本發(fā)明涉及光學(xué)成像系統(tǒng)與圖像處理模式識(shí)別領(lǐng)域，涉及一種瞬時(shí)正交光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

揭示生命的本質(zhì)、關(guān)注人類健康是當(dāng)代科技發(fā)展的主線。通過(guò)對(duì)生物樣本進(jìn)行成像來(lái)研究樣本的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生理功能，可達(dá)到為醫(yī)學(xué)臨床診斷提供客觀依據(jù)的目的。光學(xué)投影層析成像(Optical Projection Tomography，OPT)技術(shù)將CT技術(shù)和顯微技術(shù)相結(jié)合，能對(duì)熒光和非熒光物質(zhì)進(jìn)行三維成像的新技術(shù)。OPT具有比核磁共振更高的分辨率，可達(dá)微米量級(jí)；具有比共焦顯微成像更大的成像深度，能夠?qū)襁_(dá)十幾毫米的樣品進(jìn)行成像，也可以利用彩色或熒光染料對(duì)樣本進(jìn)行組織特異性或基因特異性著色處理。OPT成像時(shí)，先采集樣品不同斷層在不同角度下的投影數(shù)據(jù)，再由計(jì)算機(jī)對(duì)這些數(shù)據(jù)運(yùn)用Radon逆變換來(lái)重組圖像。OPT在組織發(fā)育、基因表達(dá)、以及醫(yī)療診斷等方面的研究中具有重要價(jià)值。

了解生物系統(tǒng)不僅需要研究細(xì)胞的空間分布，還需要研究它們隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。研究細(xì)胞的動(dòng)態(tài)即細(xì)胞的移動(dòng)情況，這對(duì)研究疾病變化、癌癥轉(zhuǎn)移是極為重要的。組織中被迫壞地方會(huì)有炎癥反應(yīng)，免疫細(xì)胞會(huì)發(fā)生變化，這時(shí)白細(xì)胞會(huì)增多。細(xì)胞移動(dòng)情況可以依據(jù)組織內(nèi)的三維模型展開(kāi)。在染病的模型中，研究活體生物體內(nèi)細(xì)胞移動(dòng)，這對(duì)生物醫(yī)藥機(jī)理研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

利用瞬時(shí)正交成像技術(shù)(在相互垂直的CCD同時(shí)采集兩幅圖像)來(lái)定位和跟蹤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。研究細(xì)胞檢測(cè)與識(shí)別算法，提取細(xì)胞的多參量形態(tài)學(xué)特征。為生物組織研究和醫(yī)藥運(yùn)行機(jī)理提供新的技術(shù)手段和思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，為了達(dá)到上述技術(shù)方案的效果，本發(fā)明提供一種解決或部分解決上述問(wèn)題的一種細(xì)胞圖像跟蹤智能算法：

步驟一、圖像采集：

斑馬魚(yú)胚胎放置在旋轉(zhuǎn)臺(tái)上開(kāi)始旋轉(zhuǎn)，在旋轉(zhuǎn)的同時(shí)，通過(guò)瞬時(shí)正交的光學(xué)成像系統(tǒng)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中細(xì)胞對(duì)象進(jìn)行圖像采集；經(jīng)過(guò)完整的圖像采集后得到投影圖像對(duì)，對(duì)投影圖像對(duì)進(jìn)行圖像增強(qiáng)，圖像去噪和圖像分割，通過(guò)數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)平滑和尺寸篩選進(jìn)行圖像分割，得到多個(gè)中性粒細(xì)胞圖像，通過(guò)跟蹤多個(gè)中性粒細(xì)胞圖像中的所有中性粒細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡，設(shè)定分割多個(gè)中性粒細(xì)胞圖像的面積小于一特定值；并用分水嶺算法進(jìn)行分割相互接觸和重疊的情況；

采集多個(gè)中性粒細(xì)胞圖像中都有記錄著當(dāng)前時(shí)刻所有中性粒細(xì)胞的坐標(biāo)位置；采集多個(gè)中性粒細(xì)胞圖像時(shí)相隔兩幀圖像拍攝時(shí)間間隔為一固定時(shí)間；

