鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基及其設(shè)計(jì)篩選方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基及其設(shè)計(jì)篩選方法。基于天然存在的衣殼粒和次要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP2-C的復(fù)合物，構(gòu)建衣殼粒親和肽配基的仿生設(shè)計(jì)流程。首先利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積(MM/PBSA)方法解析復(fù)合物中分子間相互作用，確定VP2-C的熱點(diǎn)殘基及其簡(jiǎn)化親和模型，藉此構(gòu)建衣殼粒的親和肽配基庫(kù)，通過(guò)分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬和MM/PBSA方法篩選高親和性肽配基。篩選所得排名第一的親和肽配基DWDLRLLY，經(jīng)親和色譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)能有效從大腸桿菌裂解上清液中一步分離純化衣殼粒，在病毒樣顆粒的制備中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基及其設(shè)計(jì)篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的親和肽配基技術(shù)，以及利用親和色譜技術(shù)純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，屬于生物技術(shù)中的計(jì)算機(jī)模擬和蛋白質(zhì)分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠多瘤病毒樣顆粒(Virus-Like Particles, VLP)是由主要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VPl (42kDa)自組裝而形成的空心納米顆粒，在疫苗、基因治療、藥物載體和材料科學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。鼠多瘤病毒VLP包含72個(gè)向右歪斜的呈T = 7d排布的衣殼粒，每個(gè)衣殼粒由5個(gè)VPl組成。
[0003]VPl在原核細(xì)胞中表達(dá)純化后以衣殼粒形態(tài)存在，在體外適宜條件下能組裝成形態(tài)均一、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的VLP。這種體外生產(chǎn)VLP的方法簡(jiǎn)單、高效，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，利用高細(xì)胞密度、PH控制流加培養(yǎng)可制備N(xiāo)端帶有GST標(biāo)簽的VPl，其產(chǎn)量能夠達(dá)到4.38gL—1。其中，GST標(biāo)簽既能夠促進(jìn)VPl蛋白的可溶性表達(dá)，又利于帶標(biāo)簽前體的純化。然而在純化后處理時(shí)，需要昂貴的凝血酶切割使GST標(biāo)簽脫落，且脫落的GST標(biāo)簽還需要額外的分離純化步驟從反應(yīng)體系中去除。因而導(dǎo)致操作繁瑣、成本增大，不利于生產(chǎn)擴(kuò)大，限制鼠多瘤病毒樣顆粒的應(yīng)用。
[0004]親和色譜利用生物大分子和特異性配基間的相互作用分離純化目標(biāo)分子，具有高選擇性、高效率、操作條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。親和色譜的實(shí)現(xiàn)取決于目標(biāo)分子與配基之間的特異性識(shí)別，因此配基 是親和色譜的核心。其中，小分子肽配基具有高親和性高、高穩(wěn)定性、不易降解及制備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，具有重要的開(kāi)發(fā)前景。而近年來(lái)隨著分子模擬技術(shù)的飛速發(fā)展，通過(guò)模擬自然界已存在的目標(biāo)蛋白-配體之間的相互作用以設(shè)計(jì)篩選高特異性親和肽配基成為可能，有助于提高親和肽配基的篩選效率及準(zhǔn)確性。
