同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的新方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的新方法，（1）制備鑒定芯片；（2）將待鑒定溶液注入到步驟（1）中鑒定芯片的檢測位點內(nèi)，待鑒定溶液中的抗體分子與所述鑒定芯片上的抗原分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致芯片的檢測位點表面的分子膜層的厚度或密度發(fā)生變化；然后進行沖洗；（3）采用橢偏顯微成像儀檢測步驟（2）中的所述變化，由此判定待鑒定溶液中是否包含弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒以及獲得它們的抗體含量。該方法可以快速、準確同時定性和定量檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒。
【專利說明】
同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的新方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于檢測鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹 病毒的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 弓形蟲是專性細胞內(nèi)寄生蟲，球蟲亞綱，真球蟲目，等孢子球蟲科、弓形體屬。該蟲 呈世界性分布，人和許多動物都能感染，可寄生在除紅細胞外的所有有核細胞中，隨血液流 動，到達全身各部位，損傷大腦、心臟、眼底，致使機體免疫力下降，患各種疾病。人體感染后 多處于隱性感染狀態(tài)，只有當機體免疫力低下時，蟲體被激活并迅速增殖，致病力增強。由 于Τ0Χ對人類健康造成了很大的威脅，對這種疾病的臨床感染診斷的時效性、精確性的要求 也越來越高。
[0003] 風(fēng)疹是由風(fēng)疹病毒引起的一種急性呼吸道傳染病。主要通過呼吸道和直接接觸傳 播。其臨床特征為上呼吸道輕度炎癥、發(fā)熱、全身紅色斑丘疹、耳后、枕后及頸部淋巴結(jié)腫 大，病情較輕，預(yù)后良好。孕婦在懷孕早期感染風(fēng)疹，易導(dǎo)致胎兒發(fā)生先天性風(fēng)疹綜合癥。風(fēng) 疹病毒為RNA病毒，屬于披蓋病毒屬。風(fēng)疹病毒抗原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，只有一種抗原型，只感染人 類。
[0004] 單純皰疼病毒(herpes simplex virus，HSV)是屬于皰疼病毒科a病毒亞科的線性 雙鏈DNA病毒。HSV能引起人類多種疾病，如齦口炎（gingivostomatitis)、角膜結(jié)膜炎 (keratoconjunctivitis)、腦炎(encephalitis)以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感 染宿主后，常在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染，激活后又會出現(xiàn)無癥狀的排毒，在人群中維持傳 播鏈，周而復(fù)始地循環(huán)。根據(jù)抗原性的差別目前把該病毒分為1型和2型。1型主要由口唇病 灶獲得，2型可從生殖器病灶分離到。人群被病毒感染發(fā)生后四個月到數(shù)年被感染的人數(shù)可 達人口總數(shù)的50-90 %，是最易侵犯人的一種病毒，但在臨床僅有一部份發(fā)病。此病可分為 口唇性皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性皮膚炎、陰部皰疹和卡波西病等。
[0005] 在弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹感染的實驗室診斷中，PCR技術(shù)是目前實驗診斷這 三種病毒感染的金標準，但一般實驗室很難做到嚴格的質(zhì)量控制，因而其臨床推廣受到一 定的限制。ELISA是目前最常用的方法，但是實驗的假陽性率高。
