專利名稱：具有長壽命m態(tài)的化學修飾野生型細菌視紫紅質－聚乙烯醇薄膜的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于薄膜制備領域，特別涉及利用diaza-15-crown-5作為化學添加劑制備具有長壽命M態(tài)的野生型細菌視紫紅質-聚乙烯醇(BRWT-PVA)薄膜的方法。
背景技術：
細菌視紫紅質(bacteriorhodopsin，BR)是一種存在于嗜鹽菌紫膜中的蛋白質，它具有光致變色的特性，這使得它在新型光學信息存儲材料方面有很大的應用前景。選擇合適的載體，制備分散均勻的BR光學薄膜，可以實現(xiàn)二維信息存儲，但對薄膜的質量有很高的要求，主要指標包括薄膜的厚度、均勻性、光密度等，這是因為BR薄膜的質量將會直接影響所獲信息的效果，如光散射、清晰度、分辨率等。除了BR原材料因素之外，其它條件如各種添加材料、膜保護材料及采用的制膜方式等都會對薄膜的質量產生很大的影響，如1.Wu，S.；Ellerby，L.M.；Cohan，J.S.et al.Bacteriorhodopsinencapsulated in transparent sol-gel glass-a new biomaterial，Chem.Mater.1993，5，115-120；2.Birge，R.R.；Gillespie，N.B.；Izaguirre，E.W.et al.Biomolecular ElectronicsProtein-Based AssociativeProcessors and Volumetric Memories，J.Phys.Chem.B 1999，103，10746-10766；3.Hampp，N.Bacteriorhodopsin as a Photochromic RetinalProtein for Optical Memories，Chem.Rrev.2000，100，1755-1776.所報道的。
本發(fā)明人曾利用1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane(diaza-15-crown-5)等作為化學添加劑，將BRWT中間態(tài)M態(tài)的壽命從10ms延長到568s，延長超過4個數(shù)量級，如Bing Liang，Baofang Li，Long Jiang，Study on Long Lifetime of M-state in Chemically ModifiedBacteriorhodopsin Film，Chem.Mater.2001，13，2746-2748所報道的，這從理論上極大的拓寬了BR材料的應用范圍。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有長壽命M態(tài)的化學修飾BRWT-PVA薄膜的制備方法，利用PVA作為聚合物載體制備得到具有長壽命M態(tài)的化學修飾BRWT薄膜，這種薄膜的表面平整、BR分散均勻，使它可以應用在空間光調制器、全息記錄、模式識別和信息存儲等領域，極大的拓寬了BR材料的應用范圍。
本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的選用分子量為22,000～26,000，醇解度為98％的分析純聚乙烯醇(poly(vinyl alcohol)，PVA)作為載體，將它溶解在三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxylmethyl)-aminomethane，tris)緩沖液中，然后與BRWT懸浮液以及diaza-15-crown-5溶液充分混合得到一混合懸浮液，在一定的溫度和濕度條件下，將混合懸浮液在親水性的石英片或K9玻璃片表面干燥成膜，得到了薄膜表面平整、BR分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。本發(fā)明主要包括，石英片表面的親水化處理、PVA-tris溶液與BRWT懸浮液和添加劑diaza-15-crown-5溶液的充分混合、混合懸浮液在適當溫度和濕度條件下干燥成膜等幾個步驟。