步驟二、跟蹤算法：

分析多個(gè)中性粒細(xì)胞圖像，并把分析出的對(duì)象中的其中一個(gè)中性粒細(xì)胞作為目標(biāo)；

任意給定的時(shí)間點(diǎn)k經(jīng)過(guò)一固定時(shí)間后的下一時(shí)間點(diǎn)為時(shí)間點(diǎn)k+1；時(shí)間點(diǎn)k+1經(jīng)過(guò)一固定時(shí)間后的下一時(shí)間點(diǎn)為時(shí)間點(diǎn)k+2；

將時(shí)間點(diǎn)k時(shí)的目標(biāo)與在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)離得最近的目標(biāo)聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)比較預(yù)測(cè)位置與實(shí)際位置的幾何距離差值，判斷是否列入目標(biāo)的軌跡列表；

步驟三、細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、運(yùn)動(dòng)速度和方向的測(cè)量：

重構(gòu)跟蹤目標(biāo)的軌跡后，計(jì)算以下特征：

目標(biāo)的軌跡總的長(zhǎng)度，為一個(gè)中性粒細(xì)胞總的移動(dòng)距離；

目標(biāo)的軌跡總位移，為一個(gè)中性粒細(xì)胞的起點(diǎn)和終點(diǎn)的距離；

目標(biāo)的平均速度值和運(yùn)動(dòng)方向；

跟蹤時(shí)間間隔；

根據(jù)目標(biāo)判斷運(yùn)動(dòng)方向：從目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)，時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)，時(shí)間點(diǎn)k+2時(shí)的三個(gè)位置進(jìn)行連線后，計(jì)算相鄰兩個(gè)位移增量的夾角余弦值，得到運(yùn)動(dòng)方向；

夾角余弦值若為1則運(yùn)動(dòng)方向方向值為1；稱為單方向性運(yùn)動(dòng)方向；夾角余弦值若為0則運(yùn)動(dòng)方向方向值為0；稱為完全無(wú)序性運(yùn)動(dòng)方向；

距離傷口近的目標(biāo)會(huì)受到影響是具有單方向性運(yùn)動(dòng)方向，距離傷口遠(yuǎn)的目標(biāo)不會(huì)受到影響就是完全無(wú)序性運(yùn)動(dòng)方向，用于判斷目標(biāo)是否會(huì)朝著斑馬魚(yú)胚胎的傷口移動(dòng)；

步驟四、細(xì)胞檢測(cè)與識(shí)別：

定義測(cè)量投影坐標(biāo)系的X軸，Y軸，Z軸；Z軸是垂直坐標(biāo)；X軸是橫坐標(biāo)從多個(gè)中性粒細(xì)胞圖像的左邊開(kāi)始測(cè)量，Y軸是另一個(gè)橫坐標(biāo)，與Y軸正交；

投影圖像以Z軸分成XZ軸上的投影圖像和YZ軸上的投影圖像；

在每個(gè)一固定時(shí)間時(shí)在XZ軸上的投影圖像和YZ軸上的投影圖像各采集一幅圖像，以減少對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行三維跟蹤時(shí)的光輻射，并在0到時(shí)間點(diǎn)k之間的時(shí)間段里得到k個(gè)投影圖像對(duì)，通過(guò)圖像分割和三角測(cè)量，目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)的測(cè)定坐標(biāo)為X_k，Y_k，Z_k，其中：X_k、Y_k、Z_k分別為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)在X軸上，Y軸上，Z軸上的測(cè)定坐標(biāo)；X_k+1、Y_k+1分別為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在X軸上，Y軸上的測(cè)定坐標(biāo)值；

目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)的預(yù)測(cè)坐標(biāo)為P(x_k，y_k，z_k)，其中：P(x_k)、P(y_k)、P(z_k)分別為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)在X軸上，Y軸上，Z軸上的預(yù)測(cè)坐標(biāo)值；

利用公式(1)進(jìn)行坐標(biāo)預(yù)測(cè)；

且P_k(z_k+1)＝Z_k+1 公式(1)

公式(1)中的P_k(z_k+1)＝Z_k+1中的P_k(z_k+1)為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的預(yù)測(cè)坐標(biāo)值；Z_k+1為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的測(cè)定坐標(biāo)值；P_k(z_k+1)＝Z_k+1表示目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的預(yù)測(cè)坐標(biāo)值，與目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的測(cè)定坐標(biāo)值相等；

公式(1)中的·為點(diǎn)乘符號(hào)