[0006] 生物芯片是20世紀90年代發(fā)展起來的一種新的技術(shù)平臺，具有集成化、高通量、高 密度的優(yōu)勢。根據(jù)固相載體上固定的生物分子的不同，可以將生物芯片劃分為DAN芯片、蛋 白質(zhì)芯片等。隨著研究的進一步深入，蛋白質(zhì)芯片已廣泛應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域。蛋白質(zhì)芯片 運用于醫(yī)學(xué)檢驗，則是結(jié)合了微陣列的高通量、集成化和免疫檢測的靈敏、特異的特點可以 方便、快速，并且準確地大批量、平行檢測多樣本、多項目。
[0007] 目前傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在檢測上以熒光標記方法為主。但是，蛋白質(zhì)分子標 記常?？赡軐?dǎo)致以下幾方面的問題。首先，蛋白質(zhì)分子的化學(xué)不均一性，使得標記方法很難 用于定量分析。因為化學(xué)不均一性使得一些蛋白質(zhì)分子的標記效果優(yōu)于另外一些蛋白質(zhì)分 子，即導(dǎo)致標記的不均一性，在缺少精確矯正的情況下，蛋白質(zhì)芯片上熒光絕對強度是沒有 統(tǒng)計學(xué)意義的。其次，實驗需要嚴格控制標記條件，并且為每一種蛋白質(zhì)分子建立矯正曲 線。最后，標記蛋白質(zhì)分子可能影響其生物活性。目前所使用的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免 疫反應(yīng)、放射性核素及蛋白芯片技術(shù)等都需要分子標記，而表面增強激光解吸/離子化飛行 時間質(zhì)譜（SELDI - TOF-MS)技術(shù)和光學(xué)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)不需要分子標記，可以直接分析待 測樣品，但是SELDI技術(shù)設(shè)備非常昂貴，阻礙了它的應(yīng)用。
[0008] 基于現(xiàn)有技術(shù)，目前并沒有報道可以同時檢測或/鑒定以上三種病原體的生物蛋 白芯片，并且由于弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹三種病原體抗原之間具有較大的差異，使得 結(jié)合在同一芯片上具有較大的難度。
[0009] 橢偏光學(xué)顯微成像技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項用于超薄膜檢測的技術(shù)。該技術(shù) 的特點是厚度分辨率極高，能夠達到O.lnm。研究表明，絕大部分蛋白質(zhì)在固體表面上形成 的單分子飽和吸附膜層幾何厚度在2~l〇nm的范圍內(nèi)，膜層是薄而透明的，在物理上，屬于 超薄相位體。由于相位體不引起探測光波的幅值變化，即使用顯微鏡也難以觀測。但是這種 技術(shù)效果的呈現(xiàn)前提是需要篩選合適的蛋白芯片以及合適的操作條件，否則即使應(yīng)用橢偏 顯微成像技術(shù)也無法得到較好的檢測和/或鑒定效果。
[0010] 檢測和/或鑒定臨床樣本中的病原體(細菌、酵母和其它真菌、寄生蟲和病毒)的經(jīng) 典方法包括培養(yǎng)該樣本以擴大所存在病原體的數(shù)目，直到可觀察的菌落生長，然后該菌落 生長可以通過標準的實驗室檢驗鑒定和計數(shù)。為了準確地鑒定感染種類，醫(yī)生必須依賴于 可能需要從3天(如在大多數(shù)細菌的情況下)到8周之間的任何長度的時間的培養(yǎng)結(jié)果。為了 準確地鑒定細菌的種類，該培養(yǎng)隨后進行可能需要另外數(shù)天甚至數(shù)周時間的大范圍生物化 學(xué)檢驗。大多數(shù)情況下，由于疾病的嚴重程度，使這一確定過程快速和準確完成是非常重要 的。在采用經(jīng)典方法時，有可能會產(chǎn)生錯誤，這些錯誤有時導(dǎo)致對病原體的不明確的鑒定， 而因此導(dǎo)致對病原體錯誤的判斷。
[0011] 因此，一種快速、簡單、直接、高通量的具體方法并能同時檢測和鑒定弓形蟲、風(fēng)疹 病毒和單純皰疹病毒是迫切需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是利用橢偏顯微成像技術(shù)檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純 皰疹病毒的新方法。
[0013] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0014] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒 的方法，包括以下步驟：