具體實施方法步驟為(1).基底石英片或K9玻璃片表面的親水化處理本發(fā)明人選用石英片或K9玻璃片作為基底制備BRWT薄膜，使用的石英片或K9玻璃片標準為厚度1mm，直徑20mm，表面精度λ/2，首先將其表面處理成親水性，以使得薄膜可以更好的附著在其表面。處理過程如下a.將洗凈的石英片或K9玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24小時；b.用二次水沖洗后，分別在丙酮、乙醇和二次水中各自超聲清洗15～20分鐘；c.處理好的石英片或K9玻璃片放入異丙醇中保存待用，此時的石英片或K9玻璃片表面呈親水性。
(2).將PVA溶解于tris緩沖液中選用分子量為22,000～26,000，醇解度為98％的分析純聚乙烯醇(PVA)作為載體，將10～15g PVA浸泡于100ml濃度為50mmol/L的Tris緩沖溶液中溶脹24小時，然后加熱至沸騰(回流)，直至所有的PVA溶解，溶液變?yōu)橥该?，得到PVA與tris緩沖液重量體積百分比濃度(W/V)10～15％的PVA-tris溶液，溶液的pH值為8.0。
(3).BRWT分散、超聲野生型BR利用文獻Oesterhelt D.；Stoeckenius W.，Meth.Enzymol1974，31，667所報道的方法制備，得到濃度范圍在20～28mg/ml的BRWT懸浮液，為了降低碎片的尺寸以減少測量時的光散射，懸浮液利用JY92-II型，寧波產超聲波細胞粉碎機，采用Φ2探頭超聲破碎處理，超聲功率300Hz，超聲時間1s，間隔5s，超聲30次，用冰水混合液冷卻防止熱量集中使BR蛋白變性，最終得到的碎片直徑μ＜200nm；(4).BRWT+PVA-tris混合分別取步驟(3)中所得到的BRWT懸浮液0.1～0.15ml與步驟(2)中所得到的PVA-tris溶液0.15～0.25ml，攪拌混合均勻(利用旋渦混合器充分振蕩混合均勻)。BRWT懸浮液的用量決定了最終薄膜的光密度，盡量提高BRWT懸浮液的濃度可以減少體積用量，PVA-tris與BRWT懸浮液的體積比為3∶2～5∶3，過多的PVA用量會導致薄膜厚度增加，太少則不能均勻分散BR。
(5).加入化學添加劑diaza-15-crown-5化學添加劑diaza-15-crown-5為分析純，購自Acros公司，將其配成水溶液，濃度范圍40～100mg/ml，在攪拌下(在旋渦混合器上振蕩混合)向步驟(4)得到的混合液中逐滴加入diaza-15-crown-5溶液，這樣可以避免局部添加劑過量，防止過量添加劑漂白BR蛋白，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩爾比為1∶100～1∶250(M態(tài)的壽命取決于添加劑diaza-15-crown-5的添加量，最大添加量為二者摩爾比為1∶250，具體添加量與M態(tài)壽命的關系如Bing Liang，Baofang Li，Long Jiang，Study on Long Lifetime of M-statein Chemically Modified Bacteriorhodopsin Film，Chem.Mater.2001，13，2746-2748的報道)。
(6).混合懸浮液超聲、過濾步驟(5)得到的混合懸浮液pH＝8.0～8.5，混合液利用JY92-II型，寧波產超聲波細胞粉碎機，采用Φ2探頭超聲破碎混合處理，超聲功率200Hz，超聲時間1s，間隔10s，共超聲20次，用冰水混合液冷卻防止熱量集中使BR蛋白變性，超聲期間每超聲破碎5次將裝有混合液的離心管從冰水中取出，在室溫條件下(20～25℃)放置1min，防止由于過冷而使PVA凝結，然后利用5μm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡。
(7).去除表層氣泡步驟(6)得到的過濾后的混合液在室溫條件下(20～25℃)靜置30min，使混合液中的氣泡浮于表面，然后刮去表層的氣泡。
(8).干燥成膜在溫度為2～4℃條件下，容積為5升的干燥器里面放入50～100ml飽和MgCl2溶液和相對量為20～40g變色硅膠，使干燥器內的相對濕度保持在40～50％范圍內，調節(jié)里面平板的水平，將親水性的石英片或K9玻璃片放置在平板的表面，步驟(7)得到的混合液倒在石英片或K9玻璃片表面，自然鋪展后，然后在溫度為2～4℃，相對濕度40～50％條件下靜置干燥24小時，最終得到表面平整、分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。
