一種用于疫苗的非載體佐劑、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種用于疫苗的非載體佐劑、其制備方法及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 疫苗是預(yù)防和控制傳染性疾病發(fā)生及發(fā)展的重要手段。免疫佐劑（又稱(chēng)非特異性 免疫增生劑）則是疫苗中不可或缺的組成成分，能夠有效地促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫反 應(yīng)。隨著疫苗研究的飛速發(fā)展，新型的基因工程疫苗正被廣泛用于疫苗的研制開(kāi)發(fā)。這種 疫苗具有純度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是由于其分子小，免疫原性相對(duì)較差，迫切需要結(jié)合 有效的免疫佐劑，以提高疫苗的免疫效力。過(guò)去的數(shù)十年來(lái)，人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)和研制了各 種新型的免疫佐劑，然而潛在的安全性及穩(wěn)定性等因素大大制約了免疫佐劑的推廣使用。
[0003] 納米銀具有抗菌、除臭及吸收部分紫外線(xiàn)的功能，可應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和化妝品行 業(yè)，在化纖中加入少量的納米銀，可以改變化纖品的某些性能，并賦予很強(qiáng)的殺菌能力。人 們均將納米材料作為載體，高效負(fù)載疫苗抗原，增強(qiáng)抗原進(jìn)入細(xì)胞的能力，最終誘導(dǎo)更強(qiáng)的 免疫反應(yīng)。但這樣的策略通常也會(huì)因?yàn)榧{米疫苗載體的過(guò)多進(jìn)入細(xì)胞，而造成過(guò)強(qiáng)的細(xì)胞 毒性，不利于納米佐劑的進(jìn)一步臨床應(yīng)用。
[0004] CN102068698A公開(kāi)了一種納米疫苗及其制備方法，采用新的甘露糖基化的陽(yáng)離 子脂質(zhì)體復(fù)合物，可以作為疫苗載體及應(yīng)用于疫苗，這種新的脂質(zhì)體復(fù)合物在陽(yáng)離子脂中 摻入中性磷脂和甘露糖。該發(fā)明作為一種高效無(wú)副作用的新型疫苗載體和佐劑，顯著增強(qiáng) 疫苗的免疫效果。CN101972477A公開(kāi)了一種磷酸鋅疫苗佐劑及其應(yīng)用，所述磷酸鋅作為 疫苗佐劑與疫苗聯(lián)合應(yīng)用，能夠有效增強(qiáng)疫苗的體液免疫應(yīng)答，其免疫增強(qiáng)效果優(yōu)于鋁佐 劑和氫氧化鋅佐劑。但上述的納米疫苗和佐劑都能被細(xì)胞攝取，影響細(xì)胞的正常代謝。
[0005] 許立耕等研究了金納米棒經(jīng)CTAB、TODAC和PEI修飾后，作為DNA疫苗佐劑，在治 療HIV中的作用（參見(jiàn)LigengXu,etal. ,Surface-EngineeredGoldNanorods:Promising DNAVaccineAdjuvantforHIV-lTreatment.NanoLetters, 2012, 12(4):2003-2012)，盡 管其首次公開(kāi)了將金納米棒作為載體佐劑用于增強(qiáng)HIV免疫反應(yīng)，然而，其存在以下缺陷： 金納米棒佐劑，對(duì)細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，且刺激免疫反應(yīng)的能力相對(duì)較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于疫苗的非載體佐劑、其制備方法及應(yīng)用，所述非 載體佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)的同時(shí)，不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，且毒性極低。
[0007] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了一種用于疫苗的非載體佐劑，所述的非載體佐劑為表面 經(jīng)免疫調(diào)節(jié)分子修飾的銀納米棒。
[0009] 目前來(lái)看，載體佐劑通常要作為抗體的載體，伴隨抗體一起進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，會(huì)對(duì)細(xì)胞 產(chǎn)生毒性，然而本發(fā)明所述的非載體佐劑于載體佐劑有著本質(zhì)的不同，其不與抗體結(jié)合，幾 乎不會(huì)被細(xì)胞攝取，因而對(duì)細(xì)胞只有極低的細(xì)胞毒性，不會(huì)影響細(xì)胞的正常代謝和正常生 長(zhǎng)，這類(lèi)具有良好生物相容性的納米佐劑可有效增強(qiáng)蛋白疫苗所引發(fā)的免疫反應(yīng)，包括抗 體反應(yīng)和T細(xì)胞反應(yīng)等。