公式(1)中的θ是旋轉(zhuǎn)采集時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)k中任意相鄰采集的圖像幀的角度步長(zhǎng)，X_AOR，Y_AOR是旋轉(zhuǎn)軸在投影坐標(biāo)系中的XY軸的坐標(biāo)位置；

在XZ軸上的投影圖像和YZ軸上的投影圖像檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)，采用大小可調(diào)、非線性高帽函數(shù)圖像處理算法進(jìn)行識(shí)別目標(biāo)；

根據(jù)多個(gè)目標(biāo)大小經(jīng)驗(yàn)值分割判定單個(gè)目標(biāo)的有效區(qū)域，擬合(擬合就是把平面上一系列的點(diǎn)，用一條光滑的曲線連接起來(lái))計(jì)算出多個(gè)目標(biāo)的幾何中心，在XZ坐標(biāo)系的坐標(biāo)為(x，z)，在YZ坐標(biāo)系的坐標(biāo)為(y，z)；

在對(duì)k對(duì)投影圖像對(duì)中的目標(biāo)進(jìn)行識(shí)別時(shí)，如果有相近的Z坐標(biāo)值則認(rèn)為是同一目標(biāo)；在XZ坐標(biāo)系和YZ坐標(biāo)系中存在2個(gè)或以上目標(biāo)有相近的Z坐標(biāo)值，隨著旋轉(zhuǎn)臺(tái)轉(zhuǎn)動(dòng)，如果是不同目標(biāo)，接下來(lái)的圖像中的Z坐標(biāo)值的變化不滿足設(shè)定的邊界條件從而排除掉；

步驟五、重構(gòu)來(lái)自測(cè)量投影坐標(biāo)系的分割目標(biāo)的運(yùn)動(dòng)軌跡：

在任意給定幀的每個(gè)目標(biāo)與下一幀最近的目標(biāo)聯(lián)系起來(lái)；所有識(shí)別的目標(biāo)在第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)的坐標(biāo)X_k，Y_k，Z_k坐標(biāo)列表變換到第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的坐標(biāo)系統(tǒng)P(x_k+1，y_k+1，z_k+1)，P(_xk+1，y_k+1，z_k+1)與在第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的坐標(biāo)X_k+1，Y_k+1，Z_k+1進(jìn)行比較，目標(biāo)的空間距離在某一個(gè)范圍內(nèi)時(shí)認(rèn)為是同一個(gè)目標(biāo)，每個(gè)目標(biāo)只能加入一個(gè)軌跡；

P(x_k+1，y_k+1，z_k+1)是目標(biāo)在是根據(jù)識(shí)別的目標(biāo)在第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)的坐標(biāo)X_k，Y_k，Z_k在第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的預(yù)測(cè)坐標(biāo)；

如果相應(yīng)的目標(biāo)在第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有被識(shí)別，利用合適的變換將第k+2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的預(yù)測(cè)坐標(biāo)與第k+2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的坐標(biāo)進(jìn)行比較；如果相應(yīng)的目標(biāo)仍然沒(méi)有被識(shí)別，則目標(biāo)的跟蹤在第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)終止。

附圖說(shuō)明

圖1為細(xì)胞跟蹤智能算法的技術(shù)路線圖

圖2為細(xì)胞跟蹤智能算法的跟蹤算法流程圖

圖3為正交光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)的焦平面(顯示了正交成像系統(tǒng)對(duì)于交叉位面在旋轉(zhuǎn)軸的聚焦)(FP焦平面，旋轉(zhuǎn)軸)

圖4為細(xì)胞跟蹤智能算法的另一種技術(shù)路線圖

圖5為正交光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)的俯視圖(顯示了正交成像系統(tǒng)對(duì)于交叉位面在旋轉(zhuǎn)軸的聚焦)(FP焦平面，旋轉(zhuǎn)軸)

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明，能實(shí)現(xiàn)同樣功能的產(chǎn)品屬于等同替換和改進(jìn)，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。具體方法如下：

實(shí)施例一：細(xì)胞跟蹤智能算法的具體成果為：

(1)提出一種高精度瞬時(shí)正交光學(xué)投影斷層成像技術(shù)，在樣本尺寸和成像精度之間進(jìn)行權(quán)衡，提高分辨率、成像效率和信噪比。