[0005]鼠多瘤病毒衣殼粒和次要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP2(35kDa)復(fù)合物是天然存在的衣殼粒-配體結(jié)合物，其中，VP2的C端(VP2-C)通過(guò)疏水作用以一種特殊的發(fā)卡結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)合到衣殼粒的內(nèi)表面，可作為衣殼粒的親和肽配基的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提出鼠多瘤病毒衣殼粒新型親和配基設(shè)計(jì)及篩選方法的應(yīng)用。本發(fā)明所述的衣殼粒親和肽配基的仿生設(shè)計(jì)流程是首次建立的，并經(jīng)驗(yàn)證是有效的。所述的親和肽配基具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基:DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DWFLNLFY、DffSLKLVY, DffSLRLKY 和 DWNLHLPY。
[0009]本發(fā)明的鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基及其設(shè)計(jì)篩選方法，是依據(jù)天然存在的衣殼粒和次要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP2-C復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建衣殼粒的新型肽配基庫(kù)，特征序列為DWXLXLXY，其中X代表除去半胱氨酸以外的19種氨基酸；見(jiàn)核苷酸序列表。[0010]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬/泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積計(jì)算解析VP2-C與衣殼粒復(fù)合物的分子作用機(jī)理，確定疏水作用占主導(dǎo)，而VP2-C中對(duì)結(jié)合起重要貢獻(xiàn)的關(guān)鍵殘基為 V283、P285、D286、W287、L289、L293 和 Y296。
[0011]多肽庫(kù)構(gòu)建依據(jù)為VP2-C中5個(gè)關(guān)鍵殘基:D286、W287、L289、L293和Y296 ;在肽庫(kù)的范圍內(nèi)，利用氨基酸定位法構(gòu)建候選多肽分子庫(kù)。
[0012]通過(guò)分子對(duì)接篩選、均方根偏差比較以及分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合自由能計(jì)算，進(jìn)行鼠多瘤病毒衣殼粒的高親和性肽配基的篩選。
[0013]利用VINA分子對(duì)接軟件將肽配基庫(kù)中的肽配基依次與鼠多瘤病毒衣殼粒進(jìn)行對(duì)接，選取結(jié)合自由能低于-6.5kcal/mol的肽配基,共計(jì)1158條。
[0014]利用GROMACS分子模擬軟件自帶的g_rms程序計(jì)算VINA對(duì)接得到的1158個(gè)肽配基與VP2-C中相應(yīng)的關(guān)鍵殘基之間的均方根偏差，選擇334個(gè)肽配基進(jìn)行研究。
[0015]根據(jù)C末端方向?qū)?34個(gè)肽配基繼續(xù)篩選，選取C末端方向與VP2-C —致的227個(gè)肽配基進(jìn)行ROSETTA FlexPepDock對(duì)接實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，選取最優(yōu)的10條肽配基進(jìn)行MD模擬。
[0016]對(duì)篩選得到的10條肽配基與鼠多瘤病毒衣殼粒的復(fù)合物進(jìn)行MD模擬，并利用MM/PBSA方法進(jìn)行自由能計(jì)算和分解，進(jìn)一步評(píng)價(jià)肽配基的親和性和特異性，得到具有較高親和性的 7 條肽配基:DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DWFLNLFY、DffSLKLVY, DffSLRLKY 和DWNLHLPY。
[0017]本發(fā)明所述 的:1)特征序列為DWXLXLXY，其中X代表除去半胱氨酸以外的19種氨基酸多肽庫(kù)、和2)依據(jù)為VP2-C中5個(gè)關(guān)鍵殘基:D286、W287、L289、L293和Y296在肽庫(kù)的范圍內(nèi)，利用氨基酸定位法構(gòu)建候選多肽分子庫(kù)；對(duì)其修飾改造策略包括:在其N(xiāo)端添加I或多個(gè)氨基酸殘基；在其C端添加I或多個(gè)氨基酸殘基；在多肽相鄰殘基之間添加I或多個(gè)氨基酸殘基；將多肽中的某一個(gè)或某幾個(gè)殘基替換成其他氨基酸殘基。
[0018]詳細(xì)說(shuō)明如下:
[0019]本發(fā)明基于VP2-C親和模型構(gòu)建衣殼粒新型親和肽配基庫(kù)，其依據(jù)為VP2-C中5個(gè)關(guān)鍵殘基:D286、W287、L289、L293和Y296。該多肽庫(kù)序列特征為:DWXLXLXY，其中X代表除去半胱氨酸以外的19種氨基酸。