[0015] (1)制備鑒定芯片：
[0016] 將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針：在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風(fēng)疹病毒 和單純皰疹病毒的抗原，然后進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到鑒定芯 片；
[0017] (2)實施鑒定：
[0018] 將待鑒定溶液注入到步驟（1)中鑒定芯片的檢測位點內(nèi)，所述注入速度為1.4~ 1.6μ1/π?η，待鑒定溶液中的抗體分子與所述鑒定芯片上的抗原分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致芯片 的檢測位點表面的分子膜層的厚度或密度發(fā)生變化;然后進行沖洗；
[0019] (3)讀取芯片：
[0020] 采用橢偏顯微成像儀檢測步驟(2)中的所述變化，由此判定待鑒定溶液中是否含 有弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒以及獲得它們的抗體含量。
[0021] 優(yōu)選的，所述單純皰疹病毒的類型為單純皰疹病毒2型。
[0022] 步驟（1)中，羧基改性表面的硅片的制備：首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用 氨基硅烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后 采用飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。
[0023] 其中，所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~4)，優(yōu)選為1: 3,采用氨基硅烷和 濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，優(yōu)選為30min。所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液 的浸泡時間為1.5~3h，優(yōu)選為2h。
[0024]經(jīng)過大量實驗驗證和分析，本發(fā)明優(yōu)先選用硅片作為鑒定基片，硅片具有表面平 整，光滑度好，可以進行各種表面化學(xué)修飾，使得最終的檢測和/或鑒定效果更加優(yōu)異。由于 硅片的表面對于檢測和/或鑒定結(jié)果非常重要，經(jīng)過大量實驗，對多種改性表面進行篩選， 篩選出來蛋白吸附能力好、本底灰度均勻、對檢測干擾弱的羧基化學(xué)表面作為檢測表面，尤 其是與表面醛基改性的硅片相比，羧基改性的芯片表面反應(yīng)表面細膩均勻，本底灰度值低， 對試驗干擾少。
[0025] 在裝配抗原(探針)之前，需要將表面羧基改性的硅片置于微流控檢測膜片上，采 用微流控芯片加樣系統(tǒng)進行點加探針。加樣流速對檢測和/鑒定效果具有一定的影響，不合 適的加樣流速會導(dǎo)致檢測和/或鑒定結(jié)果不準確。本發(fā)明優(yōu)選的探針微流控加樣流速為1.4 ~1.6μ1/η?η(更優(yōu)選為 1.5μ1/η?η)。
[0026] 本發(fā)明優(yōu)選三種被鑒定物質(zhì)的抗原作為探針，該探針與硅片表面結(jié)合力較高。 [0027] 本發(fā)明優(yōu)選探針濃度為0.08~0.12mg/mL。本發(fā)明的探針濃度0.08~0.12mg/ml的 時候，檢測和/鑒定效果較好，并且增加探針濃度，敏感性沒有明顯提高，經(jīng)過反復(fù)實驗確 定，0. lmg/ml為最佳探針濃度。
[0028]為了盡可能排除非特異性吸附，需要選擇好的封閉試劑。本發(fā)明試驗了多種封閉 試劑，選擇芯片表面非特異性吸附越少封閉效果越好，優(yōu)選BSA為封閉試劑，其濃度優(yōu)選為6 ~8mg/mL(更優(yōu)選為7mg/mL)。
[0029] 采用40~60μ1 (優(yōu)選為50yl)PBS進行沖洗，沖洗速度為8~12μ1/η?η，優(yōu)選為10μ1/ min〇
[0030] 步驟(2)中，步驟(2)中，所述待鑒定溶液為體液、血液、細胞培養(yǎng)上清液等。
