2HPO4 · 12H20 2. 2~2. 9g，KH2PO40· 1 ~0· 2g，KCl 0· 15 ~0· 2g，NaN3 0· 2 ~0· 5g，吐溫-20 0· 5 ~I. 5mL，用 1000 mL 去離 子水溶解混勻，高溫滅菌后保存?zhèn)溆谩?br>[0048] 實(shí)施例3柑桔黃化脈明病毒的接種
[0049] 接種實(shí)施例2中保存的柑桔黃化脈明病毒，操作步驟如下：
[0050] 1)接種時(shí)先將在-80°C超低溫冰箱保存了兩年的柑桔黃化脈明病毒混合液取出 放于冰上解凍。
[0051] 2)用無(wú)菌手術(shù)刀在無(wú)病毒的尤力克梓檬植株上劃開3~5處大小為0. 3cmX 5cm， 且深至韌皮部的傷口，該傷口處的皮仍需保留。
[0052] 3)用削了頭的無(wú)菌槍頭在每個(gè)傷口處滴加步驟1)中溶解后的IOyL柑桔黃化脈 明病毒混合液，使得該混合液充分潤(rùn)濕傷口處的韌皮部及其相應(yīng)皮的內(nèi)側(cè)。將傷口處原有 的皮蓋住傷口后并用嫁接薄膜將傷口綁緊。接種6株。然后將植株放于20~25°C，光照/ 黑暗各12h的溫室中培養(yǎng)。給植株澆水時(shí)避免沾到傷口，其它管理同日常苗木管理。
[0053] 實(shí)施例4保存的柑桔黃化脈明病毒的侵染性鑒定
[0054] 將實(shí)施例3中接種后在溫室管理1個(gè)月后的植株按照周常勇等（一種微量、快速 抽提柑橘衰退病毒（CTV)核酸應(yīng)用于RT-PCR擴(kuò)增的方法，福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2001，30 (增）： 200)的方法提取接種植株的新梢，以及正對(duì)照植株（用傳統(tǒng)方法嫁接接種CYVCV的尤力克 檸檬）的總核酸，然后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。具體操作步驟如下：
[0055] 1)稱取5~IOmg植株的皮或葉裝入一無(wú)菌離心管中，在液氮中研磨后依次加入 60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)混合液，混勻。
[0056] 2) 70°C水浴5~lOmin。然后室溫下13000rpm離心5min，吸取40 μ L上清液加入 由Sephadex G-50-80構(gòu)成的微柱中4°C，5000rpm離心4min，用一新無(wú)菌離心管收集洗脫 液。-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0057] 3)用 PrimeScript? One St印 RT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒對(duì)獲得的總核 酸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，所用引物為陳洪明等（尤力克檸檬上一種新病害的生物學(xué) 特性及RT-PCR檢測(cè)，2015)發(fā)表的上游引物：5' -TACCGCAGCT ATCCATTTCC-3'和 下游引物：5' -GCAGAAATCCCGAACCACTA-3'。反應(yīng)條件為 50 °C 30min ;94 °C 2min ; 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C 30sec，循環(huán) 30 次；72°C 5min〇
[0058] 4) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，所有接種植株和正對(duì)照均可檢測(cè)出CYVCV (電泳條帶如 圖1所示，均檢測(cè)得到一條614bp的條帶）。PCR產(chǎn)物純化后與pMD19-T載體于4°C連接過 夜，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株JM-109。挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落，加 LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后送陽(yáng)性 克隆進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果與CYVCV毒株Yl (NCBI號(hào)：JX040635. 1)相應(yīng)序列的相似性為100%， 進(jìn)一步證實(shí)感染了 CYVCV。此外，接種后1個(gè)月的尤力克檸檬新梢表現(xiàn)出與正對(duì)照植株（用 傳統(tǒng)方法嫁接接種CYVCV的尤力克檸檬）上相同的黃化、脈明癥狀。表明本發(fā)明的柑桔黃 化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法完全可靠，病毒在保存2年以后對(duì)植株進(jìn)行接種仍然具有很 強(qiáng)的侵染性。