[0020]將多肽庫(kù)依次進(jìn)行VINA對(duì)接、均方根偏差比較、C端比較、ROSETTA FlexPepDock對(duì)接以及分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合自由能計(jì)算復(fù)篩，獲得與衣殼粒具有較高親和性的七條肽配基:DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DWFLNLFY、DWSLKLVY、DWSLRLKY 和 DWNLHLPY。其中篩選排名第一的DWDLRLLY經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是衣殼粒的有效親和配基。
[0021]值得指出的是，雖然虛擬篩選能夠快速精確的富集和篩選具有較高親和性的多肽，但是由于計(jì)算機(jī)模擬的局限性(如利用不同軟件或采用不同參數(shù)可能產(chǎn)生不同結(jié)果)，對(duì)生物分子間的相互作用預(yù)測(cè)還不能達(dá)到與實(shí)際情況完全相同，在實(shí)際篩選過(guò)程中可能會(huì)造成具有較高親和性和特異性的多肽被漏篩，因此不排除多肽庫(kù)中其余的6852條多肽分子也可能是衣殼粒的多肽親和配基。
[0022]本發(fā)明利用分子模擬和色譜實(shí)驗(yàn)獲得衣殼粒親和肽配基的方法，如圖1所示，其特征在于包括以下過(guò)程:
[0023]1.應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬/泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積(molecularmechanics-Poisson-Boltzmann surface area, MM/PBSA)方法計(jì)算 VP2-C 與衣殼粒復(fù)合物(晶體結(jié)構(gòu)取自PDB:1CN3)的相對(duì)結(jié)合自由能。利用自由能分解方法解析VP2-C與衣殼粒的結(jié)合機(jī)理，分析確定VP2-C的熱點(diǎn)殘基?；谏鲜鼋馕霁@得的分子機(jī)理和殘基的空間排布特點(diǎn)，構(gòu)建VP2-C的簡(jiǎn)化親和結(jié)合模型。
[0024]2.根據(jù)VP2-C中位于α -螺旋上的5個(gè)熱點(diǎn)殘基(D286、W287、L289、L293和Υ296)的構(gòu)象和相對(duì)位置，利用氨基酸定位法，確定多肽序列模式為DWXLXLXY (其中X代表除去半胱氨酸以外的19種氨基酸);利用peri腳本調(diào)用CHARMM軟件構(gòu)建含有6859條序列的多肽庫(kù)。
[0025]3.利用VINA對(duì)接軟件將多肽庫(kù)中6859條肽配基依次與衣殼粒內(nèi)腔表面結(jié)合域進(jìn)行對(duì)接。然后根據(jù)打分分?jǐn)?shù)的分布，選取結(jié)合自由能(打分分?jǐn)?shù))低于-6.5kcal/mol的多肽分子，共計(jì)1158個(gè)多肽。利用GR0MACS4.5.3軟件包自帶的g_rms程序計(jì)算VP2-C中5個(gè)熱點(diǎn)殘基與對(duì)接得到的1158條多肽序列中相應(yīng)熱點(diǎn)殘基之間的均方根偏差(RMSD)，據(jù)此比較VINA對(duì)接后多肽中的熱點(diǎn)殘基與VP2-C中的熱點(diǎn)殘基構(gòu)象之間的差異。RMSD值越小表示多肽包含的熱點(diǎn)殘基的對(duì)接構(gòu)象與VP2-C中熱點(diǎn)殘基構(gòu)象越接近。根據(jù)RMSD數(shù)值的分布，選擇RMSD〈0.4nm的334個(gè)多肽做進(jìn)一步分析。在VP2-C與衣殼粒復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)中，VP2-C的C末端位于衣殼粒底部，因此候選多肽如果C端朝向與VP2-C不一致，即N端位于衣殼粒底部則不予考慮。由此得到227個(gè)多肽，再利用ROSETTA FlexPepDock進(jìn)行對(duì)接實(shí)驗(yàn)復(fù)篩。對(duì)接實(shí)驗(yàn)在ROSETTA FlexPepDock服務(wù)器上進(jìn)行(http: //flexpepdock.furmanlab.cs.huj1.ac.1l/),對(duì)接參數(shù)為默認(rèn)參數(shù),每條多肽與衣殼粒的復(fù)合物一共產(chǎn)生200個(gè)構(gòu)象。選取對(duì)接打分分?jǐn)?shù)(結(jié)合界面能量分?jǐn)?shù)，I_sc)前十位的多肽進(jìn)行下一步研究。
