快速、簡(jiǎn)捷提取有活性的柑桔黃化脈明病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物病毒的提取方法，具體涉及一種快速、簡(jiǎn)捷提取有活性的柑 桔黃化脈明病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔黃化脈明病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑桔黃 脈病是一種嚴(yán)重威脅柑桔生產(chǎn)的重要病害，主要分布于印度、巴基斯坦、土耳其等國(guó)，對(duì)檸 檬等柑桔品種造成了極其嚴(yán)重的損失。我國(guó)近年來(lái)在云南、四川等檸檬主產(chǎn)區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn) 了該病，其發(fā)生呈不斷擴(kuò)大、加重的趨勢(shì)。
[0003] 目前除使用無(wú)病毒苗木和鏟除病樹(shù)外，尚無(wú)有效的防治方法。在開(kāi)展防治柑桔黃 脈病的研究過(guò)程中，獲得具有侵染能力的病毒顆粒是必不可少的重要環(huán)節(jié)。此外，獲得大 量、有侵染能力的CYVCV顆粒，對(duì)研究該病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、物理特性、寄主范圍、傳播途徑， 以及制備高性能的抗血清都有極其重要的意義。目前在提取病毒顆粒時(shí)主要采用的策略包 括差速離心、密度梯度離心、透析、免疫吸附等，但由于不同病毒的大小、結(jié)構(gòu)、沉降系數(shù)、穩(wěn) 定性等特性都存在差異，因此即使采用相同的提取策略，在緩沖液構(gòu)成、病毒所在離心管中 的位置等重要提取條件上都是不相同的。雖然國(guó)外研究人員目前也曾嘗試通過(guò)密度梯度離 心的方法提取CYVCV粒體，但此類(lèi)方法均需要大量病株組織（約50~100g)，費(fèi)時(shí)（耗時(shí)2 天以上），價(jià)格昂貴（需用到硫酸銫或氯化銫）。并且通過(guò)此類(lèi)方法獲得的CYVCV顆粒沒(méi)有 侵染性，只能用于電鏡觀察（Loconsoleet al.，2012)。也有人嘗試直接將寄主組織勻漿后 摩擦接種于柑桔，但該方法獲得的病毒濃度低、侵染性減弱，只能侵染個(gè)別柑桔品種，且成 功率較低，也無(wú)法用于血清制備等后續(xù)研究（Alshamiet al.，2003)。這可能是由于CYVCV 不同于其它易于通過(guò)摩擦接種的草本植物病毒，因此接種方法的缺陷可能也會(huì)造成獲得的 CYVCV提取物難以侵染柑桔。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡(jiǎn)捷、高效的提取有活性的柑桔黃化脈明病毒 的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種快速、簡(jiǎn)捷提取有活性的柑桔黃化脈明病毒的 方法，包括如下步驟：
[0006] 1)取柑桔黃化脈明病病株組織5~IOg在液氮中研磨，研磨后按照重量/體積比 加入2~4倍體積的提取緩沖液進(jìn)行勻漿；
[0007] 2)將步驟1)得到的勻漿液在冰上靜置3~7min，用紗布過(guò)濾，將濾液4°C 3000~ 5000rpm離心15~25min后取上清，將上清液用Miracloth濾膜過(guò)濾，濾液倒入超速離心管 中，每管分裝9mL濾液；
[0008] 3)在步驟2)中的離心管中從底部緩慢加入ImL蔗糖墊；
[0009] 4)將步驟3)中的離心管進(jìn)行4°C 36000~40000rpm超速離心2~3h，離心結(jié)束 后用無(wú)菌針頭在離心管底部扎小洞，用無(wú)菌離心管承接最初流出的1~I. 3mL溶液，即為粗 提液；
[0010] 5)將步驟4)得到的2個(gè)離心管中的粗提液倒入1個(gè)新的超速離心管中，并加 入提取緩沖液將總體積配至9mL，顛倒混勻后從離心管底部緩慢加入ImL蔗糖墊，進(jìn)行 4°C 36000 ~40000rpm 超速離心 2 ~3h ;
[0011] 6)將步驟5)中的離心管用針頭在離心管底部扎小洞，棄去最初流出的300 yL溶 液，并用無(wú)菌離心管承接隨后流出的400 μ L病毒提取液，即得到有活性的柑桔黃化脈明病 毒，冰上放置備用；