(2)搭建新型旋轉(zhuǎn)式瞬時(shí)正交成像三維跟蹤系統(tǒng)，對(duì)活體模式動(dòng)物的免疫細(xì)胞(如：中性粒細(xì)胞)進(jìn)行三維跟蹤，努力提高時(shí)域精度。相對(duì)傳統(tǒng)三維跟蹤對(duì)樣本做每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三維成像，本發(fā)明利用瞬時(shí)正交成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣本進(jìn)行三維跟蹤的最小光輻射(最小光漂白和光毒性)，對(duì)生物活體的傷害小，為生物、醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥研究提供了新的技術(shù)手段，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

(3)應(yīng)用雙軸OPT(在正交投影角度)來(lái)實(shí)現(xiàn)三維時(shí)間延遲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞移動(dòng)跟蹤。研究細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)，探測(cè)細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)信息，是醫(yī)學(xué)和藥物研究領(lǐng)域急需解決的研究方向。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)取得了快速發(fā)展。它是借助于某種能量與生物體的相互作用，提取生物體內(nèi)組織或器官的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生理功能的信息，為生物組織研究和臨床診斷提供了影像信息。涉及的范圍很廣，有X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描成像(X-ray CT)、核磁共振成像(MRI)、超聲波成像(UI)、光學(xué)成像等。

利用光與生物組織的相互作用進(jìn)行成像，一直備受青睞，因?yàn)楣鈱W(xué)成像具有對(duì)組織干擾小，靈敏度高，信息豐富(可多參數(shù)聯(lián)合測(cè)量，這些參數(shù)包括結(jié)構(gòu)、頻譜、偏振、量子效應(yīng)和壽命等)，可達(dá)亞細(xì)胞層次分辨率水平，適于離體或活體實(shí)時(shí)成像，便于與其他技術(shù)如超聲結(jié)合使用，以及具備直接治療的潛能等優(yōu)點(diǎn)。光與組織的相互作用機(jī)制非常豐富，有反射、散射、吸收、熒光等，這些光學(xué)現(xiàn)象均可用于提取組織中的相關(guān)信息，從而產(chǎn)生基于它們的各種成像方法，使得光學(xué)方法成為生物組織成像里研究最為活躍、發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域。

但是，由于生物組織的不均勻性，對(duì)光波有吸收和強(qiáng)散射，因此光波很難深入組織內(nèi)部，更難以從生物組織中提取出清晰的圖像。為了解決這個(gè)難題，近年來(lái)人們發(fā)展了一系列光學(xué)成像方法。例如：共聚焦/多光子光學(xué)成像技術(shù)、光學(xué)相干層析成像、光片顯微儀、掃描激光光學(xué)斷層掃描、光學(xué)投影層析成像(OPT)等。這些醫(yī)用成像技術(shù)手段有各自的適用范圍和各自的局限性，表1列出幾種常用成像技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。

當(dāng)前進(jìn)行能夠?qū)m-cm量級(jí)生物對(duì)象進(jìn)行三維光學(xué)成像的方法有：OPT、SLOT、LSM。LSM相對(duì)成像速度快，但成像的精度方向各異性，提取的圖像信息容易模糊。OPT和SLOT，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單容易操作，成像精度各方向同性。但OPT是寬場(chǎng)成像方式，通過(guò)全場(chǎng)照明激發(fā)用CCD采集投影成像，采集速度更快。SLOT是通過(guò)單點(diǎn)激發(fā)和探測(cè)而成像。

