一種新的羊毛甾烷型三萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從訶子的干燥成熟果實中分離得到的一種具 有治療腎癌作用的羊毛留烷型三萜化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 訶子為使君子科植物訶子(Terminalia chebula Retz.)或絨毛訶子(Terminalia chebula Retz · var · tomentella kurt)的干燥成熟果實。秋、冬二季果實成熟時采收，除去 雜質(zhì)，曬干。用時打碎。原產(chǎn)于印度、緬甸等地，我國云南、西藏、廣東、廣西等地也有分布。其 味苦、酸、澀，性平，歸肺、大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽之功效。訶子在我國民 間用藥極其廣泛，在藏藥中甚至被視為"藥中之王"，用于多種疾病的治療。
[0003] 訶子所含的化學(xué)成分豐富多樣，主要包括鞣質(zhì)類、酚酸類、三萜類、黃酮類、揮發(fā)油 等成分。其中有部分研究提示訶子中的酚酸類、三萜類以及黃酮類化合物是訶子發(fā)揮藥理 活性的主要有效組分。
[0004] 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其提取物具有抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛 等多種藥理活性。此外，訶子還具有抗膽堿酯酶活性、抗胃潰瘍、抑制細(xì)胞色素 P450酶等生 物活性。訶子在我國資源豐富，在治療、預(yù)防疾病以及食品開發(fā)等諸方面都具有廣闊的應(yīng)用 前景和開發(fā)價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從訶子的干燥成熟果實中分離得到的一種具有治療腎 癌作用的羊毛留烷型三萜化合物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)訶子的干燥成熟果實粉碎， 用75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫12個柱 體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫 物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、30:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、 15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進一步地，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0012] -種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I)和 藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實驗ECD值比較。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0021 ]實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0022] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0023] 訶子經(jīng)鑒定為使君子科植物訶子(Terminalia chebulaRetz.)的干燥成熟果實。 [0024]制備方法：（a)將訶子的干燥成熟果實(8kg)粉碎，用80 %乙醇熱回流提取(25L X 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(363g)和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積， 再用75%乙醇洗脫12個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏 (145g);(c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個柱體 積）、50:1 (8個柱體積）、30:1 (6個柱體積）、15 :1 (8個柱體積)和1:1 (5個柱體積）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(47g)用正相硅膠進一步分離，依次用 體積比為20:1(8個柱體積）、15:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2(26g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純 的化合物（I)(39mg)。
[0025] 結(jié)構(gòu)確證:無色粉末;冊43頂3顯示[]\?^]+為111/2 475.3224，結(jié)合核磁特征可得 分子式為C3qH44〇3，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ΡΡπι，DMS〇-d 6，500MHz): H-1 (2 · 06， d)，H-l(2.29，d)，H-3(2.17，m)，H-3(2.41，m)，H-5(1.55，dd，J=14.0,3.5)，H-6(1.84，m)， H-6(2.06，m)，H-7(1.85，m)，H-7(1.97，m)，H-ll(1.28，m)，H-ll(1.54，m)，H-12(1.46，m)，H-12(2.01，m)，H-15(1.27，m)，H-15(1.66，m)，H-16(1.74，m)，H-16(1.89，m)，H-17(1.45，m)， H-18(0.72，s)，H-19(1.08，s)，H-20(1.67，m)，H-21(0.98，d，J=6.4)，H-22(1.29，m)，H-22 (1.43，m)，H-23(4.91，ddd，J = 11.0,2.5，1.5)，H-24(6.92，d，J=1.5)，H-27(1.85，s)，H-28 (1 · 01，s)，H-29(0 · 85，s)，H-30(1 · 02，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 52 · 2 (CH2，1-C)，209.7(C，2-C)，56.1(CH2,3-C)，38.9(C，4-C)，50.7(CH，5-C)，19.1(CH 2,6-C)， 25.8(CH2,7-C)，134.6(C，8-C)，132.8(C，9-C)，36.3(C，10-C)，20.5(CH2，n-C)，30.3(CH2， 12-C)，44.2(C，13-C)，49.5(C，14-C)，30.5(CH2，15-C)，28.5(CH2，16-C)，50.4(CH，17-C)， 15.7(CH 3，18-C)，18.4(CH3，19-C)，33.2(CH，20-C)，18.3(CH3,21-C)，40.3(CH2,22-C)，78.5 (CH，23-C)，149.3(CH，24-C)，129.2(C，25-C)，174.1(C，26-C)，10.3(CH 3,27-C)，25.7(CH3， 28-C)，20.8(CH3，29-C)，23.7(CH 3，30-C);碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外光譜表明該化合物含有 α，β-不飽和-γ -內(nèi)酯（1741 cm-1)，羰基（1698cm-1)以及烯烴（1646cm-1)。咕和 13C NMR譜顯示 出一個 4-取代的-2-甲基-2-丁烯酸內(nèi)酯環(huán)RH1.85(s)，4.91(ddd，J=11.0,2.5，1.5Hz)， 6.92(d，J=1.5Hz) ;δα〇·3(027)，78.5(023)，129.2(025)，149.3(C-24)和 174.1(C-26)]，一個四取代雙鍵[6(：132.8((：-9)，134.6((：-8)]，一個羰基[60209.7((：-2)]，五個單峰 甲基[δΗ0·72,0·85,1.01，1.02,1.08,3H，s]，一個雙峰甲基[SH0.98(d，J = 6.4Hz)]，以及九 個亞甲基。上述側(cè)鏈結(jié)構(gòu)表明該化合物為羊毛留烷型三萜化合物，HMBC譜中Me-27與C-24， C-25和C-26，Me-21 與C-17，C-20和C-22,以及H-24與C-22，C-23和Me-27的相關(guān)性驗證了上 述推論。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定 該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。 [0026]實施例2:化合物(I)藥理作用試驗 [0027] 一、材料和儀器
[0028]人腎癌RC-2細(xì)胞株購于ATCC細(xì)胞庫(美國）。分析純蔗糖購于國藥集團化學(xué)試劑公 司。重水(D20)購于青島騰龍微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺單體、1'冊61120購 于重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所實驗室。小牛血清、RPMI-1640購于美國Gibco公司。Centriplus 離心超濾管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（100kD)、PVDF膜購于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海安亭科學(xué)儀器廠。5 X SDS-PAGE蛋白質(zhì) 上樣緩沖液、BeyoECL熒光檢測試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、考馬斯亮藍(lán)R250購于碧云天生物技 術(shù)研究所?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人批？70單克隆抗體、兔抗人 ICAM-1單克隆抗體、兔抗人G250多克隆抗體購于Sigma公司。兔抗