[0031] 待鑒定溶液的注入速度為1.4~1.6μ1/π?η，用量為10~12μ1。實驗發(fā)現(xiàn)，待鑒定溶 液的點加速度在1.5μ1/π?η時，反應(yīng)效果較好，探針和被鑒定物能夠充分特異性結(jié)合，并且 被鑒定物1〇μ1即可以被鑒定到。
[0032] 采用40~60μ1 (優(yōu)選為50yl)PBS進行沖洗，沖洗速度為8~12μ1/η?η，優(yōu)選為10μ1/ min〇
[0033] 步驟(3)中，在采用橢偏顯微成像儀鑒定之前，對鑒定芯片進行處理，處理方法為： 采用去離子水沖洗后氮氣吹干。
[0034] 上述檢測和/或鑒定方法屬于非診斷目的檢測和/或鑒定方法。
[0035]本發(fā)明的第二個目的是提供一種橢偏顯微成像蛋白芯片，該芯片是由以下方法制 備得到：
[0036] 將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針：在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風(fēng)疹病毒 和單純皰疹病毒的抗原，然后采用PBS進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到 橢偏顯微成像蛋白芯片。
[0037] 其中，羧基改性表面的硅片的制備:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅 烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽 和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。
[0038] 其中，所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~4)，優(yōu)選為1: 3,采用氨基硅烷和 濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，優(yōu)選為30min。所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液 的浸泡時間為1.5~3h，優(yōu)選為2h。
[0039] 弓形蟲亦稱速殖體或滋養(yǎng)體，是細胞內(nèi)寄生蟲，呈新月形，大小為5~13μπι;風(fēng)疹病 毒是單正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科(togavirus)是限于人類的病毒，電鏡下多呈不規(guī)則 球形，直徑50~70nm的核心；單純皰疹病毒屬于皰疹病毒科a病毒亞科，病毒大小約為180nm 左右；由于三種病原體在結(jié)構(gòu)上和大小上具有非常大的差異，在設(shè)計芯片的最困難的部分 是設(shè)計成弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒三種病毒的抗原同時固定在同一芯片上，從而 使的在同一芯片上檢測或/和鑒定這三種病毒的抗體成為可能。
[0040] 本發(fā)明優(yōu)先選用上述羧基改性制備方法制備得到羧基改性表面的硅片，使得三種 抗原可以同時結(jié)合在該羧基改性表面的硅片上。這在現(xiàn)有技術(shù)中是不存在或不存在相應(yīng)的 技術(shù)啟示得到使用該羧基改性方法得到硅片可以同時結(jié)合這三種抗原。
[0041] 該橢偏顯微成像蛋白芯片與上述的一種同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病 毒的方法中的鑒定芯片相同，不再贅述。
[0042]本發(fā)明的第三個目的是提供一種橢偏顯微成像蛋白芯片的制備方法，包括以下步 驟:將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針:在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純 皰疹病毒的抗原，然后采用PBS進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到光學(xué)蛋 白質(zhì)鑒定芯片。
[0043] 其中，羧基改性表面的硅片的制備:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅 烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽 和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。