[0010] 本發(fā)明所采用的銀納米棒不同于現(xiàn)有技術(shù)中的金納米棒，其不同主要體現(xiàn)在：表 面修飾的免疫調(diào)節(jié)分子和組成成分不同，銀納米棒和金納米棒的尺寸也存在差異，這就導(dǎo) 致了細(xì)胞對(duì)銀納米棒和金納米棒的攝取程度不同和對(duì)細(xì)胞的免疫效果不同；其相對(duì)于金 納米棒，具有以下優(yōu)勢(shì)：銀納米棒作為非載體佐劑，能顯著增強(qiáng)免疫反應(yīng)，幾乎不被細(xì)胞吸 收，對(duì)細(xì)胞的毒性相較于金納米棒低得多。。
[0011] 優(yōu)選地，所述的免疫調(diào)節(jié)分子為聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞胺或二甲基 二烯丙基氯化銨中的任意一種或是至少兩種的組合。
[0012] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述的非載體佐劑為表面經(jīng)聚乙二醇（PEG)和聚乙烯吡咯烷 酮（PVP)修飾的銀納米棒。
[0013] 本發(fā)明中，非載體佐劑經(jīng)PEG和PVP修飾，PEG修飾可以更好的保護(hù)納米銀的穩(wěn)定 性，同時(shí)PVP可以作為免疫刺激劑發(fā)揮作用。
[0014] 優(yōu)選地，所述銀納米棒的長(zhǎng)度為150_300nm，例如可以是150nm、160nm、170nm、 180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm或 300nm，優(yōu)選為180_260nm，進(jìn)一步優(yōu)選為200nm。
[0015] 優(yōu)選地，所述銀納米棒的直徑為10_120nm，例如可以是10nm、llnm、20nm、30nm、 50nm、60nm、80nm、90nm、lOOnm、llOnm、115nm或 120nm，優(yōu)選為 20_80nm，進(jìn)一步優(yōu)選為 50nm。
[0016] 第二方面，本發(fā)明提供一種制備如第一方面所述的非載體佐劑的方法，包括以下 步驟：
[0017] (1)向持續(xù)攪拌的PEG溶液中加入PVP和硝酸銀，繼續(xù)不斷攪拌至試劑完全溶解；
[0018] (2)將步驟⑴得到的溶液加熱至75-85°C，恒溫0? 5-3h;
[0019] (3)將步驟⑵得到的溶液繼續(xù)加熱至85-95°C，恒溫15-30h;
[0020] (4)將步驟⑶得到的溶液冷卻后用乙醇或水沉淀，再加入水溶解沉淀經(jīng)20°C水 浴超聲得到銀納米棒。
[0021] 優(yōu)選地，步驟（1)所述PVP的濃度為0? 1-lmol/L，例如可以是0?lmol/L、0. 2mol/ L、0. 3mol/L、0. 4mol/L、0. 5mol/L、0. 6mol/L、0. 7mol/L、0. 8mol/L、0. 9mol/L或lmol/L，優(yōu) 選為 0? 15-0. 3mol/L。
[0022] 優(yōu)選地，步驟（1)所述硝酸銀的濃度為0? 01-lmol/L，例如可以是0? 01m〇l/L、 0?02mol/L、0. 05mol/L、0.Imol/L、0. 2mol/L、0. 3mol/L、0. 4mol/L、0. 5mol/L、0. 6mol/L、 0? 7mol/L、0. 8mol/L、0. 9mol/L或lmol/L，優(yōu)選為 0? 05-0. 3mol/L。
[0023] 優(yōu)選地，步驟⑴所述的PEG濃度為l-50nM，例如可以是InM、1.InM、1. 2nM、2nM、 3nM、5nM、8nM、10nM、12nM、15nM、16nM、18nM、20nM、22nM、24nM、25nM、26nM、28nM、30nM、32nM、 35nM、36nM、38nM、40nM、42nM、44nM、45nM、46nM、48nM或 50nM，優(yōu)選為 3-30nM，進(jìn)一步優(yōu)選為 10nM〇
[0024] 優(yōu)選地，步驟⑵所述的加熱溫度為80°C，恒溫lh。
[0025] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的加熱溫度為90°C，恒溫20h。
[0026] 優(yōu)選地，所述制備方法包括如下步驟：
[0027] (1)向持續(xù)攪拌的PEG溶液中加入濃度為0? 1-lmol/LPVP和濃度為0? 01-lmol/L 硝酸銀，繼續(xù)不斷攪拌至試劑完全溶解；
[0028] (2)將步驟⑴得到的溶液加熱至75-85°C，恒溫0? 5-3h;
[0029] (3)將步驟⑵得到的溶液繼續(xù)加熱至85-95°C，恒溫15-30h;
[0030] (4)將步驟（3)得到的溶液冷卻后用乙醇或水沉淀，再加入水溶解沉淀經(jīng)20°C水 浴超聲得到銀納米棒。
[0031] 第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的非載體佐劑在增強(qiáng)疫苗和細(xì)胞免 疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0032] 優(yōu)選為在增強(qiáng)HIV蛋白疫苗的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明的納米非載體佐劑可有效增強(qiáng)HIV蛋白疫苗的抗體（IgG，IgG3)和細(xì)胞 (CD107a，IL-2,IL-4,TNF-a)免疫反應(yīng)水平。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0035] (1)本發(fā)明非載體佐劑可有效增強(qiáng)HIV蛋白疫苗的抗體IgG與IgG3和細(xì)胞 CD107a，IL-2,IL-4 與TNF-a免疫反應(yīng)水平；
