含毛酸漿內(nèi)酯的第二混 合組分，采用柱色譜分離，經(jīng)過甲醇和水組成的洗脫體系梯度洗脫，以薄層色譜行為為指 導，快速鎖定含有毛酸漿內(nèi)酯的單一組分;所述的柱色譜所用的填料為十八烷基硅烷鍵合 硅膠RP_C 18，所述的含毛酸漿內(nèi)酯組分與填料的重量比為1:20~1:50;所述的甲醇和水組成 的洗脫體系為梯度洗脫，洗脫梯度為:先用30~40%甲醇-水溶液洗脫，再用50~60%甲醇-水溶液洗脫;最后用90~100 %，優(yōu)選為91~99 %甲醇-水溶液洗脫；
[0023] 4)將步驟3)中得到的含有毛酸漿內(nèi)酯的單一組分，采用制備高效液相色譜法，經(jīng) 甲醇和水組成的洗脫體系洗脫濃縮，得到純度較高的毛酸漿內(nèi)酯;所述的制備液相色譜柱 填料為RP- Cl8;此步驟的洗脫體系為含甲醇體積百分數(shù)50~80%的甲醇-水溶液。最后得到 高純度、單一的毛酸漿內(nèi)酯。
[0024] 另外，本發(fā)明公開了毛酸漿內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0025]具體的，所述腫瘤可以包括腎癌、人前列腺癌、人膀胱癌、人纖維肉瘤、人黑色素 瘤、人肝癌、人宮頸鱗癌、人子宮癌、人肺腺癌、人組織細胞淋巴瘤、人結(jié)腸癌、人表皮癌、人 乳腺癌、人白血病或人喉鱗癌。
[0026]本發(fā)明還公開了毛酸漿內(nèi)酯體外可誘導兩種前列腺癌腫瘤細胞C42B、22RV1和六 種腎癌細胞786-0、4-498、0&1^-2、4〇^、轉(zhuǎn)染了￥此的1??：4(1?〇：4-￥!1)、轉(zhuǎn)染了空載體的 RCC4(RCC4-Vector)產(chǎn)生生長抑制作用。將裸鼠皮下接種腎癌細胞786-0,以50mg/kg毛酸漿 內(nèi)酯灌胃，毛酸漿內(nèi)酯表現(xiàn)出明顯的腫瘤生長抑制作用。在毛酸漿內(nèi)酯處理后的786-0細胞 中，外源性凋亡通路相關前體蛋白procaspase-3，procaspase-8，PARP均發(fā)生了明顯變化， procaspase-3和。1'〇〇&8。&86-8裂解為活性形式〇&8口&86-3和〇&8口&86-8，誘導下游革[11蛋白 DNA修復酶PARP裂解。同時，HIF2a表達下降，DR3、DR5、CHOP表達升高。因此，毛酸漿內(nèi)酯可以 抑制HIF2a的表達，同時可以上調(diào)CHOP的表達，CHOP作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)死亡受體DR5促進凋 亡的發(fā)生。且TRAIL和毛酸漿內(nèi)酯協(xié)同作用于786-0細胞后，與二者分別單獨給予786-0細胞 時相比，發(fā)現(xiàn)二者協(xié)同作用可明顯使caspase家族相關前體蛋白procaspase 3被剪切，成為 具活性的caspase 3,進而影響下游的PARP蛋白，誘導細胞發(fā)生凋亡。
[0027] 由上述可知，毛酸漿內(nèi)酯可以與TRAIL共同應用于抗腫瘤藥物的制備?；诖?，本 發(fā)明還提供了一種組合物，其可以包含由上述的方法所制備的毛酸漿內(nèi)酯和/或TRAIL，和/ 或藥學上可接受的賦形劑。
[0028] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，上述的組合物可以配制為散劑、片劑、膠囊劑、 丸劑、栓劑、滴丸劑、腸溶劑、注射劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑或酊劑中的任意一種劑型。
【附圖說明】
[0029] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030] 圖1為制備得到的毛酸漿內(nèi)酯的液相分析色譜圖；
