本發(fā)明涉及一種模型解析方法，具體涉及一種基于saxs的蛋白質(zhì)與表面活性劑復(fù)合物模型解析方法，屬于生物化學(xué)、生物物理、物理化學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

sds對蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)及聚集作用或纖維化所呈現(xiàn)的雙重調(diào)控行為，可作為分子伴侶輔助蛋白質(zhì)復(fù)性，對于更好理解蛋白質(zhì)去折疊與重折疊過程及其機(jī)理、發(fā)展表面活性劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)具有重要意義，因此表面活性劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊、去折疊及重折疊的機(jī)理與復(fù)合物模型的研究已成為人們越來越重視的課題。然而，sds調(diào)控蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)以及聚集/纖維化行為機(jī)制目前還沒有統(tǒng)一和完善；溶液組分、環(huán)境因素及熱動力學(xué)對復(fù)合物形貌尺寸影響極其顯著，致使電鏡技術(shù)直觀觀測復(fù)合物形態(tài)難度較大，很難精確獲得全部結(jié)構(gòu)信息，需要準(zhǔn)確的理論模型加以輔助支撐。

小角x射線散射(smallanglex-rayscattering,saxs)技術(shù)在研究表面活性劑與蛋白質(zhì)的亞微觀結(jié)構(gòu)(數(shù)納米至數(shù)百納米)方面具有獨特的優(yōu)勢，是原位、動態(tài)監(jiān)控溶液中蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)變化的一種重要手段。具體應(yīng)用主要包括以下幾個方面：

1.通過guinier散射測定復(fù)合物膠團(tuán)、膠粒的形狀、粒度以及粒度分布等；

2.復(fù)合物體系中的分子運動和相變；

3.通過porod-debye相關(guān)函數(shù)法研究復(fù)合物多相體系的相關(guān)長度、界面層厚度和總表面積等；

4.通過絕對強(qiáng)度的測量，測定蛋白質(zhì)的分子量；

5.根據(jù)不同形狀(球形、橢球形、棒狀、盤型等)粒子的形狀因子及散射強(qiáng)度克通過相關(guān)公式計算，通過采用具有一定普適性的受限自動化散射曲線擬合方法，獲得動態(tài)模型參數(shù)，構(gòu)建模型結(jié)構(gòu)；最后可原位、無損、無需純化和單分散蛋白樣品來表征復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

目前較為常用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析算法和軟件包括，crysol，ornl-sas，fast-saxs，foxs，saxs3d等。無論是通過saxs實驗獲得的散射強(qiáng)度曲線的結(jié)構(gòu)和解析，還是通過模擬結(jié)構(gòu)計算擬合實驗散射強(qiáng)度曲線來解析蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，都是蛋白質(zhì)或復(fù)合物的不同結(jié)構(gòu)對散射強(qiáng)度曲線對具有不同“特征指紋”。

雖然利用從頭計算法和不同軟件通過對實驗散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)曲線的擬合來構(gòu)建高分辨率三維結(jié)構(gòu)模型，可以進(jìn)一步確立蛋白質(zhì)主體結(jié)構(gòu)，另外在從頭計算法的基礎(chǔ)上，利用球形剛體建模方法將不同結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行重組，對每個組合結(jié)構(gòu)計算散射強(qiáng)度曲線，并與實驗獲得曲線進(jìn)行比對，重復(fù)結(jié)構(gòu)片段組裝與曲線擬合過程，直到獲得滿意的匹配度，最終獲得完整的蛋白結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)與表面活性劑相互作用過程中，由于蛋白溶液濃度與x射線光散射密度較低，而表面活性劑的極性親水基團(tuán)和非極性的疏水基團(tuán)的散射強(qiáng)度較大，表面活性劑的散射強(qiáng)度會覆蓋蛋白質(zhì)的散射強(qiáng)度，在計算和擬合散射曲線獲得復(fù)合物模型過程中，表面活性劑的散射強(qiáng)度會對結(jié)果引入較大干擾和誤差，獲得的理論結(jié)構(gòu)模型與實際復(fù)合物結(jié)構(gòu)差異非常大。