[0036] (2)本發(fā)明非載體佐劑的細(xì)胞毒性極低，幾乎不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，不影響細(xì)胞的正常生 長(zhǎng)；
[0037] (3)本發(fā)明非載體佐劑相比于其他納米材料有更好的生物相容性。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1是本發(fā)明非載體佐劑（銀納米棒）結(jié)合HIV蛋白疫苗在小鼠體內(nèi)引發(fā)的體液 和細(xì)胞免疫反應(yīng)的示意圖。
[0039] 圖2是本發(fā)明銀納米棒的表征圖，其中（A)為銀納米棒FTIR結(jié)果圖；(B)為銀納 米棒TEM結(jié)果圖；(C)為銀納米棒DLS粒徑分布結(jié)果圖；(D)為銀納米棒DLS電荷強(qiáng)度結(jié)果 圖；(E)為銀納米棒修飾后的FTIR結(jié)果圖。
[0040] 圖3是本發(fā)明銀納米棒和銀納米球的結(jié)果對(duì)比圖，其中（A)和⑶為銀納米棒和 銀納米顆粒對(duì)Hela和HUVEC細(xì)胞的毒性結(jié)果對(duì)比；(C)和（D)為銀納米棒和銀納米顆粒被 Hela和HUVEC細(xì)胞攝取的強(qiáng)度對(duì)比；(E)和（F)為銀納米棒和銀納米顆粒在Hela和HUVEC 細(xì)胞中，攝取強(qiáng)度和毒性強(qiáng)度的關(guān)系圖；其中，淺色為銀納米棒，深色為銀納米顆粒。
[0041] 圖4是本發(fā)明非載體佐劑（銀納米棒）增強(qiáng)HIV蛋白疫苗引發(fā)的抗體反應(yīng)，其中 (A)為IgG抗體反應(yīng)；(B)為IgA抗體反應(yīng)；（C)為lgM抗體反應(yīng)；其中，組1、組2和組3分 另IJ代表PBS注射小鼠組、單獨(dú)HIV蛋白疫苗注射小鼠組和"HIV蛋白疫苗+銀納米棒"注射 小鼠組。
[0042] 圖5是本發(fā)明非載體佐劑（銀納米棒）增強(qiáng)HIV蛋白疫苗引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)，其中 (A)為CD107a細(xì)胞反應(yīng)；(B)為IFN-y細(xì)胞反應(yīng)；(C)為IL-2細(xì)胞反應(yīng)；(D)為IL-4細(xì)胞 反應(yīng)；(E)為T(mén)NF-a細(xì)胞反應(yīng)，其中，組1、組2和組3分別代表PBS注射小鼠組、單獨(dú)HIV 蛋白疫苗注射小鼠組和"HIV蛋白疫苗+銀納米棒"注射小鼠組。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí) 施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。
[0044] 本申請(qǐng)實(shí)施例所用材料及試劑購(gòu)自：AgN03(純度99. 9% )購(gòu)自AlfaAesar;PEG 600購(gòu)自中國(guó)西龍化學(xué)試劑公司；PVP(分子量40K)、PBS、BSA、聚甲醛和TMB顯色液購(gòu)自 Sigma公司；HRP標(biāo)記抗體購(gòu)自SantaCruz;細(xì)胞因子標(biāo)記物購(gòu)自Invitrogen公司；配制試 劑使用電阻率大于18. 0mQ的超純水；其余化學(xué)/生物試劑均可由商品化購(gòu)得，所有化學(xué)試 劑均在保質(zhì)期內(nèi)使用。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)國(guó)家納米科學(xué)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照 北京實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)規(guī)定操作。
[0045] 實(shí)施例中的儀器：
[0046] 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀ThermoLifeSciences;
[0047] FACSCalibur流式細(xì)胞儀BectonDickinson。
[0048] 實(shí)施例1 :銀納米棒的合成及特性表征
[0049] 銀納米棒的制備：
[0050] 室溫條件下，0. 5ml3MAgNOjP2. 5ml2MPVP加入持續(xù)攪拌的25mL聚乙二醇中， 加熱之前再持續(xù)攪拌5min?；旌衔锛訜嶂?0°C，維持lh，繼續(xù)加熱至90°C持續(xù)20h。冷卻 后用大量乙醇或水沉淀，緩慢倒出上層液體，加入水溶解沉淀經(jīng)20°C水浴超聲，即獲得銀納 米棒。
[0051] 通過(guò)FIRT、TEM和DLS表征制備的銀