重組NTD蛋白亞單位疫苗對(duì)抗MERS-CoV感染的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域，特別是涉及一種真核表達(dá)的重組NTD蛋白作為疫苗用于預(yù)防或治療MERS-CoV感染。
[0002]【背景技術(shù)】中東呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(Middle East Respiratory SyndromeCoranavirus, MERS-CoV)是一種新型冠狀病毒，該病毒最早于2012年4月，從一名患有急性呼吸窘迫綜合征病人體內(nèi)分離獲得，隨后在約旦、卡塔爾等中東地區(qū)一直有感染病例報(bào)道。據(jù)WHO報(bào)道，截止至2015年5月18日，全球?qū)嶒?yàn)室確診MERS-CoV感染者共計(jì)1118例，其中423例死亡，病死率高達(dá)37.8%。研究表明單峰駝可能為該病毒的動(dòng)物儲(chǔ)存宿主，但其傳染途徑尚不明確，目前亦無(wú)有效藥物對(duì)抗其感染，因此研制一種有效疫苗預(yù)防和控制MERS-CoV感染追在眉睫。
[0003]MERS-CoV與其他冠狀病毒相似，是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒。病毒表面的棘突蛋白S蛋白是病毒包膜上特異性的組織結(jié)構(gòu)，在病毒的表面形成大量刺突，在病毒入侵靶細(xì)胞以及病毒與細(xì)胞發(fā)生交互作用時(shí)發(fā)揮著重要的作用。多項(xiàng)研究表明，S蛋白疫苗可以產(chǎn)生高效價(jià)的抗SARS-CoV中和抗體，有效預(yù)防SARS-CoV感染。因此冠狀病毒疫苗的研發(fā)通常以S抗原作為主要靶抗原。但在SARS-CoV疫苗研究中，用表達(dá)全長(zhǎng)S蛋白的MVA載體構(gòu)建的SARS疫苗免疫雪豹可加重SARS-CoV感染引起的肝損傷，這種由于疫苗的應(yīng)用，而使免疫個(gè)體產(chǎn)生促進(jìn)病毒復(fù)制或加重疾病癥狀的現(xiàn)象是研發(fā)疫苗要考慮的重要問(wèn)題?？贵w依賴性增強(qiáng)作用(antibody dependent enhancement, ADE)即在亞中和抗體濃度下，體液免疫應(yīng)答可導(dǎo)致疾病癥狀加重，可能是導(dǎo)致該結(jié)果的主要原因。據(jù)報(bào)道，重組受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor bingding domain, RBD)蛋白可介導(dǎo)貓SARS-CoV樣病毒的ADE。因此，MERS-CoV疫苗的研發(fā)既要選擇包含多個(gè)中和抗原表位的S抗原，又要避免RBD等結(jié)構(gòu)可能的潛在ADE。NTD即N terminal domain為冠狀病毒S抗原N端的一段序列，多種冠狀病毒的NTD可與宿主細(xì)胞的蛋白或糖蛋白結(jié)合，介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞，故該段區(qū)域可能包含誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的表位。故本專利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了該NTD重組蛋白，純化后免疫小鼠，證實(shí)該重組蛋白可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)長(zhǎng)期而有效的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，具有進(jìn)一步開發(fā)為有效的疫苗預(yù)防和治療MERS-CoV感染的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]應(yīng)用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NTD重組蛋白，純化在小鼠體內(nèi)證實(shí)該重組蛋白具有進(jìn)一步開發(fā)為有效的疫苗預(yù)防和治療MERS-CoV感染的前景。
【附圖說(shuō)明】
[0005]圖1:NTD結(jié)構(gòu)示意圖，顯示其為S基因上18-353位氨基酸之間的一段長(zhǎng)約336個(gè)氨基酸的序列。
[0006]圖2:NTD westemblot鑒定結(jié)果，可見重組NTD約為50KDa大小的蛋白。
[0007]圖3:NTD SDS-PAGE鑒定結(jié)果，可見純化后的NTD純度較高。