[0059] 實(shí)施例5柑桔黃化脈明病毒不同保存方法的比較
[0060] 采用7種方法A、B、C、D、E、F、G，來(lái)進(jìn)行柑桔黃化脈明病毒不同保存方法效果的比 較實(shí)驗(yàn)。7種方法具體如下：
[0061] 方法A :本發(fā)明的病毒保存方法。
[0062] 方法B :在用實(shí)施例1的方法獲得的柑桔黃化脈明病毒提取液中加入等體積甘油， 混勻后-80 °C保存。
[0063] 方法C :在用實(shí)施例1的方法獲得的柑桔黃化脈明病毒提取液中加入等體積PBS 緩沖液，混勻后_80°C保存；所述PBS緩沖液為：將NaCl 8g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KH2PO40. 2g，KCl 0. 2g，NaN3 0. 2g，吐溫-20 0. 5mL，用1000 mL去離子水溶解混勻，高溫滅菌后保 存?zhèn)溆谩?br>[0064] 方法D :參照熊克娟等（常見植物病毒冷凍干燥方法的改進(jìn)與效果觀察.華中農(nóng) 業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999, 18(2) :151-153.)的方法，將凍干機(jī)預(yù)冷到-40°C，將病毒提取液分裝入 開蓋無(wú)菌I. 5mL離心管中，上機(jī)真空干燥，保持真空腔中壓強(qiáng)為2 X 10 2bar，連續(xù)12h。打開 真空腔后迅速蓋緊蓋子，-80°C保存。
[0065] 方法E :病葉放入一開口的封口袋中，按照方法D進(jìn)行冷凍干燥處理后，打開真空 腔后迅速封死封口袋。-80°C保存。
[0066] 方法F :參照楊清華等（大豆花葉病毒保存方法的比較研究.2010.大豆科學(xué)， 29(2) :260-263)的方法，將柑桔黃化脈明病株組織浸入液氮中2min后，超低溫保存 于-80。。。
[0067] 方法G :參照熊克娟等（常見植物病毒冷凍干燥方法的改進(jìn)與效果觀察.華中農(nóng) 業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999, 18(2) :151-153.)的方法，將柑桔黃化脈明病株的幼嫩組織剪成細(xì)絲 狀，迅速放入裝有等體積顆粒狀無(wú)水CaCl2 40mL離心管中，并用封口膜封口，4°C保存。
[0068] 采用以上7種方法將柑桔黃化脈明病毒提取液或者植物病株組織保存0. 5、1、1. 5 和2年后，在保存第0. 5、1、1. 5和2年時(shí)，將方法E、F、G中保存的冷凍組織取出分別按實(shí)施 例1的方法提取得到病毒提取液，將得到的病毒提取液和解凍后的方法A、B、C保存的病毒 提取液，以及方法D中的干粉用50 μ L實(shí)施例1中的提取緩沖液溶解后，分別接種于1年生 無(wú)病毒尤力克檸檬、鄧肯葡萄柚和甜橙銅水72-1，每種方法的病毒提取液各接種10株。接 種3個(gè)月后，分別按照實(shí)施例4中的方法通過RT-PCR檢測(cè)植株感染CYVCV的情況，結(jié)果表 明，采用本發(fā)明中的病毒保存方法在保存2年后接種植株的發(fā)病率仍為100%，遠(yuǎn)高于其它 病毒保存方法，且尤力克檸檬和銅水72-1等敏感品種均表現(xiàn)出與正對(duì)照（常規(guī)嫁接接種植 株）相同的黃化、脈明癥狀。接種6個(gè)月后的檢測(cè)結(jié)果與3個(gè)月時(shí)的一致。
[0069] 表1不同保存方法CYVCV的侵染性比較
[0071] 注：表中數(shù)據(jù)分子為檢測(cè)為CYVCV陽(yáng)性的樣品數(shù)，分母為檢測(cè)的總樣品數(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種柑桔黃化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法，其特征在于：在有活性的柑桔黃化脈 明病毒提取液中加入等體積的保護(hù)劑，顛倒混合后迅速置于液氮中2~3min，然后轉(zhuǎn)移 至-80°C超低溫冰箱保存；所述保護(hù)劑為用PBS緩沖液配制的含13~17%葡萄糖，5~7% 蛋白胨以及10~30%甘油的溶液；所述的用于配制保護(hù)劑的PBS緩沖液為：將NaCl6. 8~ 8g，Na2HPO4 ? 12H20 2. 2 ~2. 9g，KH2PO4 0? 1 ~0? 2g，KCl0? 15 ~0? 2g，NaN3 0? 2 ~0? 5g， 吐溫-200. 5~I. 5mL，用1000 mL去離子水溶解混勻，高溫滅菌后保存?zhèn)溆谩?. 如權(quán)利要求1所述的柑桔黃化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法，其特征在于：所述保護(hù) 劑為用PBS緩沖液配制的含15%葡萄糖，5%蛋白胨以及10%甘油的溶液；所述的所述的用 于配制保護(hù)劑的PBS緩沖液為：將NaCl8g，Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g，KH2PO4 0? 