[0026]4.將步驟3中利用ROSETTA FlexPepDock對(duì)接獲得的十條多肽與衣殼粒復(fù)合物的構(gòu)象作為初始構(gòu)象，利用GR0MACS4.5.3軟件包，選用CHARMM27力場(chǎng)。將多肽與衣殼粒復(fù)合物置于12.16X12.16X12.16nm3的盒子中；水分子模型選擇TIP3P模型；然后加入平衡系統(tǒng)凈電荷以及穩(wěn)定緩沖液(200mMNaCl)溶液所需的Na+和Cl_ ;之后進(jìn)行能量最小化，去除體系中的原子間的碰撞和不正確的幾何構(gòu)型；接下來(lái)用依次進(jìn)行200ps的正則(NVT)系綜和200ps的等溫等壓(NPT)系綜下的限制動(dòng)力學(xué)平衡，最后進(jìn)行20ns的無(wú)限制MD模擬，t匕較十條多肽在模擬前后構(gòu)象的變化。模擬結(jié)束后，選取最后3ns提取構(gòu)象，利用MM/PBSA方法進(jìn)行自由能計(jì)算和分解，進(jìn)一步評(píng)價(jià)多肽的親和性和特異性。其中七條肽配基具有較高親和性:DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DWFLNLFY、DffSLKLVY, DffSLRLKY 和 DWNLHLPY。
[0027]5選取篩選排名第一的多妝DWDLRLLY,固定到Th1propyl Sepharose6B色譜介質(zhì)上制成親和介質(zhì)，然后通過(guò)蛋白靜態(tài)吸附、親和色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)等一系列實(shí)驗(yàn)方法，確證DWDLRLLY是衣殼粒的有效親和配基。
[0028]本方法首先利用分子動(dòng)力學(xué)模擬和MM/PBSA自由能計(jì)算方法獲得VP2-C中與衣殼粒具有高親和性的熱點(diǎn)殘基，確定VP2-C與衣殼粒作用的簡(jiǎn)化親和模型，藉此構(gòu)建衣殼粒的親和肽配基庫(kù)。通過(guò)分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能計(jì)算進(jìn)行配基篩選，獲得與衣殼粒具有較高親和性的肽配基。進(jìn)而通過(guò)靜態(tài)吸附、親和色譜、SDS-PAGE等一系列實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證所得配基對(duì)衣殼粒的分離純化效能。其中，篩選排名第一的DWDLRLLY已經(jīng)確證能有效分離純化衣殼粒，且具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，證實(shí)本發(fā)明所述親和肽配基的仿生設(shè)計(jì)流程的可行性。然而，實(shí)際使用中也發(fā)現(xiàn)DWDLRLLY存在疏水性過(guò)強(qiáng)等問(wèn)題，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需對(duì)該多肽以及多肽庫(kù)中其他多肽進(jìn)行改造，以期獲得具有更高親和性和特異性的配基。改造方法包括在多肽N端或C端添加I個(gè)或多個(gè)氨基酸；在多肽內(nèi)部相鄰殘基之間添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；將多肽中某個(gè)或某幾個(gè)殘基替換成其他氨基酸等。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基設(shè)計(jì)及篩選策略。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0031]實(shí)施例1VP2-C與衣殼粒親和作用機(jī)理解析及VP2-C簡(jiǎn)化親和結(jié)合模型的構(gòu)建
[0032]本研究采用的VP2-C與衣殼粒復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.0rg/pdb/,編號(hào):1CN3)，其中衣殼粒包含5條VPl (34-316號(hào)殘基)，VP2-C上包含19個(gè)殘基(279-297號(hào)殘基)。分子動(dòng)力學(xué)模擬采用GR0MACS4.5.3以及CHARMM27全原子立場(chǎng)。首先采用TIP3P水分子模型將VP2-C與衣殼粒復(fù)合物溶解于正方體盒子中(12.163X 12.163X 12.163nm)。添加225個(gè)Na+和190個(gè)Cl'體系經(jīng)能量最小化后，依次進(jìn)行200ps的正則(NVT)系綜和200ps的等溫等壓(NPT)系綜下的限制動(dòng)力學(xué)平衡，體系溫度設(shè)為298.15K，采用V-rescale法維持恒溫，所有的模擬都采用周期性邊界條件。計(jì)算非鍵作用時(shí)采用1.2nm的距離截?cái)?，采用PME計(jì)算長(zhǎng)程靜電作用，采用Lines用于限制所有氫原子，時(shí)間步長(zhǎng)為2fs。模擬時(shí)間為20ns。
