毛酸漿內(nèi)酯的制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及毛酸漿內(nèi)酯的制備方法及其在制備抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤(通稱癌癥）是當前危害人類生命健康的重要疾病之一。近20年來，在世 界范圍內(nèi)或中國范圍內(nèi)，腫瘤的發(fā)病率與死亡率均呈上升的趨勢。據(jù)WHO統(tǒng)計，2012年世界 癌癥報告顯示，每年癌癥新發(fā)病例約1400萬，死亡約800萬。我國每年新發(fā)癌癥病例約337 萬，死亡約211萬。癌癥已成為我國死亡第一大原因，死亡人數(shù)占全球癌癥死亡人數(shù)四分之 〇
[0003]腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)簡稱腎癌，是源于腎實質(zhì)的泌尿系統(tǒng)最常 見的惡性腫瘤之一，占成人腎臟惡性腫瘤的80%，居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第二位(CA Cancer J Cl in，2007，57 (1 )，43-66 )，僅次于膀胱癌，每年全世界約9.5萬人死于腎癌(Expert Rev Anticancer Ther，2008,8(1) ,63-73)。近年來，隨著生活方式的改變及人口老齡化問題的 出現(xiàn)，我國RCC的發(fā)病率有逐年上升的趨勢（中華泌尿外科雜志，2013,30(8) ,511-514)。腎 癌起源于腎臟的腎小管或集合管的上皮細胞，具有不同的病理類型，大多數(shù)腎癌是透明細 胞腎細胞癌（占70%-80%)。
[0004] 腎癌發(fā)生、發(fā)展過程是一個復(fù)雜的分子生物學(xué)過程，其中抑癌基因的失活起到重 要的作用。人類的VHL基因為抑癌基因，有抑制腫瘤生長及浸潤的作用，該基因的缺失會導(dǎo) 致正常的VHL蛋白合成障礙，是家族性腎癌的重要誘發(fā)因素，而且80%的散發(fā)性腎透明細胞 癌存在VHL基因的缺失或突變(J Clin Oncol, 2005,23,63-71) JHL基因可以調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo) 因子1 (hypoxia-inducible factor 1，HIF_1)和低氧誘導(dǎo)因子2(hypoxia-inducible factor 2，HIF-2)的表達，調(diào)節(jié)機體對缺氧的適應(yīng)反應(yīng)。VHL基因表達的蛋白pVHL缺失會所 致腎癌細胞HIF-α高表達，進而發(fā)揮促癌的作用，其與腎癌的生物學(xué)進程密切相關(guān)。突變及 缺失導(dǎo)致的VHL抑癌基因失活會導(dǎo)致缺氧引起HIF-α及HIF-β的上調(diào)（Oncogene，2000，19 (48) ,5435-5443)，并進一步引起VEGF(Cancer, 2002,95(1) ,47-53)和roGF(Am J Clin Pathol，2003，120(1)，107-112)的過表達，下游區(qū)的受體酪氨酸激酶通過結(jié)合特異性受體 被激活，導(dǎo)致細胞增殖、生長和血管生成。進一步通過Ras/Raf/MEK/Rrk信號傳導(dǎo)通路及 PI3K/Akt/mT0R信號傳導(dǎo)通路促進了腫瘤血管形成及相關(guān)信號傳導(dǎo)，促進腫瘤血管形成，進 而促進腎癌的發(fā)生及發(fā)展(Mol Cell Biol ,2002,22(20)，7004-7014;Cancer Biol Ther 2003,2(4Suppll)，S169-177)。以上研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子HIF的過度表達在惡性腫瘤的 發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要的角色。因此，以其為靶點進行治療有可能會成為惡性腫 瘤治療的又一重要手段。
[0005] 近來研究發(fā)現(xiàn)了一個重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白--腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)。目 前已知的TRAIL受體共有5種，其中包括2個死亡受體(death receptor，DR)，SPTRAIL2-Rl (DIM)和TRAIL2-R2(DR5)，均含有胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域和依賴胱天蛋白酶(caspase)途徑的凋亡 信號的識別結(jié)構(gòu)，與TRAIL結(jié)合后能將TRAIL的死亡信息傳遞至胞質(zhì)，激活胱天蛋白酶系統(tǒng)， 最終引起細胞調(diào)亡（Oncol Res，2014,21(3)，155-164;Biochem Biophys Res Commun, 2013,441(4)，743-750;M〇1 Cancer Ther,2013,12(12) ,2735-2747)。其中，DR5在正常細胞 很少或幾乎不表達，因此其對正常細胞沒有作用。其優(yōu)勢在于它與相應(yīng)的配體結(jié)合后，能迅 速誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，而對正常的細胞沒有毒性。這一特性使其優(yōu)于TNF配體家族的其它成 員，成為一個腫瘤治療的新靶點，為研究出更有效的抗腫瘤藥物提供幫助。
