本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)在微生物采油育種中的應(yīng)用領(lǐng)域，具體是關(guān)于一種分離自油藏的產(chǎn)生物表面活性劑的瓊氏不動(dòng)桿菌及其應(yīng)用，包括將該菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)表面活性劑、以及該菌種在提高原油采收率中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：石油開(kāi)采技術(shù)中，水驅(qū)是世界范圍內(nèi)廣泛使用的一種有效的提高原油采收率的開(kāi)采方式。然而，在水驅(qū)過(guò)后，地層中仍然殘留有大量的石油。化學(xué)驅(qū)、CO2泡沫驅(qū)，蒸汽驅(qū)等采油技術(shù)被用來(lái)提高原油采收率。然而，這些開(kāi)采技術(shù)需要更高的經(jīng)濟(jì)、能源成本，對(duì)環(huán)境也會(huì)造成破壞。微生物采油是一種成本低廉、環(huán)境友好三次采油技術(shù)，也受到越來(lái)越多人的關(guān)注，在油田應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。普遍認(rèn)為的微生物采油的機(jī)理有降低界面張力、潤(rùn)濕性反轉(zhuǎn)、微生物產(chǎn)氣、原油乳化、降黏等。其中有兩種機(jī)理被認(rèn)為是微生物采油的主要機(jī)理。其一是微生物代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑降低油水界面張力，促進(jìn)原油乳化，改善原油在地層中的流動(dòng)性能。另一機(jī)理是微生物代謝產(chǎn)生的表面活性劑能夠改變油層的潤(rùn)濕性。不管哪種機(jī)理，微生物代謝產(chǎn)生的表面活性劑是提高原有采收率的關(guān)鍵。在過(guò)去的幾十年里，許多文獻(xiàn)報(bào)道了許多不同類型的生物表面活性劑及其產(chǎn)生菌。生物代謝產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)通常被分為兩大類，一類是分子量相對(duì)較小的生物表面活性劑，一類是分子量相對(duì)較大的生物乳化劑。代謝產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物主要有Pseudomonas、Bacillus、Rhodococcus、Nocardia等，主要代謝產(chǎn)物為糖脂、脂肽等類型的生物表面活性劑。代謝生物乳化劑的微生物主要有Acinetobacter、Bacillus、Geobacillus等，主要的代謝產(chǎn)物有糖蛋白、脂多糖等類型的生物乳化劑。這些代謝產(chǎn)物在微生物采油中占有重要的地位。在不同的油藏中，不同的微生物占據(jù)主導(dǎo)地位，在進(jìn)行微生物采油過(guò)程中，不同的油藏對(duì)菌種也有一定的要求，分離自油藏的微生物，能夠更好的適應(yīng)油藏環(huán)境，也被廣泛的應(yīng)用于微生物采油，許多分離自油藏的微生物能夠降解原油并代謝產(chǎn)生生物表面活性劑，常見(jiàn)的屬有Pseudomonas，Bacillus，Rhodococcus，Arthrobacter。然而，盡管有報(bào)道不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter在油藏系統(tǒng)中普遍存在，但是到目前為止還沒(méi)有分離自油藏系統(tǒng)的Acinetobacterjunii相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)微生物采油現(xiàn)狀，基于微生物采油的機(jī)理，提供一株能產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，該菌株能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，具有較好的乳化活性及降解飽和烷烴能力。本發(fā)明提供了一株能產(chǎn)生物表面活性劑的瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)菌株，其能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，具有較好的乳化活性，且該菌株具有顯著的降解飽和烷烴特別是C18、C19、C21、C22、C23、C26、C28正構(gòu)烷烴的能力。