2g，KCl0? 2g， NaN3 0. 2g，吐溫-20 0. 5mL，用1000 mL去離子水溶解混勻，高溫滅菌后保存?zhèn)溆谩?. 如權(quán)利要求1所述的柑桔黃化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法，其特征在于：所述有活 性的柑桔黃化脈明病毒提取液由包括以下步驟的提法方法獲得： 1) 取柑桔黃化脈明病病株組織5~IOg在液氮中研磨，研磨后按照重量/體積比加入 2~4倍體積的提取緩沖液進(jìn)行勻漿； 2) 將步驟1)得到的勻漿液在冰上靜置3~7min，用紗布過濾，將濾液4°C3000~ 5000rpm離心15~25min后取上清，將上清液用Miracloth濾膜過濾，濾液倒入超速離心管 中，每管分裝9mL濾液； 3) 在步驟2)中的離心管中從底部緩慢加入ImL蔗糖墊； 4) 將步驟3)中的離心管進(jìn)行4°C36000~40000rpm超速離心2~3h，離心結(jié)束后用 無(wú)菌針頭在離心管底部扎小洞，用無(wú)菌離心管承接最初流出的1~I. 3mL溶液，即為粗提 液； 5) 將步驟4)得到的2個(gè)離心管中的粗提液倒入1個(gè)新的超速離心管中，并加入提取緩 沖液將總體積配至9mL，顛倒混勻后從離心管底部緩慢加入ImL蔗糖墊，進(jìn)行4°C36000~ 40000rpm超速離心2~3h; 6) 將步驟5)中的離心管用針頭在離心管底部扎小洞，棄去最初流出的300yL溶液，并 用無(wú)菌離心管承接隨后流出的400yL病毒提取液，即得到有活性的柑桔黃化脈明病毒，冰 上放置備用； 以上所述提取緩沖液為用pH7. 440mM磷酸鹽緩沖液配制的4~6% (w/v)的蔗糖溶 液，并且含有IOmMDTT;以上所述蔗糖墊為用pH7. 440mM磷酸鹽緩沖液配制的65~75% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmMDTT;所述pH7.4 40mM磷酸鹽緩沖液用1(2即04、腿2?0 4和 無(wú)菌水制得。4. 如權(quán)利要求2所述的柑桔黃化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法，其特征在于：所述提取 緩沖液為用PH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的5% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmMDTT; 所述蔗糖墊為用PH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的70 % (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT;所述pH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液每升含 32. 08mLIMK2HP04、7. 92mLIMKH2P04,用無(wú) 菌水定容至1L。5. 如權(quán)利要求2所述的柑桔黃化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法，其特征在于：所述步驟 4)中用無(wú)菌離心管承接最初流出的粗提液，承接體積為l.OmL。6. 如權(quán)利要求2所述的柑桔黃化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法，其特征在于：所述步驟
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種柑桔黃化脈明病毒長(zhǎng)期離體保存方法，在有活性的柑桔黃化脈明病毒提取液中加入等體積的保護(hù)劑，顛倒混合后迅速置于液氮中2～3min，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存；所述保護(hù)劑為用PBS緩沖液配制的含13～17％葡萄糖，5～7％蛋白胨以及10～30％甘油的溶液；所述的PBS緩沖液為：將NaCl？6.8～8g，Na2HPO4·12H2O？2.2～2.9g，KH2PO40.1～0.2g，KCl？0.15～0.2g，NaN30.2～0.5g，吐溫-200.5～1.5mL，1000mL去離子水溶解滅菌備用。本方法離體保存的柑桔黃化脈明病毒在保存2年后仍能保持極高的侵染活性。
【IPC分類】C12N7/00
【公開號(hào)】CN105176934
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】周彥, 周常勇, 李中安
【申請(qǐng)人】西南大學(xué)柑桔研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日