[0033]模擬結(jié)果顯示在5ns 處復(fù)合物的均方根偏差(RMSD)出現(xiàn)平臺(tái)，且勢(shì)能基本趨于穩(wěn)定。因此對(duì)復(fù)合物的17-20ns的軌跡以40ps的間隔取樣，得到75幀構(gòu)象供自由能計(jì)算分析。計(jì)算得到VP2-C與衣殼粒復(fù)合物的疏水作用貢獻(xiàn)為_(kāi)79kcal/mol,而靜電作用貢獻(xiàn)為3kcal/mol，因此衣殼粒與VP2-C之間的親和力主要以疏水作用為驅(qū)動(dòng)力，這與X射線(xiàn)晶體衍射結(jié)構(gòu)的結(jié)論一致。對(duì)于靜電作用，絕大部分對(duì)分子結(jié)合有利的分子間靜電作用貢獻(xiàn)(-171kcal/mol)被不利的靜電溶劑化作用能(177kcal/mol)抵消,而導(dǎo)致總的靜電作用能相對(duì)很小。
[0034]對(duì)VP2-C與衣殼粒復(fù)合物中VP2-C進(jìn)行自由能分解來(lái)確定熱點(diǎn)殘基。熱點(diǎn)殘基被定義為對(duì)結(jié)合自由能貢獻(xiàn)較大的殘基以及參與形成重要分子間作用以補(bǔ)償不利的溶劑化作用的殘基。采用±2.5kcal/mol的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)識(shí)別對(duì)自由能貢獻(xiàn)較大的殘基。計(jì)算得到VP2-C中的六個(gè)熱點(diǎn)殘基，分別是V283、P285、D286、W287、L289和Y296。L293對(duì)自由能的貢獻(xiàn)雖然不符合熱點(diǎn)殘基的標(biāo)準(zhǔn)，但是有文獻(xiàn)報(bào)道SV40病毒中VP3上的L181E會(huì)導(dǎo)致VP3與衣殼粒的結(jié)合能力下降33%，而L181恰好對(duì)應(yīng)鼠多瘤病毒VP2的L293?？紤]到該段序列是多瘤病毒的高度保守區(qū)，因此推斷認(rèn)為L(zhǎng)293對(duì)VP2與衣殼粒的結(jié)合同樣發(fā)揮重要作用，所以L(fǎng)293在構(gòu)建簡(jiǎn)化親和模型的過(guò)程中予以保留。最后根據(jù)VP2-C與衣殼粒的親和機(jī)理和VP2-C的熱點(diǎn)殘基分布，構(gòu)造了一個(gè)VP2-C的親和簡(jiǎn)化模型，包含V283、P285、D286、W287、L289、L293 和 Y296。
[0035]實(shí)施例2多肽庫(kù)的構(gòu)建
[0036]選取距離衣殼粒底部最近的五個(gè)關(guān)鍵殘基D286、W287、L289、L293和Y296作為多肽構(gòu)建的起始點(diǎn)，能最大限度的避免實(shí)際操作中存在的空間位阻效應(yīng)。W287、L289、L293和Y296幾乎位于同一直線(xiàn)上的特點(diǎn)，也有利于短肽配基設(shè)計(jì)，且不需考慮VP2的空間構(gòu)象。己知肽鍵的長(zhǎng)度4.33A;氨基酸主鏈長(zhǎng)度-2.78A ；插入一個(gè)氨基酸殘基需2個(gè)肽鍵長(zhǎng)度和一個(gè)氨基酸的主鏈長(zhǎng)度=2x1.33+2.78=5.44 A；利用 VMD 計(jì)算得到 W287-L289= 5.42 A, L289-L293 = 5.72 A, L293-Y296 = 5.61 A。W
此每?jī)蓚€(gè)相鄰熱點(diǎn)殘基之間可各插入一個(gè)氨基酸。最后得到的多肽構(gòu)建模式為八肽庫(kù):DWXLXLXY (X為不包含Cys的殘基)。利用peri腳本調(diào)用CHARMM軟件構(gòu)建多肽庫(kù)，總共包含6859條序列，每條序列都包含上述5個(gè)熱點(diǎn)殘基。
[0037]實(shí)施例3多肽與衣殼粒的對(duì)接
[0038]1.VINA 對(duì)接
[0039]利用VINA軟件，分別將6859條多肽對(duì)接到衣殼粒內(nèi)腔表面的結(jié)合域上，所有多肽的打分分?jǐn)?shù)在-4~-8kcal/mol之間，此范圍符合親和配基的適中親和力要求(結(jié)合常數(shù)在14~18M4之間)。篩選時(shí)為避免漏選，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值和分布結(jié)果，選取結(jié)合自由能低于-6.5kcal/mol的多肽，共計(jì)1158條。
[0040]2.RMSD 計(jì)算
[0041]本研究利用GR0MACS4.5.3軟件包自帶的g_rms程序計(jì)算VINA對(duì)接得到的1158條多肽序列熱點(diǎn)殘基與衣殼粒中相應(yīng)的熱點(diǎn)殘基之間的RMSD。RMSD值越小，表示多肽包含的熱點(diǎn)殘基的對(duì)接構(gòu)象與VP2-C中相應(yīng)熱點(diǎn)殘基的構(gòu)象越接近。結(jié)果表明，RMSD值分布在