本發(fā)明提供的該瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)菌株命名為BD，該菌株已于2016年10月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)：CGMCCNo.13206。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明還提供了一種瓊氏不動(dòng)桿菌制劑，該瓊氏不動(dòng)桿菌制劑中含有保藏編號(hào)為CGMCCNo.13206的瓊氏不動(dòng)桿菌，該瓊氏不動(dòng)桿菌為固態(tài)或液態(tài)菌制劑。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明還提供了一種制備生物表面活性劑的方法，該方法包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明所述的瓊氏不動(dòng)桿菌或所述的瓊氏不動(dòng)桿菌制劑，產(chǎn)生生物表面活性劑。更具體地，其中，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，或者，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括：葵花籽油8-30g/L，NaNO38-30g/L，KH2PO40.5-2g/L，Na2HPO40.5-2g/L，yeast0.1-1.0g/L，pH5-9.5。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的制備生物表面活性劑的方法中，還包括發(fā)酵后除去菌體的過(guò)程，以其發(fā)酵清液(含生物表面活性劑)用于驅(qū)油。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明還提供了一種生物表面活性劑，其是按照所述方法制備得到的。該生物表面活性劑物理性狀良好，能夠有效降表面張力，對(duì)石油及多種烴和脂類具有良好的乳化性能。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明還提供了所述的瓊氏不動(dòng)桿菌或所述的瓊氏不動(dòng)桿菌制劑在降解原油和/或飽和烷烴中的應(yīng)用。具體應(yīng)用時(shí)，是將所述的瓊氏不動(dòng)桿菌或所述的瓊氏不動(dòng)桿菌制劑與待降解的原油和/或飽和烷烴混合，使瓊氏不動(dòng)桿菌在混合體系中培養(yǎng)生長(zhǎng)，從而降解原油和/或飽和烷烴。優(yōu)選地，所述飽和烷烴包括C18～C28烷烴中的一種或多種，更優(yōu)選包括nC18、nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正構(gòu)烷烴中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明還提供了所述的瓊氏不動(dòng)桿菌、所述的瓊氏不動(dòng)桿菌制劑、或者所述的生物表面活性劑在驅(qū)油以提高原油采收率中的應(yīng)用。綜上所述，本發(fā)明提供的瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)BD能產(chǎn)生物表面活性劑，具有優(yōu)異的乳化活性及降解飽和烷烴能力。附圖說(shuō)明圖1為基于16SrRNA的產(chǎn)表面活性劑菌BD的進(jìn)化樹(shù)。圖2為BD菌對(duì)原油降解前后樣品總離子流圖。圖3為BD菌對(duì)原油生物降解前后原油中化合物類型相對(duì)豐度。圖4為BD代謝產(chǎn)物粗品的薄層層析。圖5為BD代謝產(chǎn)物粗品的FT-ICR-MS譜圖。圖6為溫度對(duì)生物表面活性劑表面張力的影響。圖7為pH對(duì)生物表面活性劑表面張力的影響。圖8為菌株BD或其代謝產(chǎn)物驅(qū)替后微觀模型中的殘余油分布。用于專利程序的微生物保存：保藏日期：2016年10月31日；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所郵編100101；保藏編號(hào)：CGMCCNo.13206；分類命名：瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)及特點(diǎn)和應(yīng)用中所具有的技術(shù)效果，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。