生物醫(yī)學(xué)三維成像為生物和醫(yī)學(xué)研究提供了新的技術(shù)手段。研究活體內(nèi)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)分布(三維跟蹤)是生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域一個(gè)非常有意義的課題，為探測(cè)疾病的變化和研究藥物的作用機(jī)理提供了新的技術(shù)手段。目前為止，細(xì)胞三維跟蹤已經(jīng)利用顯微鏡實(shí)現(xiàn)，需要在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取三維體積信息。共聚焦/多光子激光掃描顯微提供了光學(xué)切片，這些光學(xué)切片有利于熒光標(biāo)記細(xì)胞三維圖像堆棧的獲取。這個(gè)方法被用于基于高分辨率研究斑馬魚(yú)的有炎癥小區(qū)域的中性粒細(xì)胞，比如：尾巴受傷的模型，大約100μm視場(chǎng)。然而，事實(shí)上大多數(shù)激光掃描顯微鏡在穿透深度和視場(chǎng)上受到限制，他們本質(zhì)上展示出各項(xiàng)異性的分辨率，可以擴(kuò)展到整個(gè)樣本的介觀成像，但需要高的激發(fā)功率和長(zhǎng)的圖像采集時(shí)間。我們可選擇一些針對(duì)mm-cm量級(jí)生物組織的三維成像技術(shù)，這些技術(shù)得益于全場(chǎng)圖像采集，包括光學(xué)投影層析成像(optical projection tomography)和光片顯微技術(shù)(light sheet microscopy)。這些技術(shù)能夠直接擴(kuò)展到三維體積成像，例如：在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取整個(gè)樣本的體積。利用激光掃描顯微成像中已經(jīng)改進(jìn)和實(shí)現(xiàn)的算法直接來(lái)實(shí)現(xiàn)三維時(shí)間延遲特征的跟蹤。遺憾的是，體積成像需要獲取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上針對(duì)LSM的滿堆棧圖像或者針對(duì)OPT的滿序列投影。毫米量級(jí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞級(jí)分辨率需要超過(guò)100幀每體積。這限制了時(shí)間延遲分辨率，這些特征在這段體積獲取時(shí)間移動(dòng)了有效的距離。而且，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取幾百個(gè)圖像，結(jié)果是在整個(gè)時(shí)間過(guò)程中對(duì)樣本的大量的光輻射，這也將導(dǎo)致光漂白或光毒性使得活體研究大打折扣。

綜上所述，我們提出一個(gè)新的三維跟蹤方法，延伸了角度復(fù)用OPT方法擬以相機(jī)幀速率來(lái)實(shí)現(xiàn)三維跟蹤。擬在不同的投影角度同時(shí)獲取圖像，利用每個(gè)時(shí)間點(diǎn)三角測(cè)量，不用重構(gòu)整個(gè)樣本體積，僅估算三維特征的位置信息。這樣，對(duì)單個(gè)圖像的采集而不是整個(gè)體積采集，三維特征跟蹤時(shí)間分辨率上等價(jià)于連續(xù)投影采集和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)光輻射的延遲。這種采集系統(tǒng)能夠提供各向同性的空間分辨率(與共聚焦/多光子激光掃描顯微或傳統(tǒng)光片顯微技術(shù)的三維跟蹤不同)。擬用改進(jìn)的OPT采集方案，跟蹤一個(gè)疾病模型(如：斑馬魚(yú)胚胎)的細(xì)胞移動(dòng)是特別方便的。

實(shí)施例二：(1)提出一種瞬時(shí)正交成像技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)稀疏分布的細(xì)胞三維跟蹤，擬利用光學(xué)投影層析成像得到較高的時(shí)間延遲分辨率。與傳統(tǒng)的三維跟蹤技術(shù)需要對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)作三維立體空間采集，本發(fā)明擬降低對(duì)樣本的光輻射。

(2)利用角度復(fù)用OPT系統(tǒng)在不同投影角度同時(shí)采集兩幅正交圖像，擬采用高達(dá)相機(jī)幀率的時(shí)間去定位和跟蹤特征目標(biāo)。

(3)通過(guò)對(duì)細(xì)胞檢測(cè)、識(shí)別和跟蹤算法的發(fā)明，研究細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)特征，探測(cè)細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)信息，是醫(yī)學(xué)和藥物研究領(lǐng)域急需解決的研究方向。

主要有：(1)瞬時(shí)正交光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)的搭建。

將樣本放置在旋轉(zhuǎn)臺(tái)，調(diào)焦兩個(gè)正交成像臂到旋轉(zhuǎn)軸，選擇合適的系統(tǒng)部件參數(shù)，激光器、CCD、電動(dòng)控制快門、濾光片，光闌，透鏡等，搭建雙軸瞬時(shí)正交OPT成像系統(tǒng)。

(2)細(xì)胞檢測(cè)與識(shí)別算法的發(fā)明。

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行圖像增強(qiáng)，去噪和圖像分割，研究針對(duì)細(xì)胞對(duì)象的檢測(cè)與識(shí)別算法。利用高帽變換、分水嶺算法等等。