0.3~0.6nm之間。選擇RMSD〈0.4nm的334個(gè)多肽序列作下一步分析。
[0042]3.C端朝向比較。
[0043]在VP2-C與衣殼粒復(fù)合物中，VP2-C從衣殼粒底部由下而上進(jìn)入內(nèi)腔，因此其C端位于衣殼粒的底部。對(duì)于朝向與VP2-C不一致的多肽，即N端朝向衣殼粒底部，則不在考慮范圍。最終篩選出227條多肽作進(jìn)一步篩選。
[0044]4.FlexPepDock 復(fù)篩候選多妝
[0045]利用ROSETTA FlexPepDock網(wǎng)站服務(wù)器進(jìn)行多肽復(fù)篩。Flexpepdock主要包含兩個(gè)模塊，分別用于優(yōu)化肽骨架和剛體方向。初始結(jié)構(gòu)通過(guò)200輪獨(dú)立的Flexp印dock模擬進(jìn)行優(yōu)化。其中100輪是嚴(yán)格利用高分辨率模式模擬，另100輪先是通過(guò)低分辨率的預(yù)優(yōu)化再進(jìn)行高分辨率優(yōu)化的模式模擬?？偣伯a(chǎn)生200個(gè)模型結(jié)構(gòu),然后再根據(jù)generic ful 1-atomenergy score進(jìn)行打分,每條多肽得到最優(yōu)的10個(gè)構(gòu)象。最終篩選出的前十名多肽,按照打分函數(shù)高低依次為 DWDLRLLY、DWDLRLIY、DffGLRLKY, DffSLKLVY, DWFLNLFY、DffSLDLffY,DWGLKLIY、DWNLRLIY、DffSLRLKY, DWNLHLPY。
[0046]實(shí)施例4分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬和麗/PBSA自由能計(jì)算
[0047]為了更加精確的利用計(jì)算機(jī)輔助配基設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)衣殼粒與肽配基復(fù)合物之間的親和作用力，接下來(lái)利用精度更高但也更耗時(shí)的分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合自由能計(jì)算的方法考察復(fù)合物的親和力大小 。分子動(dòng)力學(xué)模擬參數(shù)同實(shí)例I。利用VMD作圖比較模擬前后多肽的構(gòu)象變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 DWGLKLIY、DWGLRLKY和DWSLDLWY，其余七條多肽(DWDLRLLY、DWDLRLIY、DffSLKLVY, DWFLNLFY、DWNLRLIY、DffSLRLKY 和 DWNLHLPY)與衣殼粒在模擬過(guò)程中均表現(xiàn)出了穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象，說(shuō)明這七條多肽可能是衣殼粒的有效親和配基。
[0048]利用MM/PBSA方法計(jì)算這些肽配基與衣殼粒內(nèi)表面的結(jié)合自由能。模擬結(jié)果排名由高到低依次為 DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DWFLNLFY、DWSLKLVY、DWSLRLKY、DWNLHLPY、DWSLDLWY、DWGLRLKY、DWGLKLIY。排名最后的三條多肽是分子動(dòng)力學(xué)模擬中與衣殼粒構(gòu)象結(jié)合不穩(wěn)定的三條配基。自由能計(jì)算結(jié)果表明該十條多肽與衣殼粒的結(jié)合都是以疏水作用為主導(dǎo)，這與初始設(shè)計(jì)思路相一致，表明理性設(shè)計(jì)的精確性。自由能計(jì)算最優(yōu)的多肽為DWDLRLLY，它與衣殼粒的結(jié)合自由能為-61kcal/mol，而VP2-C與衣殼粒的結(jié)合自由能為-76kcal/mol，兩者親和力接近。因此DWDLRLLY可能是衣殼粒的高特異性親和配基。
[0049]實(shí)施例5親和色譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0050]1.DWDLRLLY-6B親和介質(zhì)的制備以及大腸桿菌裂解液的制備
[0051]將Th1propyl Sepharose6B (GE Healthcare)介質(zhì)用過(guò)膜水清洗后再用交聯(lián)緩沖液(0.5M NaCl, ImM EDTA, 0.1M PBS, ρΗ6.5，)預(yù)平衡12h，抽干后稱(chēng)取Ig濕介質(zhì)加入到含有
2.57mg多肽和1mL交聯(lián)緩沖液的錐形瓶中，充分混合，25°C 170rpm水浴搖床反應(yīng)2小時(shí)。最終得到配基密度為2 μ M/ (g抽干濕介質(zhì))的親和多肽介質(zhì)(命名為DWDLRLLY-6B)。