[0006] 毛酸楽Physalis pubescens L.為前科Solanaceae酸衆(zhòng)屬Physalis-年生草本植 物。毛酸漿主要分布于黑龍江、吉林、遼寧等地區(qū)。徐國均主編的《中國藥材學(xué)》中記載了毛 酸漿帶宿萼的果實作為燈籠草藥用，具有清熱解毒，利尿止血的功效（中國藥材學(xué).下冊.中 國醫(yī)藥科技出版社.1996,1161-1162)。毛酸漿成熟的果實還是一種美味的水果。睡茄交酯 (withanolide)類化合物是毛酸漿植物中含有的主要化學(xué)成分類型，其中毛酸漿內(nèi)酯在毛 酸漿中含量較大，為白色晶體，分子量530。目前對毛酸漿及其主要成分的藥理作用研究及 藥理作用機制的研究極少，僅有一篇文獻報道其對腫瘤細胞中醌還原酶的誘導(dǎo)作用 (Steroids,2013,78,860-865)，并且有一篇文章報道了一個化合物physapubescin B抗前 列腺腫瘤的作用（Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63,9504-9512)。 對其他毛酸漿內(nèi)酯在腫瘤中的應(yīng)用及深入的作用機制均未見報道，且對毛酸漿內(nèi)酯這一毛 酸漿中的主要藥效成分的制備方法亦未見文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了毛酸漿內(nèi)酯對多種腫瘤細胞有生長抑制作用，裸鼠體內(nèi)實驗表 明其具有明顯的抑制腫瘤生長的作用。本發(fā)明還首次涉及了毛酸漿內(nèi)酯在人腎透明細胞癌 786-0細胞中的作用機制，可制備用于治療腫瘤的藥物。
[0008]本發(fā)明的首要目的在于提供一種毛酸楽;內(nèi)酯(physapubescin)的制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供毛酸漿內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物方面的用途。
[00?0]本發(fā)明所使用的毛酸衆(zhòng)內(nèi)酯由本課題組從毛酸衆(zhòng)(Physalis pubescens L.)中提 取分離得到，為白色晶體(MeOH)，核磁數(shù)據(jù)與文獻(J.Chem.Res.(S)，1980，125;(M)，2134-2156)對照一致，確定其結(jié)構(gòu)為毛酸漿內(nèi)酯，純度>96%。本發(fā)明通篇所述的毛酸漿內(nèi)酯具有 如下的結(jié)構(gòu)式：
[0012] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0013] 本發(fā)明提供一種毛酸漿內(nèi)酯的制備方法，其包括以下操作步驟：
[0014] 1)將毛酸漿全草用提取溶劑回流提取，得到提取液；
[0015] 所述的毛酸漿全草包括毛酸漿的根、莖、葉、花及果實;所述的提取溶劑為醇或者 體積百分數(shù)40~100%，優(yōu)選為50~99%的醇的水溶液;所述的醇為甲醇或乙醇;所述的提 取液每次加入量相對于毛酸漿全草重量的5~10倍，在40~100°C回流提取1~5次，每次1~ 5小時；
[0016] 2)將步驟1)中得到的提取液濃縮，用水分散后用小極性有機溶劑，例如極性在0-0.2之間的有機溶劑萃取一次或多次，除去小極性雜質(zhì)；所述的小極性有機溶劑包括石油 醚、正己烷、環(huán)己烷；
[0017] 3)將步驟2)中剩余水層部分用中等極性有機溶劑，例如極性在3-5.6之間的有機 溶劑萃取一次或多次，得到萃取液;所述的中等極性有機溶劑包括氯仿、乙酸乙酯、二氯甲 烷等;將得到的萃取液濃縮后，采用柱色譜分離，經(jīng)過二氯甲烷和甲醇組成的洗脫體系進行 洗脫，以薄層色譜行為為指導(dǎo)，快速鎖定含有毛酸漿內(nèi)酯的第一混合組分;所述的柱色譜所 用的填料為1〇〇~300目的柱色譜硅膠，所述的萃取液濃縮后浸膏與填料的重量比為1:10~ 1:20;所說的以二氯甲烷和甲醇組成的洗脫體系進行洗脫，具體可以為：以二氯甲烷和甲醇 的體積比先后為100:1、70:1、50:1、20:1、10:1、1:1進行梯度洗脫；
[0018] 4)將步驟3)中得到的含有毛酸漿內(nèi)酯的第一混合組分，采用制備高效液相色譜 法，經(jīng)甲醇和水組成的洗脫體系洗脫并濃縮，得到純度較高的毛酸漿內(nèi)酯;所述的制備液相 色譜柱填料為RP-C 18;此步驟的洗脫體系為含甲醇體積百分數(shù)50~80%的甲醇-水溶液。最 后得到高純度、單一的毛酸漿內(nèi)酯。
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