(3)跟蹤算法的發(fā)明。

將任意給定的時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)目標(biāo)與下一時(shí)間點(diǎn)最近的目標(biāo)聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)比較預(yù)測(cè)位置與實(shí)際位置的幾何距離差值，判斷是否列入該細(xì)胞軌跡列表，定義的分段線性的細(xì)胞軌跡。

(4)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、運(yùn)動(dòng)速度和方向的測(cè)量

重構(gòu)跟蹤細(xì)胞的軌跡后，可以估算一系列的特征：總的軌跡長(zhǎng)度即相應(yīng)細(xì)胞總的移動(dòng)距離；沿不同軸的移動(dòng)長(zhǎng)度；移動(dòng)的總位移即起點(diǎn)和終點(diǎn)的距離；不同的速度測(cè)量等。例如在一個(gè)跟蹤特征的例子中，我們計(jì)算平均跟蹤速度(總的跟蹤時(shí)間長(zhǎng)度除以跟蹤時(shí)間間隔)和方向(兩個(gè)連續(xù)增量的平均角度余弦)。完全無(wú)序的運(yùn)動(dòng)方向值應(yīng)該為0，接近單方向性的方向值接近1。

實(shí)施例三：發(fā)明方案

細(xì)胞檢測(cè)與識(shí)別：用正交熒光投影的原始數(shù)據(jù)(相互垂直的CCD系統(tǒng)獲取一對(duì)圖像)定義實(shí)驗(yàn)的坐標(biāo)系統(tǒng)，X，Y，Z軸。Z是共同的垂直坐標(biāo)，從投影圖像的底部行開(kāi)始測(cè)量，與旋轉(zhuǎn)軸平行。X是橫坐標(biāo)從投影圖像(其中一個(gè)相機(jī)成像)左邊開(kāi)始測(cè)量，Y是另一個(gè)正交相機(jī)成像的橫坐標(biāo)。經(jīng)過(guò)完整的旋轉(zhuǎn)投影采集后，有k對(duì)投影圖像，通過(guò)圖像分割和三角測(cè)量，我們可以確定(X，Y，Z)_k即熒光目標(biāo)(如：細(xì)胞)在第k對(duì)圖像的坐標(biāo)。

理想的熒光特征，如表達(dá)綠色熒光蛋白的中性粒細(xì)胞在不同的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該有不變的亮度。然而，事實(shí)上測(cè)量的熒光強(qiáng)度在不同的旋轉(zhuǎn)角度受到光的收集效率(如：來(lái)自焦平面的不同位置)、激勵(lì)的空間變化、激發(fā)光與自發(fā)熒光散射和吸收的的影響。除此以外，這些中性粒細(xì)胞群集在一起，在移動(dòng)過(guò)程中很大程度上延伸和改變他們的形狀，而且熒光蛋白表達(dá)水平也是變化的。因此，在xz、yz投影圖像上檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞，在適當(dāng)范圍內(nèi)的細(xì)胞大小和熒光強(qiáng)度下，選擇合適的圖像分割算法是很重要的。我們擬采用大小可調(diào)、非線性高帽函數(shù)圖像處理算法在預(yù)計(jì)的尺寸范圍內(nèi)內(nèi)識(shí)別目標(biāo)，所有算法在Matlab環(huán)境下運(yùn)行。將一組給定的像素和它周圍區(qū)域像素的平均灰度比進(jìn)行比較，利用局部大小選擇閾值可以滿足這些要求。初級(jí)和二級(jí)檢測(cè)尺度相應(yīng)的設(shè)為2個(gè)和8個(gè)像素。通過(guò)數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)平滑和尺寸篩選進(jìn)行圖像分割，可以設(shè)定分割目標(biāo)的面積小于某一特定值。由于細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞間還存在相互接觸和重疊的情況，可是嘗試用分水嶺算法進(jìn)行此類情況的分割。

圖像分割后，每對(duì)投影圖像中被識(shí)別細(xì)胞的(X，Z)(Y，Z)坐標(biāo)認(rèn)定為分割區(qū)域的幾何中心。在投影圖像對(duì)中，如果有相近的Z坐標(biāo)被認(rèn)為是同一細(xì)胞。權(quán)衡Z坐標(biāo)相近的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定，比如：±3個(gè)像素。被識(shí)別細(xì)胞的Z坐標(biāo)有兩幅投影圖像中Z坐標(biāo)的平均值得到。為了下一步的深入分析，將每個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)信息存儲(chǔ)下來(lái)。