實(shí)施例1、本發(fā)明的產(chǎn)生物表面活性劑菌種的分離、鑒定及保藏1、產(chǎn)生物表面活性劑菌種的分離本發(fā)明中，產(chǎn)生物表面活性劑微生物的篩選方法為：將從新疆油田采集的水樣取10mL接入盛有100mL滅菌原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(2％原油，v：v)中，35℃，150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)72h，選取原油乳化分散程度高的實(shí)驗(yàn)組，取100μL發(fā)酵液涂布于LB瓊脂平板培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)48h；挑取不同形態(tài)單菌落，在LB瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線純化，35℃培養(yǎng)48h。挑取單菌落經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)接種入以原油為碳源的原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L：NaNO38，MgSO40.5，KH2PO41，K2HPO41，F(xiàn)eSO4·7H2O0.02，Na2MoO40.02，CaCl2·2H2O0.06，原油0.5％(W/V)，pH7.2)中，35℃，150rpm培養(yǎng)72h，觀察原油乳化分散程度和測(cè)定發(fā)酵液表面張力選取苯酚降解率最大的菌株。本實(shí)施例中，通過(guò)初步篩選以原油為碳源產(chǎn)表面活性劑的微生物，發(fā)現(xiàn)油藏地層水中有能夠很好乳化原油的微生物。經(jīng)過(guò)對(duì)樣品中的單菌落的篩選，發(fā)現(xiàn)四類油藏中有能夠很好乳化原油的微生物，總共分離得到了乳化原油效果較好的單菌3株，分別命名為BD、BD-2、BD-3。在3個(gè)菌株中，BD的排油圈直徑為5cm，BD-2的排油圈直徑為4.5cm。采用表面張力儀對(duì)3株菌的發(fā)酵液的表面張力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，從表中可以看到BD、BD-2、BD-3菌株發(fā)酵液具有較強(qiáng)的降低表面張力的能力，分別將表面張力從73.20mN/m降低到30.364mN/m、34.182mN/m和30.127mN/m。表1典型產(chǎn)表面活性劑微生物的確定菌株最適溫度/℃表面張力mN/m排油圈直徑/cmBD3730.3645.0BD-23734.1824.5BD-33730.1274.12、菌種鑒定依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)本發(fā)明分離出的菌株BD進(jìn)行鑒定，主要從菌株個(gè)體形態(tài)特征、菌落特征、染色反應(yīng)、生理生化反應(yīng)等鑒定到屬，內(nèi)容包括形態(tài)觀察、革蘭氏染色、過(guò)氧化氫接觸酶反應(yīng)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)等，鑒定結(jié)果表2。表2BD菌與對(duì)照菌的生理生化特征表中：+，所有菌株為陽(yáng)性；-，所有菌株為陰性；數(shù)字為陽(yáng)性菌株的％。另外，按照常規(guī)菌種鑒定方法，分別提取菌株BD的基因組DNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇理想的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序進(jìn)行DNA測(cè)序。產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果提交NCBI用BLAST進(jìn)行檢索和同源性比較，并利用SepnConverter，Clustalx1.83，Phylip3.63及TreeView等軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖1)。通過(guò)16SrDNA序列分析，確定菌株BD為瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)。本發(fā)明的菌株BD可以采用如下保存方法：(1)短期保存：將上述菌株于斜面培養(yǎng)基上劃線，經(jīng)35℃，48h培養(yǎng)后，4℃保藏。(2)長(zhǎng)期保存：可采用甘油冷凍保存法：從新鮮的斜面培養(yǎng)基上刮取幾環(huán)菌，轉(zhuǎn)入到已裝有1.5mL30％滅菌甘油的甘油管中，-70℃冷凍保存?；虿捎妹撝Ｄ汤鋬霰２胤ǎ簭男迈r的斜面培養(yǎng)基上刮取幾環(huán)菌，轉(zhuǎn)入到已裝有滅菌脫脂牛奶的甘油管中，-70℃冷凍保存。