[0031 ]圖2為使用快速制備方法得到的毛酸漿內(nèi)酯的液相分析色譜圖；
[0032]圖3為毛酸漿內(nèi)酯體外對八種腫瘤細胞的生長抑制作用；
[0033]圖4A、圖4B、圖4C為毛酸漿內(nèi)酯體內(nèi)對荷瘤(786-0)裸鼠腫瘤生長抑制作用和體重 的影響；
[0034]圖5為毛酸漿內(nèi)酯體外可誘導786-0細胞發(fā)生凋亡；
[0035]圖6為毛酸漿內(nèi)酯體外誘導786-0細胞發(fā)生凋亡相關蛋白的表達；
[0036] 圖7為毛酸漿內(nèi)酯體外誘導786-0細胞中HIF2a、DR3、DR5、CHOP表達發(fā)生變化；
[0037]圖8A、圖8B為毛酸漿內(nèi)酯與TRAIL在體外發(fā)揮協(xié)同作用誘導細胞發(fā)生凋亡。
【具體實施方式】
[0038]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0039] 本發(fā)明可通過下面的實施例加以說明。
[0040] 實施例1:毛酸漿內(nèi)酯標準品的分離制備
[0041] 1實驗方法
[0042] 將毛酸漿干燥莖葉剪切為1~2cm片段，取lkg置于提取罐中，加入10L體積分數(shù) 75%乙醇-水溶液，加熱回流提取3次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮，加水分散至1L，用 等體積石油醚萃取3次除去小極性雜質(zhì)，再用等體積乙酸乙酯萃取3次，將乙酸乙酯萃取液 濃縮，得浸膏9.5g。所得浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(體積比：100:1，70:1， 50:1，20:1，10:1，1:1)梯度洗脫，以薄層色譜行為為指導，快速鎖定含有毛酸漿內(nèi)酯的混合 組分(E3);將E3采用制備高效液相色譜法，以體積分數(shù)60 %甲醇-水溶劑洗脫，得到純度較 高的毛酸衆(zhòng)內(nèi)酯（198mg)。
[0043] 2實驗結(jié)果
[0044]毛酸漿內(nèi)酯高效液相色譜檢驗純度的液相圖譜如圖1所示，出峰時間7.06分鐘，純 度為97.4%(YMC-Triart Cis 5ym，250X4.6mm;80% 甲醇-水;0.6mL/分鐘）。
[0045] 所得毛酸漿內(nèi)酯為白色粉末(MeOH)，核磁數(shù)據(jù)如下JH-NMIKCD·，300MHz) :δ6.15 (lH，d，J = 9.9Hz，H-2)，7.04(lH，dd，J = 9.9,6.2Hz，H-3)，3.64(lH，d，J = 6.2Hz，H-4)，3.14 (lH,brs,H-6),2.02(lH,dd,J=15.0,4.1Hz,H-7),1.41(lH,m,H-7),1.65(lH,m,H-8),0.99 (lH,td,J=11.5,4.1Hz,H-9)a.83(lH,m,H-ll)a.39(lH,m,H-ll)a.l6(lH,m,H-12), l. 85(lH,dt,J=12.0,3.6Hz,H-12)a.21(lH,m,H-14) ,4.75(lH,td,J=10.0,3.0Hz,H-15)a.49(lH,m,H-16)a.99(lH,m,H-16)a.23(lH,m,H-17)a.37(3H,s,H-19)a.71(lH, m, H-20),0.87(3H,d,J=6.6Hz,H-21),3.77(lH,m,H-22),1.76(lH,m,H-23),1.64(lH,dd,J = 14.0,11.4Hz,H-23),4.98(lH,s,H-26)a.33(3H,s,H-27)a.34(3H,s,H-28)a.99(3H, s，J^C0)</ 3C-NMR(CD30D，75MHz):S202.3(C-1)，132.0(C-2)，142.1(C-3)，69.8(C-4)，63.6 (C-5)，62.7