(9).測光密度及M態(tài)壽命得到的薄膜具有較高光密度(見附圖1)，M態(tài)的衰減時間超過40min(見附圖2)，表觀照片(見附圖3)。
本發(fā)明中所述的石英片或K9玻璃片表面精度λ/2，λ為光的波長。
所述的用于溶解PVA的緩沖溶液是50mmol/L的tris溶液，其pH＝8.0。
所述的PVA-tris溶液的濃度為PVA與tris緩沖液重量/體積百分比(W/V)為10～15％。
所述的BRWT懸浮液濃度范圍20～28mg/ml，盡可能的增大其濃度，這樣可以減少所用體積。
所述的PVA-tris與BRWT懸浮液的體積比為3∶2～5∶3，過多的PVA用量會導致薄膜厚度增加，太少則不能均勻分散BRWT。
所述的添加劑diaza-15-crown-5溶液濃度范圍40～100mg/ml，具體濃度用量與所需達到的添加量以及最終需要達到的光密度有關。
所述的BRWT+PVA-tris+diaza-15-crown-5混合懸浮液，其pH＝8.0～8.5。
所述的干燥器容積為5升，使用的干燥劑為50～100ml飽和MgCl2溶液和相對量為20～40g變色硅膠的組合，使用溫度為2～4℃。
所述的干燥條件為溫度2～4℃，相對濕度40～50％，干燥時間24小時。
以(聚乙烯醇)PVA作為聚合物載體，薄膜的光密度對其應用也有很大的影響，較大的光密度有利于產生更高的光對比度等。本發(fā)明人對成膜的條件及過程進行了研究，得到了具有較高光密度，表面平整、BR分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。
本發(fā)明的最大特點是可以得到具有長壽命M態(tài)，較大光密度(≈1.0)，表面平整、分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜，薄膜的光密度和厚度可以通過改變BRWT懸浮液和PVA-tris溶液的用量來調節(jié)。


圖1.本發(fā)明實施例4化學修飾BRWT-PVA薄膜的吸收光譜；圖2.本發(fā)明實施例4化學修飾BRWT-PVA薄膜M態(tài)衰減過程；圖3.本發(fā)明實施例4薄膜照片。
具體實施例方式
實施例1.
選用石英片作為基底制備BR薄膜，使用的石英片標準為厚度1mm，直徑20mm，表面精度λ/2。a.將洗凈的石英片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24小時；b.用二次水沖洗后，分別在丙酮、乙醇和二次水中各自超聲清洗15～20分鐘；c.處理好的石英片放入異丙醇中保存待用，此時的石英片表面呈親水性。
將經超聲破碎處理(μ＜200nm)、濃度為26mg/ml的BRWT懸浮液0.15ml與0.25ml的PVA-tris溶液利用旋渦混合器充分混合均勻，tris緩沖液的濃度為50mmol/L，PVA-tris的重量體積百分比濃度為15％，PVA-tris與BRWT懸浮液的體積比為5∶3；在旋渦混合器上一邊振蕩混合，一邊向里面逐滴加入80mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.04ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩爾比為1∶150，得到的混合懸浮液pH為8.2左右，超聲破碎混合處理，超聲期間每超聲破碎5次將裝有混合液的離心管從冰水中取出，在室溫條件下(20～25℃)放置1min，防止由于過冷而使PVA凝結，然后利用5μm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡，過濾后的混合液在室溫條件下(20～25℃)靜置30min，使混合液中的氣泡浮于表面，然后刮去表層的氣泡。在溫度為2～4℃條件下，容積為5升的干燥器里面放入50～100ml飽和MgCl2溶液和20～40g變色硅膠，將混合液倒在水平石英片表面，自然鋪展后，保持溫度在2～4℃，相對濕度40～50％條件下靜置干燥24小時，最終得到表面平整、分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。得到的薄膜具有較高光密度(見附圖1)，M態(tài)的衰減時間超過15min(見附圖2)，表觀照片(見附圖3)。
實施例2.