本發(fā)明所篩選到的瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)BD菌株已于2016年10月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)：CGMCCNo.13206。實(shí)施例2、BD對(duì)原油的降解實(shí)驗(yàn)種子菌液：將BD菌接種于富集培養(yǎng)基(參考現(xiàn)有技術(shù)配制，基本組成包括：Yeast5g/L，NaCl10g/L，Peptone10g/L。培養(yǎng)至濃度108-109cells/mL，作為種子液，進(jìn)行本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)研究。原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)：NaNO38，MgSO40.5，KH2PO41，K2HPO41，F(xiàn)eSO4·7H2O0.02，Na2MoO40.02，CaCl2·2H2O0.06，原油0.5％(W/V)，pH7.2。BD菌對(duì)原油降解的GC-MS分析：用LB培養(yǎng)基活化菌種，然后配制原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)：NaNO38，MgSO40.5，KH2PO41，K2HPO41，F(xiàn)eSO4·7H2O0.02，Na2MoO40.02，CaCl2·2H2O0.06，新疆原油0.5％(W/V)，pH7.2，將培養(yǎng)基分裝至250mL三角瓶中，每瓶100mL，按照4％接種量分別接種BD，于35℃搖床培養(yǎng)(150rpm)，分別于2d、7d、14d取樣。用二氯甲烷萃取培養(yǎng)液中原油，萃取后室溫?fù)]干溶劑。采用標(biāo)準(zhǔn)SYT5119-2008巖石中可溶有機(jī)物及原油族組分分析分離降解前后原油四組分，將得到的飽和烴利用Thermo–FinniganSSQ710色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行色質(zhì)分析。測(cè)定原油生物降解前后飽和烴的組分變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖2所示，BD菌作用后，正構(gòu)烷烴的相對(duì)豐度明顯下降，nC18以下的烷烴相對(duì)豐度變化不大，nC18、nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正構(gòu)烷烴相對(duì)豐度降低顯著，部分在兩天內(nèi)被完全消耗，高于nC25的烷烴相對(duì)豐度有所增加，其中，nC25、nC30和nC35增加幅度較大，表明BD可以利用中等分子量的烷烴為碳源，但分解高分子量的烷烴的能力較低，且較難利用nC25、nC30和nC35作為碳源。總的來(lái)說(shuō)BD對(duì)原油具有較為明顯的降解效果，兩天內(nèi)可以將飽和烴中的多種組分完全消耗(表3)。從圖3可以看出降解前化合物類型相對(duì)豐度從高到低依次是O2>O1>O4>O5>O3；經(jīng)BD降解后原油組分中O2類化合物的相對(duì)豐度也是最高的，其它化合物類型相對(duì)豐度從高到低依次是O3>O4>O1>O5；其中變化最為明顯的為O2和O3類化合物，經(jīng)BD降解后，兩類化和物相對(duì)豐都均大幅度增加，O2類占極性化合物的35％以上。而利用BD-2、BD-3菌對(duì)原油進(jìn)行降解，nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正構(gòu)烷烴的相對(duì)豐度在兩天內(nèi)下降并不顯著。另外，曲麗娜等從大慶油田長(zhǎng)期石油污染的土壤中分理出5株石油烴降解菌其中AcinetobacterjuniiX9相對(duì)降解能力較弱，在原油含量為1％的原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，降解一天時(shí)，對(duì)原油基本沒(méi)有什么降解效果，降解15天時(shí)，原油降解率為20％。本發(fā)明中菌株BD在原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天后，原油出現(xiàn)明顯的乳化現(xiàn)象，在培養(yǎng)兩天時(shí)，nC18、nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正構(gòu)烷烴相對(duì)豐度降低顯著，部分在兩天內(nèi)被完全消耗，說(shuō)明菌株BD對(duì)原油具有快速高效的降解效果。