[0044] 其中，所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~4)，優(yōu)選為1: 3,采用氨基硅烷和 濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，優(yōu)選為30min。所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液 的浸泡時間為1.5~2.5h，優(yōu)選為2h。
[0045] 本發(fā)明的蛋白芯片的制備方法，直接在羧基改性表面的硅片上進行裝配抗原，無 需將羧基改性表面的硅片進行激活等步驟之后再進行裝配，同時也說明了本發(fā)明的蛋白芯 片的羧基改性的表面能同時較好的固定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒抗原。
[0046] 本發(fā)明的第四個目的是提供上述橢偏顯微成像蛋白芯片在檢測和/或鑒定弓形 蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒中的應(yīng)用，以及提供在制備用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、 風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的試劑盒的應(yīng)用。應(yīng)用方法如下：
[0047]將待鑒定溶液注入到所述橢偏顯微成像蛋白芯片的檢測位點內(nèi)，待鑒定溶液中的 抗體分子與所述芯片上的抗原分子特異性結(jié)合;然后采用橢偏顯微成像儀檢測所述芯片上 各檢測位點分子膜層的厚度變化，由此判定待鑒定溶液中是否包含弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單 純皰疹病毒以及獲得它們的含量。
[0048] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單 純皰疹病毒的試劑盒，該試劑盒包含所述蛋白芯片;進一步，該試劑盒還包括PBS緩沖液、去 離子水、陰性對照品：人免疫球蛋白G等。
[0049] 光學(xué)蛋白質(zhì)芯片是利用橢偏光生物顯微成像技術(shù)發(fā)展起來的蛋白質(zhì)芯片，通過對 蛋白質(zhì)芯片上分子膜層的表面密度分布及厚度變化對入射光波進行調(diào)制，使得反射光或透 射光的橢偏狀態(tài)發(fā)生改變，通過CCD攝像導(dǎo)入計算機，在相應(yīng)的物理模型和圖像處理下可以 顯示樣品分子膜層的密度分布與厚度，以此推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的信息。
[0050] 基于橢偏顯微成像技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，將具 有生物活性的蛋白質(zhì)分子，裝配于固相光學(xué)拋光的硅片表面上，形成單分子膜層，即感應(yīng)表 面。感應(yīng)表面接觸待鑒定的溶液，如果溶液中的蛋白質(zhì)分子與芯片上的蛋白質(zhì)分子之間存 在特異性結(jié)合，就會在芯片表面形成復(fù)合分子，此復(fù)合膜層的厚度就會顯著增加。通過橢偏 光學(xué)顯微成像技術(shù)可以高分辨率地觀察到基片上膜層厚度的變化，從而可以判斷溶液中是 否含有能夠與感應(yīng)表面上的蛋白質(zhì)分子發(fā)生特異性結(jié)合的生物分子。
[0051] 橢偏光學(xué)顯微成像技術(shù)是用偏振光波為探測光照射樣品，樣品會對入射光波進行 調(diào)制，使得反射光中載有樣品的信息。在基底消光條件下，基片表面的生物分子膜層的厚度 (或表面密度）同反射光強的平方根成正比。光強用灰度值表示，膜層的厚度(或表面密度） 愈大，灰度值愈高。
[0052] 本發(fā)明的有益效果是：