[0012] 以上所述提取緩沖液為用pH 7. 440mM磷酸鹽緩沖液配制的4~6% (w/v)的蔗 糖溶液，并且含有IOmM DTT ;以上所述蔗糖墊為用pH 7. 440mM磷酸鹽緩沖液配制的65~ 75% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT;所述pH 7.440mM磷酸鹽緩沖液用1(2即04、 KH2PC^P無(wú)菌水制得。
[0013] 作為優(yōu)選地，所述步驟1)中的柑桔黃化脈明病病株組織為葉片或樹(shù)皮。
[0014] 作為優(yōu)選地，所述步驟1)中提取緩沖液的加入量為按照組織/緩沖液的重量/體 積比的3倍。
[0015] 作為優(yōu)選地，所述提取緩沖液為用pH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的5 % (w/v) 的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT ;所述蔗糖墊為用pH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的70% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT ;所述pH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液每升含32. 08mL IM K2HP04、7. 921.01M KH2P04,用無(wú)菌水定容至 1L。
[0016] 作為優(yōu)選地，所述步驟4)中用無(wú)菌離心管承接最初流出的粗提液，承接體積為 1.0 mL0
[0017] 所述步驟4)、5)中的超速離心轉(zhuǎn)速為38000rpm，離心2h。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法中植株病組織的使用量較現(xiàn)有方法大大減少， 從現(xiàn)有方法的100g減少到5~IOg ;提取成本顯著降低，用便宜、方便的蔗糖超速離心代 替了昂貴、復(fù)雜的硫酸銫密度梯度離心；并且提取時(shí)間大大縮短，從現(xiàn)有方法2天的提取時(shí) 間縮短至5h ;最為關(guān)鍵的是獲得的病毒顆粒具有極高的侵染活性，能高效侵染多種柑桔品 種，可應(yīng)用于制備高度專(zhuān)一的抗血清，致病性鑒定、病毒特性分析，以及抗性品種測(cè)定等，應(yīng) 用范圍廣，對(duì)柑桔黃化脈明病毒的進(jìn)一步研究具有極其重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為用本發(fā)明方法提取、接種柑桔黃化脈明病毒植株的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果電泳條 帶圖；其中：1 :水對(duì)照，17 :負(fù)對(duì)照，18 :正對(duì)照，19 :100bp標(biāo)準(zhǔn)分子量，其余為接種植株的 檢測(cè)結(jié)果。
[0020] 圖2為采用方法E提取、接種柑桔黃化脈明病毒后表現(xiàn)脈明、黃化典型癥狀的植株 葉片；其中：圖A為尤力克檸檬葉片，圖B為溫州蜜柑葉片，圖C為代代酸橙葉片。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明：
[0022] 主要試劑及生產(chǎn)者：
[0023] Miracloth 濾膜（Merck Millipore 公司，德國(guó)）
[0024] Sephadex G-50-80 構(gòu)成的微柱（Sigma 公司，美國(guó)）
[0025] PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）
[0026] pMD19-T 載體（TaKaRa 公司，日本）
[0027] 感受態(tài)菌株JM-109 (TaKaRa公司，日本）
[0028] DIECA(二乙胺基二硫代甲酸鈉）（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）
[0029] EDTA(乙二胺四乙酸）（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）