LiuTao(2012)等從石油污染土壤中分離得到兩株石油烴降解菌，分別為Pseudomonasaeruginosa(B1)和Acinetobacterjunii(B2)，但是只研究了兩株菌對(duì)正十六烷的降解能力，文獻(xiàn)中關(guān)于Acinetobacterjunii在石油烴降解中的相關(guān)報(bào)道很少。本發(fā)明的菌株BD為首次分離自油藏系統(tǒng)的Acinetobacterjunii，對(duì)石油烴具有良好的降解效果，可用于微生物采油和石油污染土壤修復(fù)。表3BD菌作用后正構(gòu)烷烴相對(duì)豐度變化(wt％)實(shí)施例3、產(chǎn)表面活性劑微生物BD的產(chǎn)物提取及分析菌種的活化與發(fā)酵(1)菌種活化：吸取甘油管保藏的BD菌種100μl接種到LB培養(yǎng)基，在37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)8h，作為種子液。(2)初始發(fā)酵條件：按體積比10％的接種量將種子液接入到裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葵花籽油20g/L，NaNO310g/L，KH2PO40.8g/L，Na2HPO40.8g/L，yeast0.5g/L，pH7.2)中，在37℃恒溫?fù)u床中，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)96h，得初始發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)1、發(fā)酵產(chǎn)物的提純?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葵花籽油20g/L，NaNO310g/L，KH2PO40.8g/L，Na2HPO40.8g/L，yeast0.5g/L，pH7.2)中接入5％的初始發(fā)酵液，35℃，150rpm下振蕩培養(yǎng)5天后，將發(fā)酵液離心去菌體后，加入用2倍體積無(wú)水乙醇醇沉，4℃冷藏過(guò)夜，收集沉淀和上層液相，將得到的沉淀洗滌冷凍干燥，同時(shí)提取上清液中有機(jī)物，得到黃色粘稠油狀液體。將黃色粘稠油狀液體溶于氯仿中，過(guò)濾除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，用柱層析進(jìn)一步的純化粗品，純化方法參考文獻(xiàn)，具體步驟如下：①柱子填充物為硅膠，在180℃下活化24h；②將氯仿與活化后的硅膠混合，填裝入φ15×300mm玻璃柱，排盡殘留氣泡；③將粗品的氯仿溶液小心沿層析柱內(nèi)壁從層析柱頂部注入；④用氯仿對(duì)硅膠柱進(jìn)行淋洗除去粗品中的中性脂；⑤依次用10:1(v/v)、2:1(v/v)、1:1(v/v)和1:2(v/v)的CHCl3和CH3OH的混合液對(duì)硅膠柱進(jìn)行淋洗，流速控制在2ml/min；⑥每隔10ml，收集一次淋洗液，用薄層層析(TLC)對(duì)收集樣進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)2、代謝產(chǎn)物的薄層色譜分析薄層層析所用展層板為硅膠板，顯色劑為蒽酮硫酸溶液，主要步驟如下：①點(diǎn)樣：粗品用氯仿溶解，將溶解液分次點(diǎn)加在硅膠板上，形成均勻小斑點(diǎn)，并烘干；②展開(kāi)：把薄板點(diǎn)樣的一端浸入展開(kāi)劑(V/V/V,CHCl3:CH3OH:H2O＝65:15:2的混合液)中，深度約為0.5-1cm，當(dāng)展開(kāi)劑的前緣接近硅膠板前緣時(shí)停止操作，迅速取出硅膠板，用鉛筆標(biāo)記溶劑的前緣位置，用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)吹干；③顯色。將蒽酮硫酸溶液均勻的噴灑在硅膠板上，100℃下顯色15分鐘；實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，其中A為鼠李糖，A1為鼠李糖的層析結(jié)果，B為BD菌代謝的生物表面活性劑，B1、B2為BD代謝物的層析結(jié)果。BD代謝物與茚三酮不顯色，推測(cè)該菌能產(chǎn)生糖脂類表面活性劑，薄層層析出現(xiàn)兩個(gè)顯色點(diǎn)，這說(shuō)明其產(chǎn)生的糖脂類物質(zhì)主要含有兩種組分。