細(xì)胞跟蹤

定量分析的第一步就是重構(gòu)來(lái)自測(cè)量投影坐標(biāo)系的分割細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡?？梢栽谌我饨o定幀的每個(gè)目標(biāo)與下一幀最近的目標(biāo)聯(lián)系起來(lái)。復(fù)雜的方法可以用位置、亮度、形狀大小、方向、速度和其他細(xì)胞特征計(jì)算“相似度”。我們可以從較為簡(jiǎn)單的算法入手研究，先考慮幾何距離特征。

目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)的測(cè)定坐標(biāo)為X_k，Y_k，Z_k，其中：X_k、Y_k、Z_k分別為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)在X軸上，Y軸上，Z軸上的測(cè)定坐標(biāo)；X_k+1、Y_k+1分別為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在X軸上，Y軸上的測(cè)定坐標(biāo)值；

目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)的預(yù)測(cè)坐標(biāo)為P(x_k，y_k，z_k)，其中：P(x_k)、P(y_k)、P(z_k)分別為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k時(shí)在x軸上，Y軸上，Z軸上的測(cè)定坐標(biāo)值；

利用公式(1)進(jìn)行坐標(biāo)預(yù)測(cè)；

且P_k(z_k+1)＝Z_k+1 公式(1)

公式(1)中的P_k(z_k+1)＝Z_k+1中的P_k(z_k+1)為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的預(yù)測(cè)坐標(biāo)值；Z_k+1為目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的測(cè)定坐標(biāo)值；P_k(z_k+1)＝Z_k+1表示目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的預(yù)測(cè)坐標(biāo)值，與目標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)k+1時(shí)在Z軸上的測(cè)定坐標(biāo)值相等；

公式(1)中的·為點(diǎn)乘符號(hào)

公式(1)中的θ是旋轉(zhuǎn)采集時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)k中任意相鄰采集的圖像幀的角度步長(zhǎng)，X_AOR，Y_AOR是投影到瞬時(shí)正交的光學(xué)成像系統(tǒng)的焦平面的兩個(gè)正交圖像中的旋轉(zhuǎn)軸的橫向位置；

在任意給定幀的每個(gè)所述目標(biāo)與下一幀最近的所述目標(biāo)聯(lián)系起來(lái)；所有識(shí)別的所述目標(biāo)在第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)的坐標(biāo)X_k，Y_k，Z_k坐標(biāo)列表變換到第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的坐標(biāo)系統(tǒng)P(x_k+1，y_k+1，z_k+1)，P(x_k+1，y_k+1，z_k+1)與在第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的坐標(biāo)X_k+1，Y_k+1，Z_k+1進(jìn)行比較，所述目標(biāo)的空間距離在某一個(gè)范圍內(nèi)時(shí)認(rèn)為是同一個(gè)所述目標(biāo)，每個(gè)所述目標(biāo)只能加入一個(gè)軌跡；

P(x_k+1，y_k+1，z_k+1)是目標(biāo)在是根據(jù)識(shí)別的目標(biāo)在第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)的坐標(biāo)X_k，Y_k，Z_k在第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的預(yù)測(cè)坐標(biāo)；

如果相應(yīng)的目標(biāo)在第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有被識(shí)別，利用合適的變換將第k+2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的預(yù)測(cè)坐標(biāo)與第k+2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的坐標(biāo)進(jìn)行比較；如果相應(yīng)的目標(biāo)仍然沒(méi)有被識(shí)別，則目標(biāo)的跟蹤在第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)終止。

實(shí)施例四：首先利用圖像增強(qiáng)算法、圖像分割算法，依據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)(目標(biāo)的大小范圍)對(duì)目標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，對(duì)多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記編號(hào)，利用特征提取算法對(duì)目標(biāo)的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行提取，利用跟蹤算法對(duì)目標(biāo)運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行三維重構(gòu)，最后完成多目標(biāo)的跟蹤和獲取目標(biāo)的多參量信息。

