柑桔黃化脈明病毒長期離體保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物病毒的保存方法，具體涉及一種柑桔黃化脈明病毒長期尚體 保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔黃化脈明病毒（Citrusyellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑桔黃 脈病是一種新近出現(xiàn)在我國檸檬上的重要病毒病，其發(fā)生呈不斷擴(kuò)大、加重的趨勢。
[0003] 目前除使用無病毒苗木和鏟除病樹外，尚無有效的防治方法。在開展防治柑桔黃 脈病的研究過程中，病毒的保存是必不可少的重要環(huán)節(jié)。由于常溫下植物病毒的體外存活 期極短，目前包括柑桔病毒在內(nèi)的植物病毒均主要是通過將病毒接種于寄主植物的方式進(jìn) 行保存，因此就需要不斷在寄主植物間進(jìn)行轉(zhuǎn)移、繼代和擴(kuò)繁。這種保存方法在長期保存過 程中不僅可能會(huì)發(fā)生意外丟失、混雜，甚至可能會(huì)發(fā)生病毒變異，導(dǎo)致其生物學(xué)特性改變， 而且不斷重復(fù)的工作也消耗了大量的人力物力。因此尋找一種操作簡便，又可長期保持病 毒活力的保存方法是一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)工作。
[0004] 關(guān)于植物病毒的長期保存方法國內(nèi)做了大量相關(guān)研究，除了早期采用的低溫保 存、干燥保存、以及組織培養(yǎng)保存外，目前應(yīng)用最為廣泛、效果最好的病毒保存方式是真空 冷凍干燥處理。經(jīng)過真空冷凍干燥處理的病毒提取物在使用時(shí)通過摩擦接種的方式即可將 病毒接種于相應(yīng)的寄主植物。此外，超低溫保存也因其操作簡單而被廣泛運(yùn)用。但是目前 此類研究的對(duì)象主要集中于侵染草本植物的病毒，本發(fā)明中涉及的CYVCV，作為一種果樹病 毒其在植株中的含量、穩(wěn)定性、接種方式等特性均與草本植物的病毒存在很大的差異，現(xiàn)有 保存方法無法長期保持該病毒的致病力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述問題提供一種能夠?qū)Ω探埸S化脈明病毒進(jìn)行長期離 體保存的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：在有活性的柑桔黃化脈明病毒提取液中加入等體積 的保護(hù)劑，顛倒混合后迅速置于液氮中2~3min，然后轉(zhuǎn)移至-80°C超低溫冰箱保存；所述 保護(hù)劑為用PBS緩沖液配制的含13~17%葡萄糖，5~7%蛋白胨以及10~30%甘油的 溶液；所述的用于配制保護(hù)劑的PBS緩沖液為：將NaCl 6. 8~8g，Na2HPO4 · 12H20 2. 2~ 2. 9g，KH2PO4 0· 1 ~0· 2g，KCl 0· 15 ~0· 2g，NaN3 0· 2 ~0· 5g，吐溫-20 0· 5 ~I. 5mL，用 1000 mL去離子水溶解混勻，高溫滅菌后保存?zhèn)溆谩?br>[0007] 作為優(yōu)選地，所述保護(hù)劑為用PBS緩沖液配制的含15%葡萄糖，5%蛋白胨以及 10%甘油的溶液；所述的用于配制保護(hù)劑的PBS緩沖液為：將NaCl 8g，Na2HPO4 · 12H20 2.9g，KH2P04 0 . 2g，KCl 0.2g，NaN3 0.2g，吐溫-20 0.5mL，用 1000 mL 去離子水溶解混勻，高 溫滅菌后保存?zhèn)溆谩?br>[0008] 所述有活性的柑桔黃化脈明病毒提取液的提法方法包括以下步驟：
[0009] 1)取柑桔黃化脈明病病株組織5~IOg在液氮中研磨，研磨后按照重量/體積比 加入2~4倍體積的提取緩沖液進(jìn)行勻漿；
[0010] 2)將步驟1)得到的勻漿液在冰上靜置3~7min，用紗布過濾，將濾液4°C 3000~ 5000rpm離心15~25min后取上清，將上清液用Miracloth濾膜過濾，濾液倒入超速離心管 中，每管分裝9mL濾液；
[0011] 3)在步驟2)中的離心管中從底部緩慢加入ImL蔗糖墊；