[0008]圖4:動(dòng)物免疫方案，36只小鼠隨機(jī)分為3組，分別為NTD高劑量組，每只小鼠肌肉注射1ug重組NTD蛋白，NTD低劑量組，每只小鼠肌肉注射5ug重組NTD蛋白，兩組小鼠免疫時(shí)均加入Al (OH) 3和CpG佐劑。同時(shí)設(shè)相應(yīng)佐劑為對(duì)照組。
[0009]圖5:動(dòng)物免疫程序，各組小鼠免疫三次，間隔4周，每次免疫后2周取血檢測(cè)血清IgG抗體和中和抗體滴度。末次免疫后6周和14周，每組分別處死6只小鼠，分離脾臟淋巴細(xì)胞，ELISpot檢測(cè)重組NTD蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0010]圖6:免疫后6w和1w小鼠血清IgG抗體檢測(cè)，可見高低劑量組重組NTD蛋白均誘導(dǎo)了高水平的IgG抗體應(yīng)答。
[0011]圖7:免疫后1w小鼠血清中和抗體檢測(cè)，假病毒中和試驗(yàn)表明免疫后1w高低劑量組重組NTD蛋白均誘導(dǎo)了高水平的中和抗體。且該中和抗體可持續(xù)至少到免疫后14w。
[0012]圖8:免疫后22w小鼠血清中和抗體檢測(cè)，假病毒中和試驗(yàn)表明免疫高低劑量組重組NTD蛋白均誘導(dǎo)了高水平的中和抗體，且該中和抗體可持續(xù)至少到免疫后22w。
[0013]圖9:免疫后14w和22w脾細(xì)胞ELISpot檢測(cè)，ELISpot檢測(cè)證實(shí)高低劑量組重組NTD蛋白經(jīng)肌肉注射免疫小鼠可誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，且該細(xì)胞免疫應(yīng)答可持續(xù)到至少免疫后22w。
[0014]【具體實(shí)施方式】:
[0015]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社，2005)等本領(lǐng)域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產(chǎn)廠家所建議的條件進(jìn)行。
[0016]實(shí)施例1:MERS_CoV重組NTD蛋白的鑒定
[0017]將桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組NTD蛋白(位置示意圖如圖1)，經(jīng)鎳柱親和層析純化，Bicinchoninic acid法定量。Western Blot鑒定于40_55KDa之間可見NTD目的條帶(圖2)。SDS-PAGE電泳同樣于40-55KDa之間可見NTD目地條帶(圖3)，此外未見其他蛋白條帶，證明獲得的重組NTD蛋白純度較高。
[0018]實(shí)施例2:動(dòng)物免疫與樣品收集:
[0019]以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將純化后的重組蛋白免疫小鼠，以檢測(cè)其所誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具體的免疫方案如下
[0020]選取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，圖3所示隨機(jī)分為3組，每組12只，分別肌肉注射免疫重組NTD蛋白5ug，1ug或單獨(dú)佐劑。如圖4所示，小鼠共免疫3次，間隔4周。每次免疫后2周，小鼠麻醉后內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，用于總IgG抗體和中和抗體的檢測(cè)。免疫后14周，每組隨機(jī)抽取6只小鼠，處死后分離脾臟淋巴細(xì)胞。用于檢測(cè)疫苗所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫后22周，處死剩余小鼠，分離血清以及脾臟淋巴細(xì)胞。用于疫苗誘導(dǎo)的長(zhǎng)效免疫效果檢測(cè)。
[0021]實(shí)施例3:免疫血清抗原特異性抗體的檢測(cè):
[0022]免疫血清抗原特異性IgG的ELISA測(cè)定:采用重組NTD蛋白包被ELISA板，10ng/孔。將免疫血清用稀釋液從1: 100作倍比稀釋，二抗為辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗，以未免疫小鼠血清稀釋后檢測(cè)的A450/630值的平均值的2.1倍作為界值。免疫后2周各組小鼠血清IgG滴度較低，免疫后6周血清IgG滴度明顯升高，見圖5。由圖可見，免疫后6周，高低劑量組重組NTD蛋白均誘導(dǎo)了高水平的IgG抗體應(yīng)答；免疫后10周，高低劑量組重組NTD蛋白均誘導(dǎo)了更高水平的IgG抗體應(yīng)答。但和免疫后6周比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。即高低劑量重組NTD蛋白經(jīng)肌肉注射二針可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效的IgG應(yīng)答。