跟蹤算法，在初始的時(shí)間點(diǎn)k，定義初始的細(xì)胞集合，接下來(lái)的跟蹤算法適用于第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)，第k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以及細(xì)胞集合中的每一個(gè)細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞集里的每個(gè)細(xì)胞，計(jì)算它在k+1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的預(yù)測(cè)坐標(biāo)。如果在預(yù)測(cè)位置的附近，發(fā)現(xiàn)一個(gè)鄰近的識(shí)別細(xì)胞(空間距離小于某一特定值)，加入軌跡，算法繼續(xù)下一次迭代。一個(gè)細(xì)胞只可能在一個(gè)軌跡中，只列入一次。如果在第m次迭代，列入軌跡沒(méi)有成功，預(yù)測(cè)在m+2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞位置，因此需要兩次連續(xù)的預(yù)測(cè)。只要兩次沒(méi)有成功，跟蹤終斷，開(kāi)始建立下一個(gè)跟蹤，直到第k個(gè)時(shí)間點(diǎn)的所有初始細(xì)胞跟蹤結(jié)束。

跟蹤算法流程圖如圖2所示。為了采集盡可能多的跟蹤數(shù)據(jù)，算法連續(xù)的開(kāi)始用第一，第二等幀作為最初始的幀。在下一步分析中，計(jì)算XY增量區(qū)分每幀測(cè)量坐標(biāo)與預(yù)測(cè)坐標(biāo)的差別。在樣本坐標(biāo)系表示增量，最后定義細(xì)胞軌跡。

實(shí)施例五：對(duì)光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)(OPT)的設(shè)計(jì)和搭建有較好的研究基礎(chǔ)，對(duì)生物樣本圖像處理與識(shí)別算法提出了詳實(shí)可行的研究路線和方法。

實(shí)驗(yàn)室具有非常完備的實(shí)驗(yàn)條件：488nm激光器(200mw)、561nm激光器(200mw)、多個(gè)光譜儀、CCD、光電倍增管、探測(cè)器、電動(dòng)位移臺(tái)、控制器、功率計(jì)、示波器、熒光顯微鏡系統(tǒng)、工作站等；而且也搭建了初步的OPT成像系統(tǒng)，這為將來(lái)工作開(kāi)展提供了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)，充分確保了發(fā)明的順利完成。

(1)提出利用瞬時(shí)正交的OPT成像系統(tǒng)對(duì)熒光目標(biāo)進(jìn)行三維跟蹤的新思路，實(shí)現(xiàn)了完整的活體模式動(dòng)物內(nèi)中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡的重構(gòu)，為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的定量描述提供了一種新方法。

(2)提出基于高帽算法、分水嶺算法等細(xì)胞檢測(cè)與識(shí)別算法，對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征等多參量信息的提取，能對(duì)疾病發(fā)展、及藥物作用下的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行精確描述。

(3)提出復(fù)合角度投影成像方法，實(shí)現(xiàn)了由連續(xù)投影圖像的延遲而不是整個(gè)體積采集時(shí)間決定的時(shí)間延遲分辨率，顯著減少對(duì)生物活體的光輻射，為生物活體內(nèi)的細(xì)胞研究提供了可行性方法。

通過(guò)本發(fā)明搭建一種細(xì)胞圖像跟蹤智能算法，能夠?qū)铙w模式動(dòng)物中的免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行三維跟蹤并提取細(xì)胞的各種形態(tài)學(xué)特征，為研究疾病發(fā)展、生命活動(dòng)及藥物作用提供了新的技術(shù)方法，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞跟蹤智能算法的有益效果如下：通過(guò)本發(fā)明的開(kāi)展，搭建瞬時(shí)正交的OPT成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)中性粒細(xì)胞的三維跟蹤。采集速度達(dá)到相機(jī)幀速率、對(duì)生物樣本光輻射小。將各種圖像處理和識(shí)別算法用于斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)中性粒細(xì)胞的檢測(cè)與識(shí)別，得到細(xì)胞的位置變化和形態(tài)學(xué)特征。為下一步數(shù)據(jù)分析奠定基礎(chǔ)。分析中性粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)特征、運(yùn)動(dòng)軌跡與炎癥和藥物作用的相互關(guān)系，為研究疾病變化和藥物機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)。

以上所述僅為本發(fā)明之較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍。同時(shí)以上說(shuō)明，對(duì)于相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)可以理解及實(shí)施，因此其他基于本發(fā)明所揭示內(nèi)容所完成的等同改變，均應(yīng)包含在本權(quán)利要求書的涵蓋范圍內(nèi)。