[0012] 4)將步驟3)中的離心管進(jìn)行4°C 36000~40000rpm超速離心2~3h，離心結(jié)束 后用無菌針頭在離心管底部扎小洞，用無菌離心管承接最初流出的1~I. 3mL溶液，即為粗 提液；
[0013] 5)將步驟4)得到的2個(gè)離心管中的粗提液倒入1個(gè)新的超速離心管中，并加 入提取緩沖液將總體積配至9mL，顛倒混勻后從離心管底部緩慢加入ImL蔗糖墊，進(jìn)行 4°C 36000 ~40000rpm 超速離心 2 ~3h ;
[0014] 6)將步驟5)中的離心管用針頭在離心管底部扎小洞，棄去最初流出的300 μ L溶 液，并用無菌離心管承接隨后流出的400 μ L病毒提取液，即得到有活性的柑桔黃化脈明病 毒，冰上放置備用；
[0015] 以上所述提取緩沖液為用pH 7. 4 40mM磷酸鹽緩沖液配制的4~6% (w/v)的蔗 糖溶液，并且含有IOmM DTT ;以上所述蔗糖墊為用pH 7. 4 40mM磷酸鹽緩沖液配制的65~ 75% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT;所述pH 7.4 40mM磷酸鹽緩沖液用1(2即04、 KH2PC^P無菌水制得。
[0016] 作為優(yōu)選地，所述提取緩沖液為用pH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的5% (w/v) 的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT ;所述蔗糖墊為用pH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的70% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT ;所述pH7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液每升含32. 08mL IM K2HP04、7. 92mL IM KH2P04,用無菌水定容至 1L。
[0017] 作為優(yōu)選地，所述步驟4)中用無菌離心管承接最初流出的粗提液，承接體積為 1.0 mL0
[0018] 作為優(yōu)選地，所述步驟4)、5)中的超速離心轉(zhuǎn)速為38000rpm，離心2h。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：解決了當(dāng)前柑桔黃化脈明病毒只能通過嫁接植株活體保 存、無法進(jìn)行離體保存，且現(xiàn)有其它植物病毒的離體保存技術(shù)均不適用于柑桔黃化脈明病 毒的問題。本發(fā)明方法可避免傳統(tǒng)的柑桔黃化脈明病毒活體嫁接保存方法在連續(xù)嫁接接種 過程中可能出現(xiàn)的病毒變異以及植株中混有其它病毒造成的污染問題。通過本發(fā)明方法離 體保存的柑桔黃化脈明病毒在保存2年后仍能保持極高的侵染活性，能高效侵染多種柑桔 品種，可應(yīng)用于制備高度專一的抗血清，致病性鑒定、病毒特性分析，以及抗性品種測定等， 應(yīng)用范圍廣，對(duì)柑桔黃化脈明病毒的進(jìn)一步研究具有極其重要的意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1為用本發(fā)明保存方法保存的柑桔黃化脈明病毒接種植株后的RT-PCR檢測結(jié) 果電泳條帶圖；其中：1 :l〇〇bp標(biāo)準(zhǔn)分子量，2 :水對(duì)照，3-8 :接種植株，9 :負(fù)對(duì)照，10-11 :正 對(duì)照。
[0021] 圖2為采用本發(fā)明方法保存的柑桔黃化脈明病毒接種尤力克檸檬植株后表現(xiàn)脈 明、黃化典型癥狀的葉片。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明：
[0023] 主要試劑及生產(chǎn)者：
[0024] Miracloth 濾膜（Merck Millipore 公司，德國）
[0025] Sephadex G-50-80 構(gòu)成的微柱（Sigma 公司，美國）
[0026] PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）
[0027] pMD19-T 載體（TaKaRa 公司，日本）
[0028] 感受態(tài)菌株JM-109 (TaKaRa公司，日本）