另外，蛋白在某些表面活性劑(如sds)膠團(tuán)存在條件下，蛋白呈折疊態(tài)，α-螺旋結(jié)構(gòu)增加；但sds在臨界膠束濃度(cmc)以下，蛋白質(zhì)α-螺旋含量降低、β-折疊結(jié)構(gòu)升高，蛋白呈去折疊態(tài)，伴隨小球狀淀粉質(zhì)β-多肽聚集體產(chǎn)生。在sds誘導(dǎo)β-多肽淀粉樣纖維化或調(diào)控蛋白及多肽聚集作用同樣具有雙重行為。而且盡管sds誘導(dǎo)蛋白質(zhì)或多肽呈現(xiàn)增加的α-螺旋結(jié)構(gòu)折疊態(tài)，但長時間的培育作用(幾天到幾個星期)促進(jìn)生成纖維體或聚集體，可能復(fù)合物通過暴露在外的脂肪酸鏈的疏水作用而發(fā)生聚集作用。sds誘導(dǎo)球狀蛋白質(zhì)失活及復(fù)性過程不同階段單體復(fù)合物和聚集體結(jié)構(gòu)特征。而因為表面活性劑與蛋白質(zhì)散射強(qiáng)度的較大差異，現(xiàn)有軟件及計算方法無法對表面活性劑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集作用和聚集體復(fù)合物模型進(jìn)行解析。

在蛋白質(zhì)復(fù)合物通用理論模型仍然確實的情況下，基于saxs建立具有普適性的適用于表面活性劑與蛋白質(zhì)單體和聚集體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的理論模型的計算解析方法，具有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種基于saxs的蛋白質(zhì)與表面活性劑復(fù)合物模型及解析方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點和不足。

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

作為本發(fā)明的第一方面，一種基于saxs的蛋白質(zhì)與表面活性劑復(fù)合物模型，其特征在于，模型的散射強(qiáng)度表達(dá)式為：

i(q)＝sc·nmic·[p(q)+<a(q)>²(s(q)-1)]+back(23)

sc為整體尺度因子，用于校正表面活性劑較小幅度的濃度變化，如表面活性劑濃度1mm-15mm，sc為1；

其中涉及計算參數(shù)有：溶劑電荷強(qiáng)度ρwtvt為表面活性劑疏水鏈的體積vh為表面活性劑極性基團(tuán)的體積nel(t)為表面活性劑疏水鏈的電荷數(shù)；nel(h)為表面活性劑極性基團(tuán)的電荷數(shù)；c為表面活性劑總濃度(mm)；cfree為未構(gòu)成膠團(tuán)表面活性劑的濃度(mm)，cprot為蛋白質(zhì)濃度；具體參數(shù)說明及計算方法詳見“實施方法”

可以選擇不同形狀因子，通過調(diào)整體系蛋白質(zhì)和表面活性劑類型的物理化學(xué)參數(shù)，采用具有普適性的受限自動化saxs曲線擬合方法，在絕對尺度和體系真實濃度下，解析蛋白質(zhì)與表面活性劑單體與聚集體復(fù)合物結(jié)構(gòu)參數(shù)；

根據(jù)saxs的球形、橢球形、棒狀、盤型等粒子的形狀因子及散射強(qiáng)度通過本發(fā)明中公式計算，利用受限自動化saxs曲線擬合實驗散射強(qiáng)度曲線，在絕對尺度和體系真實濃度下，解析蛋白質(zhì)與表面活性劑單體與聚集體復(fù)合物結(jié)構(gòu)參數(shù)，例如復(fù)合物外層半徑、內(nèi)核截面半徑、復(fù)合物體積、含水量，長軸與短軸半徑比、復(fù)合物中蛋白質(zhì)分子量等動態(tài)模型參數(shù)，

同時加入通過在計算公式中加入膠團(tuán)數(shù)量和膠團(tuán)間的距離等參數(shù)，能輕松靈活的計算和分析聚集態(tài)復(fù)合物結(jié)構(gòu)參數(shù)和理論模型特征。

尋找并優(yōu)化與實驗散射曲線最吻合方案，通過調(diào)整體系表面活性劑物理化學(xué)參數(shù)及濃度、蛋白質(zhì)濃度等逆向?qū)ι⑸淝€擬合調(diào)整誤差，獲得最佳理論曲線擬合數(shù)值，最終獲得可靠并完整蛋白質(zhì)與不同類型表面活性劑單體復(fù)合物結(jié)構(gòu)理論模型。

作為本發(fā)明的第二方面，一種基于saxs的蛋白質(zhì)與表面活性劑復(fù)合物模型的解析方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)蛋白質(zhì)與表面活性劑saxs數(shù)據(jù)的采集；

(2)saxs數(shù)據(jù)預(yù)處理與預(yù)分析；

(3)選擇不同形狀因子；

(4)選擇表面活性劑碳鏈長度、親水基體積等物理化學(xué)參數(shù)；

(5)輸入體系表面活性劑濃度、蛋白質(zhì)濃度；

(6)采用受限自動化saxs曲線擬合方法獲得最佳擬合結(jié)果，具體計算方法見下文；

(7)獲得單體態(tài)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型參數(shù)，同時加入膠團(tuán)數(shù)量和膠團(tuán)間的距離參數(shù)，以此獲得聚集態(tài)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型參數(shù)；