選用石英片作為基底制備BR薄膜，使用的石英片標準為厚度1mm，直徑20mm，表面精度λ/2。a.將洗凈的石英片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24小時；b.用二次水沖洗后，分別在丙酮、乙醇和二次水中各自超聲清洗15～20分鐘；c.處理好的石英片放入異丙醇中保存待用，此時的石英片表面呈親水性。
將經超聲破碎處理(μ＜200nm)、濃度為28mg/ml的BRWT懸浮液0.1ml與0.15ml的PVA-tris溶液利用旋渦混合器充分混合均勻，tris緩沖液的濃度為50mmol/L，PVA-tris的重量體積百分比濃度為10％，PVA-tris與BRWT懸浮液的體積比為3∶2；在旋渦混合器上一邊振蕩混合，一邊向里面逐滴加入40mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.06ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩爾比為1∶100，得到的混合懸浮液pH為8.0左右，超聲破碎混合處理，超聲期間每超聲破碎5次將裝有混合液的離心管從冰水中取出，在室溫條件下(20～25℃)放置1min，防止由于過冷而使PVA凝結，然后利用5μm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡，過濾后的混合液在室溫條件下(20～25℃)靜置30min，使混合液中的氣泡浮于表面，然后刮去表層的氣泡。在溫度2～4℃條件下，容積為5升的干燥器里面放入50～100ml飽和MgCl2溶液和20～40g變色硅膠，將混合液倒在水平石英片表面，自然鋪展后，保持溫度在2～4℃，相對濕度40～50％條件下靜置干燥24小時，最終得到表面平整、分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。
實施例3.
選用K9玻璃片作為基底制備BR薄膜，使用的K9玻璃片標準為厚度1mm，直徑20mm，表面精度λ/2，a.將洗凈的K9玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24小時；b.用二次水沖洗后，分別在丙酮、乙醇和二次水中各自超聲清洗15～20分鐘；c.處理好的K9玻璃片放入異丙醇中保存待用，此時的K9玻璃片表面呈親水性。
將經超聲破碎處理(μ＜200nm)、濃度為20mg/ml的BRWT懸浮液0.15ml與0.25ml的PVA-tris溶液利用旋渦混合器充分混合均勻，tris緩沖液的濃度為50mmol/L，PVA-tris的重量體積百分比濃度為15％，PVA-tris與BRWT懸浮液的體積比為5∶3；在旋渦混合器上一邊振蕩混合，一邊向里面逐滴加入100mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.05ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩爾數(shù)之比為1∶200，得到的混合懸浮液pH為8.3左右，超聲破碎混合處理，超聲期間每超聲破碎5次將裝有混合液的離心管從冰水中取出，在室溫條件下(20～25℃)放置1min，防止由于過冷而使PVA凝結，然后利用5μm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡，過濾后的混合液在室溫條件下(20～25℃)靜置30min，使混合液中的氣泡浮于表面，然后刮去表層的氣泡。在溫度2～4℃條件下，容積為5升的干燥器里面放入50～100ml飽和MgCl2溶液和20～40g變色硅膠，將混合液倒在K9玻璃片表面，自然鋪展后，保持溫度在2～4℃，相對濕度40～50％條件下靜置干燥24小時，最終得到表面平整、分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。
實施例4.