[0053] (1)橢偏顯微成像蛋白芯片具體以下優(yōu)點：1)無需任何標記:直接測量抗原-抗體 特異性結(jié)合的復(fù)合物，不需要像酶聯(lián)免疫反應(yīng)和普通蛋白芯片等對生物分子作標記，不會 對生物活性產(chǎn)生影響等。2)直接檢測和/鑒定樣品:在臨床檢測和/或鑒定時，可以直接鑒定 待鑒定樣品，不需對樣品預(yù)處理，這樣更符合大規(guī)模臨床檢測和/或鑒定需要等?，F(xiàn)代化臨 床醫(yī)學(xué)檢驗既需要結(jié)果準確、操作方便快捷、標準統(tǒng)一，又需要可以批量生產(chǎn)、成本低廉。3) 鑒定速度快:電子圖像采樣具有快速攝取圖像的能力，為生物分子動力學(xué)研究提供了可能。 4)在橢偏顯微成像蛋白芯片的陣列中，每一個位點只需要加入μL量級的試劑和樣本即可以 進行檢驗，相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫等檢查方法的ml量級的試劑和樣本量，節(jié)約了數(shù)百倍的 試劑和樣本需求，大大節(jié)省了檢驗成本。5)檢測靈敏度高，可以達到0.005IU/mL，與現(xiàn)在應(yīng) 用的傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光的靈敏度無差異。
[0054] (3)進一步的，通過反復(fù)實驗，篩選優(yōu)化得到了檢測和/或鑒定方法的工藝參數(shù)，使 得采用橢偏顯微成像技術(shù)檢測弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒具有較好的檢測和/或鑒 定效果。本發(fā)明篩選出了蛋白吸附能力好、本底灰度均勻、對檢測干擾弱的羧基化學(xué)表面為 檢測表面，并篩選出了合適的PBS沖洗液和流速，以盡可能沖洗掉非特異性吸附而又保留了 特異性吸附；篩選出了合適的封閉試劑BSA及其濃度、用量和流速，以及待鑒定樣品的用量、 流速;并且經(jīng)過進一步的優(yōu)化篩選，建立了套標準化檢測和/或鑒定程序。一旦條件被標準 化，病原體的檢測和/或鑒定是十分簡單可靠的，且能夠由半熟練人員（非專業(yè)檢驗人員)完 成。
[0055] (4)進一步的，在弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒鑒定中，看到兩個對照點與芯 片本底灰度幾乎相同，說明選取的封閉試劑能夠后極好的封閉芯片表面，極好的減少了非 特異吸附。在陽性檢測位點上，灰度均明顯的高于隱性位點，SPSS統(tǒng)計學(xué)分析表明有顯著差 異，說明利用此蛋白芯片可以鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒。在進一步所做的鑒定 單純皰疹病毒反應(yīng)蛋白的研究中，研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度的樣品通過檢測位點后，所顯示 的灰度（即分子膜層的厚度)也呈現(xiàn)不同灰度梯度，SPSS軟件統(tǒng)計學(xué)分析表明被鑒定樣品濃 度與對應(yīng)的檢測位點的灰度威爾遜相關(guān)系數(shù)達9.53,并且呈明顯的線性關(guān)系，這說明采用 本發(fā)明篩選得到的橢偏顯微成像技術(shù)的微流控蛋白芯片可以定量檢測。
[0056] (5)本發(fā)明中提供的試劑盒能夠同時檢測和/或鑒定待檢測溶液中的弓形蟲、風(fēng)疹 病毒和單純皰疹病毒，具有簡便、快速、檢測結(jié)果可靠等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0057] 圖1是分別檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒標準品的所得圖像。
[0058] 圖2是聯(lián)合檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒標準品的所得圖像。
[0059] 圖3是聯(lián)合檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒陽性血清的所得圖 像。
[0060] 圖4是檢測和/或鑒定不同濃度梯度風(fēng)疹病毒抗體標準品所得圖像。
[0061 ]圖5檢測和/或鑒定風(fēng)疹病毒IgG抗體標準品校準曲線。
[0062]圖6檢測和/或鑒定風(fēng)疹病毒抗體陽性血清芯片圖。
[0063]圖7應(yīng)用橢偏光學(xué)芯片檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果對比柱狀圖。
【具體實施方式】
[0064]本發(fā)明中所用的實驗材料如下：