(8)判斷服復(fù)合物結(jié)構(gòu)合理性，調(diào)整參數(shù)，重新迭代計算；

(9)獲得結(jié)構(gòu)參數(shù)與理論模型，結(jié)束。

其中，步驟(3)中，所述選擇不同形狀因子為球形、橢球形、棒狀、核殼型。

參見圖3。

本發(fā)明的有益效果：

1、與現(xiàn)有計算方法和模擬軟件相比，本方法可以獲得蛋白質(zhì)與表面活性劑結(jié)合作用過程不同階段單體態(tài)和聚集態(tài)復(fù)合物結(jié)構(gòu)理論模型。

2、同時在絕對尺度下(即體系中蛋白質(zhì)與表面活性劑的真實濃度)可以解析蛋白質(zhì)與表面活性劑單體與聚集體復(fù)合物結(jié)構(gòu)特點并獲得結(jié)構(gòu)參數(shù)，例如復(fù)合物半徑、截面半徑、蛋白質(zhì)分子量、體積、含水量，長軸與短軸半徑比、聚集體中膠束數(shù)量、聚集體中膠束的距離等，用以描述復(fù)合物結(jié)構(gòu)特點。

以表1和2為例說明該模擬方法獲得復(fù)合物單體態(tài)和聚集態(tài)結(jié)構(gòu)模型參數(shù)。

表1不同濃度ctab與乳清蛋白復(fù)合物saxs模型計算結(jié)果

在saxs測試中蛋白質(zhì)濃度為0.1mm，ctab與蛋白質(zhì)摩爾比以c:b表示.

^actab分子結(jié)合數(shù)/每復(fù)合物；

^b殼的厚度；

^c核半徑；

^d長軸與短軸半徑比.ε＝roverall/rin；

^e殼外含水量；

^f蛋白分子量/每復(fù)合物；

^g復(fù)合物體積；

^#未固定參數(shù)；

^##計算值；

*固定參數(shù)；

蛋白橢圓模型。

表2ctab與乳清蛋白不同結(jié)合時間的聚集態(tài)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型參數(shù)，nmic:聚集體中膠束數(shù)量；dmic:聚集體中膠束間直線距離；其他參數(shù)與表1中相同。

附圖說明

圖1a為sds膠團(tuán)與蛋白質(zhì)復(fù)合物不同結(jié)構(gòu)理論模型。

圖1b為核殼結(jié)構(gòu)模型擬合sds-溶菌酶聚集體散射曲線結(jié)果。

圖2a為核殼結(jié)構(gòu)模型擬合sds-溶菌酶復(fù)合物單體結(jié)構(gòu)參數(shù)結(jié)果。

圖2b為核殼結(jié)構(gòu)模型擬合sds-溶菌酶復(fù)合物單體曲線結(jié)果。

圖3為本發(fā)明的流程圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例1

該計算和模擬方法基于絕對尺度，增加了結(jié)果的準(zhǔn)確性。假設(shè)復(fù)合物顆粒具有較小的寬高比，散射強(qiáng)度i(q)為：

i(q)＝<a(q)²〉+<a(q)>²[s(q)-1],(1)

其中a(q)為顆粒散射幅度，s(q)為結(jié)構(gòu)因子，描述粒子間的相互作用、聚集和聚集體結(jié)構(gòu)等信息，<>表示所有取向的平均值，對于蛋白質(zhì)-表面活性劑復(fù)合物采用膠團(tuán)修飾的核殼模型，其中表面活性劑疏水鏈構(gòu)成內(nèi)核，蛋白質(zhì)與表面活性劑極性基團(tuán)構(gòu)成殼，蛋白質(zhì)分布在整個殼上，因此對于顆粒的散射幅度為：

a(q)＝δρshell·vtot·φ(qrout)+(δρcore-δρshell)·vcore·φ(qrin).(2)

散射界面為散射幅度與因子的乘積，其中σ為高斯分布涂層界面的寬度，φ(qr)是對于球體散射幅度的校正值：

假設(shè)復(fù)合物具有橢圓形形狀，那么形狀因子p(q)＝<a(q)²>：

其中θ為散射矢量(q)和橢圓形主軸間的夾角，參數(shù)rin,rout和ε分別為核殼型復(fù)合物的核內(nèi)半徑，外半徑和橢圓形物體的寬高比，其中外半徑rout＝rin+t，寬高比其中t為核殼型復(fù)合物的外殼厚度。采用不受限制的寬高比以維持外殼厚度為常數(shù)，δρshell為由表面活性劑的極性基團(tuán)與蛋白質(zhì)組成的外殼的散射密度差，δρcore為由表面活性劑疏水鏈組成的內(nèi)核散射密度差，vcore和vtot分別為內(nèi)核體積和復(fù)合物總體積(vtot＝vcore+vshell)。