選用K9玻璃片作為基底制備BR薄膜，使用的K9玻璃片標準為厚度1mm，直徑20mm，表面精度λ/2，a.將洗凈的K9玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡24小時；b.用二次水沖洗后，分別在丙酮、乙醇和二次水中各自超聲清洗15～20分鐘；c.處理好的K9玻璃片放入異丙醇中保存待用，此時的K9玻璃片表面呈親水性。
將經超聲破碎處理(μ＜200nm)、濃度為26mg/ml的BRWT懸浮液0.15ml與0.25ml的PVA-tris溶液利用旋渦混合器充分混合均勻，tris緩沖液的濃度為50 mmol/L，PVA-tris的重量體積百分比濃度為15％，PVA-tris與BRWT懸浮液的體積比為5∶3；在旋渦混合器上一邊振蕩混合，一邊向里面逐滴加入100mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.08ml，得到的BRWT∶diaza-15-crown-5摩爾數(shù)之比為1∶250，得到的混合懸浮液pH為8.5左右，超聲破碎混合處理，超聲期間每超聲破碎5次將裝有混合液的離心管從冰水中取出，在室溫條件下(20～25℃)放置1min，防止由于過冷而使PVA凝結，然后利用5μm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡，過濾后的混合液在室溫條件下(20～25℃)靜置30min，使混合液中的氣泡浮于表面，然后刮去表層的氣泡。在溫度2～4℃條件下，容積為5升的干燥器里面放入50～100ml飽和MgCl2溶液和20～40g變色硅膠，將混合液倒在K9玻璃片表面，自然鋪展后，保持溫度在2～4℃，相對濕度40～50％條件下靜置干燥24小時，最終得到表面平整、分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。
權利要求
1.一種具有長壽命M態(tài)的化學修飾BRWT-PVA薄膜的制備方法，其特征是選用分子量為22,000～26,000，醇解度為98％的分析純聚乙烯醇作為載體，將它溶解在三羥甲基氨基甲烷緩沖液中得到聚乙烯醇-三羥甲基氨基甲烷溶液，將聚乙烯醇-三羥甲基氨基甲烷溶液與BRWT懸浮液以及diaza-15-crown-5溶液充分混合得到一混合懸浮液，混合懸浮液在親水性的石英片或K9玻璃片表面干燥成膜，得到了薄膜表面平整、細菌視紫紅質分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的親水性的石英片或K9玻璃片是通過將洗凈的表面精度為λ/2的石英片或K9玻璃片放入飽和KOH的甲醇溶液中浸泡后，用二次水沖洗，分別在丙酮、乙醇和二次水中各自超聲清洗后得到的，其中λ為光的波長。
3.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的混合懸浮液是將經超聲破碎處理的BRWT懸浮液，碎片直徑μ＜200nm，與聚乙烯醇-三羥甲基氨基甲烷溶液以體積比為3∶2～5∶3攪拌混合均勻得到一混合液，在攪拌下向混合液中滴加diaza-15-crown-5溶液，得到的BRWTdiaza-15-crown-5摩爾數(shù)比為1∶100～1∶250的混合懸浮液；所述的三羥甲基氨基甲烷緩沖液的濃度為50mmol/L；所述的聚乙烯醇-三羥甲基氨基甲烷溶液的濃度為聚乙烯醇與三羥甲基氨基甲烷緩沖液重量/體積百分比為10～15％；所述的BRWT懸浮液的濃度為20～28mg/ml。
4.如權利要求1或3所述的方法，其特征是所述的diaza-15-crown-5溶液濃度為40～100mg/ml。
5.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的成膜是將混合懸浮液超聲破碎混合處理后，用5μm的混合纖維素酯微孔濾膜過濾，去除混合液中殘留的大顆粒和氣泡；過濾后的混合懸浮液在室溫條件下靜置，使混合懸浮液中的氣泡浮于表面，然后刮去表層的氣泡；將混合懸浮液倒在石英片或K9玻璃片表面鋪展，在溫度為2～4℃，相對濕度40～50％條件下靜置干燥，最終得到薄膜表面平整、細菌視紫紅質分散均勻的化學修飾BRWT-PVA薄膜。
6.如權利要求1、3或5所述的方法，其特征是所述的BRWT+PVA-tris+diaza-15-crown-5混合懸浮液pH＝8.0～8.5。
7.如權利要求5所述的方法，其特征是所述的超聲破碎混合處理是超聲期間要將裝有混合懸浮液的離心管從冰水中拿出，在室溫條件下放置一段時間，防止由于過冷而使聚乙烯醇凝結。
8.如權利要求5所述的方法，其特征是所述的干燥使用的干燥劑為50～100ml飽和MgCl2溶液和相對量為20～40g變色硅膠的組合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于薄膜制備領域，特別涉及利用diaza－15－crown－5作為化學添加劑制備具有長壽命M態(tài)的BR
文檔編號G11B7/24GK1567444SQ0313768
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月19日 優(yōu)先權日2003年6月19日
發(fā)明者李寶芳, 梁冰, 張建平, 張國艷 申請人:中國科學院化學研究所