實(shí)驗(yàn)3、代謝產(chǎn)物組成分析將提取得到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行FT-ICR-MS分析，對(duì)代謝產(chǎn)物的樣品組成進(jìn)行分析，對(duì)200-1200分子量范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，通過(guò)BrukerDaltonicsDataAnalysis軟件計(jì)算得出樣品中相對(duì)含量較高的化合物種類。結(jié)果如圖5所示，挑選質(zhì)譜圖中主要的峰，用BrukerDaltonicsDataAnalysis分析并計(jì)算每個(gè)峰所代表的化學(xué)物質(zhì)，計(jì)算所得到的化學(xué)式如表4所示，通常認(rèn)為誤差在3ppm范圍以內(nèi)，數(shù)據(jù)可靠。其中m/z為503.32139的峰所代表的的化合物為C26H48O9，為R1型鼠李糖脂；m/z為531.35377的峰所代表的的化合物為C28H52O9，為R1型鼠李糖脂；m/z為649.37936的峰所代表的的化合物為C32H58O13，為R3型鼠李糖脂；m/z為529.33773的峰所代表的的化合物為C28H50O9，為R1型鼠李糖脂；m/z為475.2911的峰所代表的的化合物為C24H44O9，為R1型鼠李糖脂；m/z為677.41079的峰所代表的的化合物為C34H62O13，為R3型鼠李糖脂；m/z為479.24932的峰所代表的的化合物為C22H40O11，為R2型鼠李糖脂(見(jiàn)表4)。從高分辨質(zhì)譜結(jié)果來(lái)看BD代謝產(chǎn)物粗品中主要的表面活性物質(zhì)有R1、R2、R3型鼠李糖脂。本發(fā)明分離得到的AcinetobacterjuniiBD具有優(yōu)異的產(chǎn)表面活性性能，可代謝產(chǎn)生多種類型的鼠李糖脂類表面活性劑，同時(shí)對(duì)油藏具有較好的適應(yīng)性，可應(yīng)用于微生物采油。表4菌株BD代謝產(chǎn)物多樣性實(shí)施例4、BD菌株代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性評(píng)價(jià)微生物發(fā)酵液乳化性能的測(cè)定如下：(1)將BD菌接種于LB培養(yǎng)基中，于35℃條件下培養(yǎng)48h，得BD發(fā)酵液；(2)取BD發(fā)酵液離心除去菌體(5000rpm離心兩次，每次15min)，移取上清夜7mL，煤油3mL加入帶刻度試管中，用漩渦混合器漩渦混合2min，靜置24h后，觀察測(cè)定油相、乳化相的體積，計(jì)算乳化率E24。實(shí)驗(yàn)1、BD產(chǎn)表面活性劑熱穩(wěn)定性研究將BD發(fā)酵液在不同溫度處理1h，冷卻至室溫，按照上述(2)測(cè)定其乳化活性。結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖6，顯示了溫度對(duì)生物表面活性劑表面張力的影響。由圖6可知：BD產(chǎn)表面活性劑對(duì)溫度有一定的耐受性，在30～80℃范圍內(nèi)均具有較高的乳化活性，當(dāng)在90℃溫度下處理1h時(shí)發(fā)酵液的乳化活性降低。這說(shuō)明BD產(chǎn)生的表活劑能夠適應(yīng)多種不同溫度的油藏。實(shí)驗(yàn)2、BD產(chǎn)表面活性劑耐酸堿的研究將BD菌發(fā)酵液分別調(diào)整pH至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0處理一段時(shí)間后，測(cè)定其乳化性能。結(jié)果如圖7所示，顯示了pH對(duì)生物表面活性劑表面張力的影響。從圖中可以看出：當(dāng)溶液pH降低(從pH3.0到pH1.0)時(shí)，發(fā)酵液的乳化活性大幅度下降。可能是由于酸引起生物表面活性劑發(fā)生了沉淀。從pH4.0到pH12.0發(fā)酵液的乳化活性變化不大，說(shuō)明BD菌產(chǎn)生的表面活性劑的乳化活性物質(zhì)能耐受的pH范圍較廣，有較廣闊的應(yīng)用空間。實(shí)施例5、利用菌株BD及其代謝產(chǎn)物提高原油采收率評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)產(chǎn)生物表面活性劑菌提高原油采收率的效果采用玻璃微觀模型，制作低滲透油藏巖心鑄體薄片，用偏光顯微鏡圖像處理軟件處理巖心鑄體薄片照片。分別以兩個(gè)孔隙結(jié)構(gòu)圖為模版，制作玻璃微觀模型。玻璃微觀模型由兩塊玻璃板組成，在其中一塊玻璃板表面蝕刻，然后將兩塊玻璃板高溫?zé)Y(jié)在一起。所得模型的孔隙約為20μm～40μm。