對于鏈珠型復(fù)合物具體來說，需要結(jié)構(gòu)因子加以描述，nmic為聚集體中膠團(tuán)的數(shù)量，dmic為連續(xù)膠團(tuán)間的距離，聚集體的結(jié)構(gòu)因子為：

基于絕對尺度下的散射強(qiáng)度計算方法，對于不同表面活性劑和蛋白質(zhì)具有不同的電荷參數(shù)，例如sds的疏水鏈和極性基團(tuán)的電荷數(shù)分別為nel(t)＝97e，nel(h)＝59e，疏水鏈和極性基團(tuán)的基團(tuán)分別為和¹用這些參數(shù)可以獲得疏水鏈的電荷強(qiáng)度和極性基團(tuán)的電荷強(qiáng)度，分別為：

溶劑，如水的電荷強(qiáng)度作為參比，因此疏水鏈的電荷強(qiáng)度差和極性基團(tuán)的電荷強(qiáng)度差分別為：

δρt＝ρt-ρwt,(8)

δρh＝ρh-ρwt.(9)

內(nèi)核體積為：

復(fù)合物中聚集體的數(shù)量為

構(gòu)成膠團(tuán)的濃度為表面活性劑總濃度與未結(jié)合蛋白表面活性劑濃度差：

c＝c-cfree,(12)

每立方厘米中膠團(tuán)所含有表面活性劑的分子數(shù)為(分子數(shù)/cm³):

n＝(c-cfree)·10^-6·na,(13)

其中“na”為阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×10²³)，因此每立方厘米中膠束數(shù)量為(膠束/cm³):

假設(shè)體系中所以蛋白與表面活性劑膠束構(gòu)成復(fù)合物，沒有結(jié)合的為游離蛋白，因此每膠團(tuán)中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量(g/膠束)為：

每克蛋白質(zhì)的平均對比散射強(qiáng)度差為除以經(jīng)典電荷半徑(thomson半徑)，rt＝2.82×10^-13cm，得到每克蛋白質(zhì)中電荷數(shù)，(電荷數(shù)/g)。因此每個膠團(tuán)中蛋白質(zhì)電荷差(電荷數(shù)/膠束)為:

假設(shè)蛋白質(zhì)位于復(fù)合物外殼，那么，復(fù)合物外殼總電荷為：

nel(shell)＝naggvhδρh+nel(prot).(17)

總體積為：

外殼體積為：

vshell＝vtot-vcore.(19)

外殼含水量由下式計算：

其中為蛋白質(zhì)特定體積，通常為因此外殼和內(nèi)核散射幅度對比之差為：

δρcore＝δρt·rt,(22)

其中scshell為尺度因子，用于校正外殼理論電荷強(qiáng)度差與實際系統(tǒng)中外殼理論電荷強(qiáng)度差，可作為外殼中基團(tuán)水合作用微小變化的標(biāo)志：

模型散射強(qiáng)度最終表達(dá)式為：

i(q)＝sc·nmic·[p(q)+<a(q)>²(s(q)-1)]+back(23)

sc為整體尺度因子，用于校正表面活性劑較小幅度的濃度變化。如果表面活性劑濃度變化不大，例如1mm-15mm，sc可以為1。溶劑電荷強(qiáng)度ρwt位vt為表面活性劑疏水鏈的體積vh為表面活性劑極性基團(tuán)的體積nel(t)為表面活性劑疏水鏈的電荷數(shù)；nel(h)為表面活性劑極性基團(tuán)的電荷數(shù)；c為表面活性劑總濃度(mm)；cfree為未構(gòu)成膠團(tuán)表面活性劑的濃度(mm)，cprot為蛋白質(zhì)濃度，這些絕對尺度參數(shù)根據(jù)實驗樣品對象不同，可任意修改。其余可變參數(shù)根據(jù)實驗情況調(diào)節(jié)。表面活性劑聚集數(shù)和蛋白質(zhì)質(zhì)量/每膠團(tuán)由計算方法得出。所有數(shù)據(jù)均在絕對尺度下擬合，包括蛋白質(zhì)和表面活性劑濃度，蛋白質(zhì)散射和表面活性劑強(qiáng)度等，這些都極大增加了模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性。附圖為sds與溶菌酶模擬結(jié)果，既可描述聚集體結(jié)構(gòu)(圖1a和圖1b)又可研究單體復(fù)合物結(jié)構(gòu)(圖2a和圖2b)，這為利用saxs建立表面活性劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型確立了一條可靠研究路線。

以上對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行了說明，但本發(fā)明并不以此為限，只要不脫離本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明還可以有各種變化。