[0065]橢偏顯微成像儀（中科院力學(xué)研究所研制），微流控芯片加樣系統(tǒng)（中科院力學(xué)所 制造），單晶娃片(洛陽單晶娃片廠）；人免疫球蛋白G(Human IgG)(Sigma)、多克隆羊抗人免 疫球蛋白G抗體（Sigma)、人類血清白蛋白（HSA) (Sigma)、氨基硅烷（Sigma)、戊二醛 (Sigma)、單純皰疹病毒2型抗原(北京高達生物科技有限公司），風(fēng)疹病毒抗原、弓形蟲抗原 (北京弘博康生物科技有限公司），單純皰疹病毒2型抗體、風(fēng)疹病毒抗體、弓形蟲抗體 (ABcam公司），PBS緩沖液(PH7.4)溶解配制各種實驗用溶液及北京化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的濃硫 酸等。
[0066] 實施例1
[0067] -種同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的方法，包括以下步 驟：
[0068] 1、硅片表面改性方式優(yōu)化：
[0069] 本實施例采用了多種改性方法，現(xiàn)篩選兩種改性方式方法進行優(yōu)化，步驟如下：
[0070] 1.1硅片去離子水沖洗3遍，氨基硅烷lmL、濃硫酸3mL浸泡硅片半小時，PBS沖洗硅 片3遍，戊二醛lmL、PBS 3mL浸泡硅片1小時，獲得表面呈醛基化學(xué)性狀的芯片。
[0071] 1.2硅片去離子水沖洗3遍，氨基硅烷lmL、濃硫酸3mL浸泡硅片半小時，無水酒精沖 洗硅片3遍，加入飽和琥珀酸鈉無水酒精溶液浸泡硅片2小時，獲得表面具有羧基性狀的芯 片。
[0072] 1.3分別檢測兩種不同性質(zhì)的硅片表面的均勻程度和本底灰度的大小以及吸附蛋 白的強弱，選擇出合適的化學(xué)表面。
[0073] 2、芯片探針篩選
[0074] 2.1探針種類的選擇對三種目標檢測物的探針，分別選取2類公司產(chǎn)品，點加到檢 測位點上，然后粗測與標準品目標檢測物的結(jié)合強弱，選出結(jié)合好的用作探針。
[0075] 單純皰疹病毒2型抗原優(yōu)選為北京高達生物科技有限公司的產(chǎn)品，風(fēng)疹病毒抗原、 弓形蟲抗原優(yōu)選為北京弘博康生物科技有限公司的產(chǎn)品。
[0076] 2 · 2探針濃度優(yōu)化把選擇好的探針分別按濃度0 · 05mg/mL、0 · lmg/mL、0 · 2mg/mL等 濃度點加到檢測位點上，檢測各不同濃度的探針與被檢測樣品的結(jié)合程度，選擇結(jié)合好的 濃度作為探針濃度。
[0077] 3、封閉方法優(yōu)化
[0078] 3.1封閉試劑的選擇為了盡可能排除非特異性吸附，需要選擇好的封閉試劑。分別 試驗了 BSA和HAS等多種試劑，封閉裝配有探針的芯片后，從檢測位點上加樣lmg/mL的人免 疫球蛋白溶液，然后PBS沖洗，芯片表面非特異性吸附越少封閉效果越好，篩選為封閉劑。 [0079] 3.2封閉試劑濃度的選擇把選擇好的封閉試劑按濃度2mg/ml、5mg/ml、7mg/ml等分 別封閉芯片，選擇非特異吸附最少得濃度作為封閉試劑的濃度。
[0080] 4、微流控加樣速度的優(yōu)化
[0081 ] 4.1目標物檢測用量、微流控加樣速度和PBS沖洗速度優(yōu)化
[0082] 選擇點加樣品的速度為1以1/11^11、1.5以1/1^11、2以1//1^11，以及？83沖洗速度541/ min、10yl/min、15yl/min等，選擇效果最好的速度為微流控加樣速度。
[0083] 5、標準化程序建立
[0084] 5.1通過以上摸索，本發(fā)明選擇了合適的硅片化學(xué)表面、篩選到了合適的探針、合 適的表面封閉劑、加樣速度和沖洗速度等參數(shù)。
[0085] 6、制備鑒定芯片
[0086] 6.1將表面羧基化處理后的硅片放置于微流控檢測膜片上。
[0087] 6.2裝配鑒定探針:在檢測位點上分別裝配選擇好的風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒2型、 弓形蟲抗原，濃度0.1mg/mL，每個檢測位點10μ1，流速lmg/min，PBS緩沖液50μ1沖洗，流速10 μΙ/min。
[0088] 6.3封閉：711^/1111834封閉檢測位點，流速1.5以1/1^11，？83緩沖液5(^1沖洗，流速10 μΙ/min。
[0089] 7、實施檢測和/或鑒定：
[0090] 7.1標準品的檢測和/或鑒定：