[0030] DTT (二硫蘇糖醇）（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）
[0031] Triton X-100 (上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）
[0032] Tris (三羥甲基氨基甲烷）（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）
[0033] SDS (十二烷基硫酸鈉）（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）
[0034] TES 緩沖液（1M Tris-HCl 50mL，0. 5M EDTA2mL，SDS 10g，用水定容至 500mL， ρΗ8· 0,高溫滅菌后保存）
[0035] 本發(fā)明實(shí)施例中所用提取緩沖液為用ρΗ7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的5% (w/ v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT。所用蔗糖墊為用pH7.4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的 70% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT。pH7.4、40mM的磷酸鹽緩沖液每升用32.08mL IM K2HP04,7 . 92mL IM KH2P04 和無(wú)菌水配得。
[0036] 實(shí)施例1柑桔黃化脈明病毒的提取
[0037] 提取柑桔黃化脈明病毒，按照如下步驟操作：
[0038] 1)將5~IOg柑桔黃化脈明病病株的葉片或樹(shù)皮（植株來(lái)源于西南大學(xué)柑桔研究 所毒源庫(kù)）在液氮中研磨成粉狀轉(zhuǎn)移至一干凈的無(wú)菌50mL離心管中，并按重量/體積比加 入3倍體積（即Ig病株組織加入3mL提取緩沖液）的提取緩沖液進(jìn)行勻漿。
[0039] 2)勻漿后將離心管在冰上靜置5min，將混液經(jīng)三層紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液進(jìn)行 4°C 5000rpm離心20min，獲得的上清液經(jīng)Mira cloth濾膜過(guò)濾后，倒入IOmL超速離心管 中，每管加入9mL上清液，不足9mL時(shí)用提取緩沖液進(jìn)行補(bǔ)充。
[0040] 3)隨后用ImL微量注射器在超速離心管的底部緩慢的加入ImL蔗糖墊。注意該過(guò) 程不能發(fā)生抖動(dòng)或產(chǎn)生氣泡。
[0041] 4)將步驟3)的離心管用美國(guó)Beckman公司的SW40Ti超離轉(zhuǎn)頭進(jìn)行4°C 38000rpm 超速離心2h。離心結(jié)束后，用無(wú)菌針頭在離心管底部扎一小洞，用一無(wú)菌的I. 5mL離心管承 接最初流出的1.0 mL溶液，即為粗提液。
[0042] 5)將步驟4)得到的2個(gè)無(wú)菌I. 5mL離心管中的粗提液倒入1個(gè)新的IOmL超速離 心管中，并加入提取緩沖液，將總體積配至9mL (整個(gè)轉(zhuǎn)移過(guò)程不得使用移液器）。顛倒混勻 后，再用ImL微量注射器在超速離心管的底部緩慢加入ImL蔗糖墊。隨后使用SW40Ti超離 轉(zhuǎn)頭進(jìn)行4°C 38000rpm超速離心2h。
[0043] 6)超速離心結(jié)束后，用針頭在離心管底部扎一小洞，棄去最初流出的300 yL溶 液，并用無(wú)菌離心管承接隨后流出的400 μ L病毒提取液，冰上放置備用。
[0044] 實(shí)施例2柑桔黃化脈明病毒的接種
[0045] 接種實(shí)施例1中提取得到的柑桔黃化脈明病毒，操作步驟如下：
[0046] 1)用無(wú)菌手術(shù)刀在無(wú)病毒的尤力克梓檬植株上劃開(kāi)3~5處大小為0· 3cmX 5cm， 且深至韌皮部的傷口，該傷口處的皮仍需保留。
[0047] 2)用削了頭的無(wú)菌槍頭在每個(gè)傷口處滴加10 μ L實(shí)施例1中提取得到的柑桔黃化 脈明病毒提取液，使得該提取液充分潤(rùn)濕傷口處的韌皮部及其相應(yīng)皮的內(nèi)側(cè)。將傷口處原 有的皮蓋住傷口后并用嫁接薄膜將傷口綁緊