[0052]構(gòu)建pGEX-Ssp DnaB-Ser-VPl質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)后，接種于25mL TB培養(yǎng)基[100mg/L氨節(jié)青霉素，12g/L蛋白胨，24g/L酵母提取物,0.4% (v/v) glycerol, 2.31g/LKH2PO4,12.54g/L K2HPO4]中，37°C，170rpm培養(yǎng)過(guò)夜。將上述菌液按照1:1000比例接種至250mL的TB培養(yǎng)基中，170rpm，37°C培養(yǎng)至OD6tltl ^ 0.5-0.6時(shí)，加入終濃度為0.3mM的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，26°C，170rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。收集菌體，重懸，冰上超聲破碎，離心收集大腸桿菌裂解上清液。
[0053]2、親和介質(zhì)與衣殼粒的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) [0054]將DWDLRLLY-6B 介質(zhì)用平衡緩沖液(50mM PBS, 200mM NaCl, pH6.0)平衡 12h 后抽干，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g介質(zhì)置于25mL錐形瓶中，加入5mL裂解上清液，將錐形瓶置于水浴搖床中，25°C，170rpm振蕩24h，取出10，OOOrpm離心lmin，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明親和多肽介質(zhì)幾乎吸附了裂解上清液中全部的衣殼粒，而對(duì)照中的空白介質(zhì)則不吸附。同時(shí)，大部分雜蛋白都被保留到上清液中，表明該親和多肽介質(zhì)能特異性識(shí)別衣殼粒。值得提出的是，吸附是在較高鹽濃度下(200mM)進(jìn)行的，表明DWDLRLLY與衣殼粒之間是以疏水作用為驅(qū)動(dòng)力的，這與模擬結(jié)果相一致。
[0055]3.色譜分離純化實(shí)驗(yàn)
[0056]采用重力沉降法將DWDLRLLY-6B親和介質(zhì)裝入ImL Tricorn5 X 5柱中，用平衡緩沖液(50mM PBS, 200mM NaCl, pH7.0)沖洗色譜至基線(xiàn)平。上樣200 μ L裂解上清液，再用平衡緩沖液沖洗色譜柱至基線(xiàn)平。然后用洗脫緩沖液(50mM醋酸鹽緩沖液，ρΗ3.0)沖洗5_10個(gè)柱體積。待洗脫峰完全分離后，用2-5個(gè)柱體積再生緩沖液(10mM Gly-HCl, ρΗ2.4)進(jìn)行親和介質(zhì)再生。平衡、清洗、洗脫和再生的流速均為0.5mL/min,上樣流速為0.2mL/min。對(duì)分離大腸桿菌裂解上清液中的流出峰和洗脫峰組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。利用Gel-P1分析軟件計(jì)算VPl的純度。結(jié)果表明，通過(guò)一步親和色譜純化，大腸桿菌裂解上清液中VPl的純度能夠從最初的15.6%提高到70.1%。
[0057]因此，實(shí)驗(yàn)表明，親和肽配基DWDLRLLY能夠有效純化目標(biāo)蛋白，是鼠多瘤病毒衣殼粒的高親和性肽配基。此外，值得提出的是，肽配基庫(kù)中的全部6859個(gè)序列具有相同的設(shè)計(jì)思路(VP2-C的關(guān)鍵殘基:D286、W287、L289、L293和Y296)和結(jié)構(gòu)特征，理論上都有可能是衣殼粒的親和肽配基，已取得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明肽庫(kù)中的親和肽配基是鼠多瘤病毒衣殼粒的有效未和配基。
[0058]本發(fā)明提出鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基及其設(shè)計(jì)篩選方法。篩選所得排名第一的親和肽配基DWDLRLLY，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是衣殼粒的有效親和配基，能夠從大腸桿菌裂解上清液中一步分離純化衣殼粒，在病毒樣顆粒的制備中具有廣闊的應(yīng)用前景。盡管如此，DWDLRLLY仍存在諸多問(wèn)題，如疏水性過(guò)強(qiáng)等。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需對(duì)該多肽以及多肽庫(kù)中其他多肽進(jìn)行修飾改造，以期獲得具有更高親和性和特異性的配基。改造方法包括在多肽N端或C端添加I個(gè)或多個(gè)氨基酸；在多肽內(nèi)部相鄰殘基之間添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；將多肽中某個(gè)或某幾個(gè)殘基 替換成其他氨基酸等。