[0029] DIECA(二乙胺基二硫代甲酸鈉）（上海生工生物工程有限公司，中國）
[0030] EDTA(乙二胺四乙酸）（上海生工生物工程有限公司，中國）
[0031] DTT (二硫蘇糖醇）（上海生工生物工程有限公司，中國）
[0032] Triton X-100 (上海生工生物工程有限公司，中國）
[0033] Tris (三羥甲基氨基甲烷）（上海生工生物工程有限公司，中國）
[0034] SDS (十二烷基硫酸鈉）（上海生工生物工程有限公司，中國）
[0035] TES 緩沖液（1M Tris-HCl 50mL，0. 5M EDTA2mL，SDS 10g，用水定容至 500mL， ρΗ8· 0,高溫滅菌后保存）
[0036] 實(shí)施例1柑桔黃化脈明病毒的提取
[0037] 本實(shí)施例中所用提取緩沖液為用ρΗ7. 4、40mM的磷酸鹽緩沖液配制的5 % (w/v)的 蔗糖溶液，并且含有1〇禮〇1'1'。所用蔗糖墊為用？!17.4、4〇1111的磷酸鹽緩沖液配制的70% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmM DTT。pH7.4、40mM的磷酸鹽緩沖液每升用32.08mL IM K2HP04,7 . 92mL IM KH2P04 和無菌水配得。
[0038] 提取柑桔黃化脈明病毒，按照如下步驟操作：
[0039] 1)將5~IOg柑桔黃化脈明病病株的葉片或樹皮（植株來源于西南大學(xué)柑桔研究 所毒源庫）在液氮中研磨成粉狀轉(zhuǎn)移至一干凈的無菌50mL離心管中，并按重量/體積比加 入3倍體積（即Ig病株組織加入3mL提取緩沖液）的提取緩沖液進(jìn)行勻漿。
[0040] 2)勻漿后將離心管在冰上靜置5min，將混液經(jīng)三層紗布進(jìn)行過濾，將濾液進(jìn)行 4°C 5000rpm離心20min，獲得的上清液經(jīng)Mira cloth濾膜過濾后，倒入IOmL超速離心管 中，每管加入9mL上清液，不足9mL時(shí)用提取緩沖液進(jìn)行補(bǔ)充。
[0041] 3)隨后用ImL微量注射器在超速離心管的底部緩慢的加入ImL蔗糖墊。注意該過 程不能發(fā)生抖動(dòng)或產(chǎn)生氣泡。
[0042] 4)將步驟3)的離心管用美國Beckman公司的SW40Ti超離轉(zhuǎn)頭進(jìn)行4°C 38000rpm 超速離心2h。離心結(jié)束后，用無菌針頭在離心管底部扎一小洞，用一無菌的I. 5mL離心管承 接最初流出的1~I. 3mL溶液，即為粗提液。
[0043] 5)將步驟4)得到的2個(gè)無菌I. 5mL離心管中的粗提液倒入1個(gè)新的IOmL超速離 心管中，并加入提取緩沖液，將總體積配至9mL (整個(gè)轉(zhuǎn)移過程不得使用移液器）。顛倒混勻 后，再用ImL微量注射器在超速離心管的底部緩慢加入ImL蔗糖墊。隨后使用SW40Ti超離 轉(zhuǎn)頭進(jìn)行4°C 38000rpm超速離心2h。
[0044] 6)超速離心結(jié)束后，用針頭在離心管底部扎一小洞，棄去最初流出的300 yL溶 液，并用無菌離心管承接隨后流出的400 μ L病毒提取液，冰上放置備用。
[0045] 實(shí)施例2柑桔黃化脈明病毒的長期離體保存
[0046] 在實(shí)施例1中獲得的柑桔黃化脈明病毒提取液中加入等體積的保護(hù)劑，顛倒混合 (不能進(jìn)行斡旋或用移液器混合）后迅速置于液氮中2~3min，然后轉(zhuǎn)移至-80°C超低溫 冰箱保存；所述保護(hù)劑為用PBS緩沖液配制的含15%葡萄糖，5%蛋白胨，以及10%甘油的 溶液；所述的用于配制保護(hù)劑的PBS緩沖液為：將NaCl 8g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KH2PO40. 2g，KCl 0. 2g，NaN3 0. 2g，吐溫-20 0. 5mL，用1000 mL去離子水溶解混勻，高溫滅菌后保 存?zhèn)溆谩?br>[0047] 所述保護(hù)劑和PBS緩沖液的組分比例在以下范圍也可實(shí)現(xiàn)本實(shí)施例：保護(hù)劑為用 PBS緩沖液配制的含13~17%葡萄糖，5~7%蛋白胨以及10~30%甘油的溶液；所述的 用于配制保護(hù)劑的PBS緩沖液為：將NaCl 6. 8~8g，Na