實(shí)驗(yàn)1、生物原位激活驅(qū)油實(shí)驗(yàn)①模型飽和原油將均質(zhì)性玻璃微觀模型用煤油，二氯甲烷洗干凈，放在馬沸爐中，400℃煅燒3個(gè)小時(shí)，冷卻至室溫，在兩端用膠把驅(qū)替針頭粘好，防止其漏氣，待膠凝固之后，兩端連上膠管，其內(nèi)徑為0.8mm，用1mL的注射器注入稀釋好的原油，放在室溫下飽和36h。②AcinetobacterjuniiBD懸浮液的制備取AcinetobacterjuniiBD種子液(參照實(shí)施例2種子菌液的制備)100μL，接入100mL裝有滅菌的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)10h，10000rpm高速離心10min，收集菌體，用無(wú)菌水清洗3遍，用同等基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸菌體。③第一次水驅(qū)取過(guò)濾后的新疆油田水樣200mL，平均分裝到兩個(gè)滅菌后的100mL的細(xì)口瓶中，調(diào)節(jié)pH至中性。在35℃條件下，用地層水驅(qū)替模型中的原油，每次水驅(qū)的時(shí)間是30min。第一次水驅(qū)完之后放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并拍照。④注入微生物在35℃條件下注入AcinetobacterjuniiBD懸浮液，驅(qū)替時(shí)間為10min，之后再用地層水驅(qū)替20min，其間每隔2min記錄一次模型圖像；注完菌液之后放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并拍照。然后放在35℃的條件下培養(yǎng)96h。⑤第二次水驅(qū)培養(yǎng)96h之后，用過(guò)濾后的地層水在35℃條件下進(jìn)行水驅(qū)。水驅(qū)完之后在顯微鏡下觀察并拍照。⑥數(shù)據(jù)處理結(jié)束實(shí)驗(yàn)，利用photoshop軟件處理圖片，計(jì)算其采收率。用煤油和二氯甲烷把模型洗干凈后，400℃煅燒4h，以備再次使用。實(shí)驗(yàn)2、表面活性劑驅(qū)油實(shí)驗(yàn)①模型飽和原油玻璃微觀模型用煤油，二氯甲烷洗干凈，放在馬沸爐中，400℃煅燒3h，冷卻至室溫，在兩端用膠把驅(qū)替針頭粘好，防止其漏氣，待膠凝固之后，兩端連上膠管，其內(nèi)徑為0.8mm，用1mL的注射器注入稀釋好的原油，放在室溫下飽和36h。②微生物培養(yǎng)液的制備取AcinetobacterjuniiBD種子液(參照實(shí)施例2種子菌液的制備)100μL，接入100mL裝有滅菌的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)10h，取5mL接入到100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)96h，靜置分層去下層發(fā)酵液，12000rpm離心10min，吸取中層清液備用。③驅(qū)替實(shí)驗(yàn)在35℃條件下首先用過(guò)濾后的地層水驅(qū)替30min，然后將處理后的菌液注入模型，流速控制在8μL/min，菌液驅(qū)替時(shí)間為10min，之后再用地層水驅(qū)替20min，其間每隔2min記錄一次模型圖像。④數(shù)據(jù)處理利用photoshop軟件處理圖片，計(jì)算采收率。用煤油和二氯甲烷把模型洗干凈后，400℃煅燒4h，以備再次使用。表5不同驅(qū)替模式下原油采收率不同驅(qū)替方式對(duì)內(nèi)源微生物驅(qū)油效果的影響如表5所示。兩種不同驅(qū)替模式下，二次水驅(qū)的采收率提高幅度均在9％以上，當(dāng)采用發(fā)酵液驅(qū)替時(shí)，二次水曲采收率要遠(yuǎn)高于采用菌體懸浮液原位驅(qū)替。圖8是生物表面活性劑驅(qū)油實(shí)驗(yàn)不同時(shí)期的拍照?qǐng)D片。當(dāng)注入除去菌體的發(fā)酵液時(shí)，發(fā)酵液中生物代謝產(chǎn)生的表面活性劑能夠降低水的表面張力，改善油的乳化特性，同時(shí)也改變了地層巖石表面的潤(rùn)濕性，使油與水形成較穩(wěn)定的水包油乳狀液，提高了原油自巖石孔隙表面自發(fā)洗脫效果。不同驅(qū)替方式對(duì)內(nèi)源微生物驅(qū)油效果的影響如表5所示。兩種不同驅(qū)替模式下，二次水驅(qū)的采收率提高幅度均在9％以上，當(dāng)采用發(fā)酵液驅(qū)替時(shí)，二次水驅(qū)采收率要遠(yuǎn)高于采用菌體懸浮液原位驅(qū)替。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3