【權(quán)利要求】
1.鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基，其特征為:DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DffFLNLFY, DffSLKLVY, DffSLRLKY 和 DWNLHLPY。
2.權(quán)利要求1的鼠多瘤病毒衣殼粒的新型親和肽配基的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是依據(jù)天然存在的衣殼粒和次要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP2-C復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建衣殼粒的新型肽配基庫(kù)，特征序列為DWXLXLXY，其中X代表除去半胱氨酸以外的19種氨基酸。
3.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是利用分子動(dòng)力學(xué)模擬/泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積計(jì)算解析VP2-C與衣殼粒復(fù)合物的分子作用機(jī)理，確定疏水作用占主導(dǎo)，而VP2-C中對(duì)結(jié)合 起重要貢獻(xiàn)的關(guān)鍵殘基為V283、P285、D286、W287、L289、L293和Y296。
4.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是多肽庫(kù)構(gòu)建依據(jù)為VP2-C中5個(gè)關(guān)鍵殘基:D286、W287、L289、L293和Y296 ;在肽庫(kù)的范圍內(nèi)，利用氨基酸定位法構(gòu)建候選多肽分子庫(kù)。
5.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是通過(guò)分子對(duì)接篩選、均方根偏差比較以及分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合自由能計(jì)算，進(jìn)行鼠多瘤病毒衣殼粒的高親和性肽配基的篩選。
6.如權(quán)利要求5所述的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是利用VINA分子對(duì)接軟件將肽配基庫(kù)中的肽配基依次與鼠多瘤病毒衣殼粒進(jìn)行對(duì)接，選取結(jié)合自由能低于-6.5kcal/mol的肽配基，共計(jì)1158條。
7.如權(quán)利要求5所述的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是利用GROMACS分子模擬軟件自帶的g_rms程序計(jì)算VINA對(duì)接得到的1158個(gè)肽配基與VP2-C中相應(yīng)的關(guān)鍵殘基之間的均方根偏差，選擇334個(gè)肽配基進(jìn)行研究。
8.如權(quán)利要求5所述的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是根據(jù)C末端方向?qū)?34個(gè)肽配基繼續(xù)篩選，選取C末端方向與VP2-C —致的227個(gè)肽配基進(jìn)行ROSETTA FlexP印Dock對(duì)接實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，選取最優(yōu)的10條肽配基進(jìn)行MD模擬。
9.如權(quán)利要求5所述的設(shè)計(jì)篩選方法，其特征是對(duì)篩選得到的10條肽配基與鼠多瘤病毒衣殼粒的復(fù)合物進(jìn)行MD模擬，并利用MM/PBSA方法進(jìn)行自由能計(jì)算和分解，進(jìn)一步評(píng)價(jià)肽配基的親和性和特異性，得到具有較高親和性的7條肽配基:DWDLRLLY、DWDLRLIY、DWNLRLIY、DffFLNLFY, DffSLKLVY, DffSLRLKY 和 DWNLHLPY。
10.如權(quán)利要求2、5所述的設(shè)計(jì)篩選方法的應(yīng)用，其特征是所述的多肽庫(kù)對(duì)其修飾改造策略包括:在其N(xiāo)端添加I或多個(gè)氨基酸殘基；在其C端添加I或多個(gè)氨基酸殘基；在多肽相鄰殘基之間添加I或多個(gè)氨基酸殘基；將多肽中的某一個(gè)或某幾個(gè)殘基替換成其他氨基酸殘基。
【文檔編號(hào)】G06F19/16GK104031118SQ201410276200
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】張麟, 董曉燕, 李艷英, 劉曉丹, 孫彥 申請(qǐng)人:天津大學(xué)