[0023]實(shí)施例4.免疫血清中和抗體的檢測(cè):
[0024]4.1假病毒中和實(shí)驗(yàn):
[0025]免疫小鼠血清以PBS進(jìn)行倍比稀釋，各取50ul與等體積的MERS-CoV假病毒懸液(病毒含量為200TCID50)混勻，37°C孵育Ih后加入于96孔培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行感染。37°C 5% C0J?育48h后，將所感染的細(xì)胞裂解并進(jìn)行熒光素酶活性分析。每個(gè)樣本均做3孔進(jìn)行重復(fù)，避免誤差。血清的中和活性采用以下計(jì)算方法獲得:
[0026]將陰性對(duì)照血清與MERS-CoV假病毒懸液共孵育所獲得的相對(duì)熒光素酶讀值作為RLUl，以免疫血清與MERS-CoV假病毒懸液共孵育所獲得的相對(duì)熒光素酶讀值作為RLU2，則各血清的中和率(Neutralisat1n Rate)NR = (RLU1-RLU2)/RLUl。同 IgG 檢測(cè)結(jié)果一致，免疫后2周血清未檢測(cè)到中和抗體，免疫后6周血清中和抗體滴度亦較低。免疫后10周如圖7所示，高低劑量組重組NTD蛋白均誘導(dǎo)了高水平的中和抗體，且該中和抗體可持續(xù)至少到免疫后22w而無(wú)明顯下降(圖8)。
[0027]實(shí)施例4.免疫小鼠細(xì)胞免疫水平檢測(cè):
[0028]采用ELISpot實(shí)驗(yàn):處死小鼠，無(wú)菌條件下分離脾細(xì)胞，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度至lX107/ml。用稀釋的PurifiedAnt1-mouse IFN-γ包被ELISpot板過(guò)夜。將小鼠淋巴細(xì)胞(5Χ105/孔)加入到包含抗原肽的肽池(終濃度4 μ g/ml)中刺激24h后，用B1tinylatedAnt1-mouse IFN-γ做二抗，ELISP0T計(jì)數(shù)儀讀數(shù)分析產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)。如圖9所示，免疫后14w高低劑量組重組NTD蛋白經(jīng)肌肉注射免疫小鼠可誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，且該細(xì)胞免疫應(yīng)答可持續(xù)到至少免疫后22w而無(wú)明顯下降。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.本發(fā)明所述的應(yīng)用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)并純化MERS-CoV棘突蛋白N端的一段稱為N端結(jié)構(gòu)域即NTD的重組蛋白。2.依據(jù)權(quán)利要求1，該重組蛋白單獨(dú)或者和其他疫苗聯(lián)合應(yīng)用用于預(yù)防或治療MERS-CoV 感染。
【專利摘要】本發(fā)明首先應(yīng)用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)MERS-CoV棘突蛋白N端的一段稱為N端結(jié)構(gòu)域(N？terminal？domain，NTD)的重組蛋白，純化后分別以高低兩種劑量肌肉注射免疫B？ALB/c小鼠，通過(guò)ELISPot、IgG及中和抗體檢測(cè)，證明兩種劑量的重組亞單位疫苗均有較強(qiáng)的免疫原性，可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效而持久(至少16周)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可作為理想的疫苗用于預(yù)防或治療MERS-CoV感染。
【IPC分類】A61P31/14, A61K39/215
【公開號(hào)】CN105169384
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】譚文杰, 高福, 嚴(yán)景華, 藍(lán)佳明, 鄧瑤, 胡亞偉
【申請(qǐng)人】中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年7月22日