[0091] 7.1.1單個標準品的檢測和/或鑒定:采用2X2點芯片檢測標準樣品，在第1行中選 擇2點作為對照點，對照點1為空白對照，對照點2為陰性對照（檢測注入10mg/ml的IgG 20μ 1，操作方法同下，以排除非特異性吸附），同一濃度標準品同時檢測2點。結(jié)果如圖1所示。
[0092] 7.1.2 3種標準品在同一芯片上檢測和/或鑒定:采用2 X 4點芯片檢測標準樣品， 在第1行中選擇2點作為對照點，對照點1為空白對照，對照點2為陰性對照(檢測注入10mg/ ml的IgG 20μ1，操作方法同下，以排除非特異性吸附），同一濃度標準品同時檢測2點。
[0093] 將被檢測和/或鑒定標準品分別注入檢測列位點，流速1.5yl/min，PBS液50μ1沖 洗，沖洗流速1 〇μ 1 /m i η。結(jié)果如圖2所示。
[0094] 7.2血樣檢測和/或鑒定:分別選取了3種抗體陽性和陰性的血清，按照標準品檢測 和/或鑒定方法檢測，取2點為對照，對照點與陽性血清檢測點對比，除了點加的為陰性血清 外，其余操作與陽性檢測點相同，其余4點為陽性血清檢測點。結(jié)果如圖3所示。
[0095] 8、讀取芯片：取下芯片，去離子水沖洗后氮氣吹干，置于橢偏光成像系統(tǒng)樣品板 上，鑒定芯片上各檢測位點分子膜層的厚度變化將呈現(xiàn)在計算機顯示器上，并且膜層厚度 和在顯示器上的灰度呈一致性變化，觀測和讀取實驗圖像和圖像的灰度值。
[0096] 9、陰性陽性檢測點電腦灰度值用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件做統(tǒng)計學(xué)分析。
[0097] 10、檢測結(jié)果：
[0098] 10.1表面改性方式優(yōu)化
[0099] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在光學(xué)顯像中，醛基化學(xué)表面的芯片相對對蛋白質(zhì)吸附和羧基表面類 似，但羧基化學(xué)表面比醛基表面反應(yīng)平面細膩均勻，本底灰度值低，對試驗干擾少，基于以 上試驗，優(yōu)先選擇羧基化學(xué)表面的芯片。
[0100] 10.2探針篩選
[0101] 分別從2種探針中選擇和特異性抗體結(jié)合好的作為鑒定探針，并且發(fā)現(xiàn)探針濃度 0.1mg/ml的時候，檢測和/或鑒定效果最好，并且增加探針濃度，敏感性沒有明顯提高， 0. lmg/ml為最佳探針濃度。
[0102] 10.3封閉試劑篩選
[0103] 經(jīng)過對多種封閉試劑的篩選，選擇BSA作為封閉試劑，濃度為7mg/ml。
[0104] 10.4目標檢測和/或鑒定用量、微流控加樣速度優(yōu)化
[0105] 實驗發(fā)現(xiàn)樣品點加速度1.5μ1/π?η時，反應(yīng)條件最好，探針和被檢測和/或鑒定物 能夠充分特異性結(jié)合，并且被檢測和/或鑒定物1〇μ1即可以被檢測和/或鑒定到。
[0106] 10.5標準化程序的建立
[0107]通過實驗，本發(fā)明建立了標準化檢測和/或鑒定程序：
[0108] (1)芯片表面應(yīng)用羧基化學(xué)表面。
[0109] (2)封閉試劑選用BSA 7mg/mL。
[0110] (3)被檢測和/或鑒定樣品用量10μ1。
[0111] (4)試劑點加速度1.5yl/min，PBS沖洗速度ΙΟμΙ/min，沖洗50μ1。
[0112] 10.6檢測三類抗體的結(jié)果：
[0113]從圖3中可以看出，檢測單元中，3類病毒陽性血清灰度明顯高于陰性血清，說明檢 測單元中各致病微生物抗原捕獲到相應(yīng)的致病微生物抗體并由光學(xué)芯片顯示出來灰度信 號的增加，說明基于橢偏成像的蛋白芯片可以檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹 病毒，并可進一步根據(jù)檢測單元灰度的高低定量被檢測和/或鑒定分子。經(jīng)過大量實驗驗證 和分析，檢測靈敏度可以達到〇. 〇〇5IU/mL，靈敏度較高。
[0114]表1檢測標準品時對照點與標準品檢測點灰度值比較
[0116]表2檢測陽性血清各抗體檢測單元灰度值比較
[0118] 從表1和2中可以看出，檢測單元中灰度值結(jié)果：陽性血清灰度值顯著高于陰性血 清，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計學(xué)分析，3種被檢測和/或鑒定物對應(yīng)灰度值陽性結(jié)果與陰性結(jié)果比較具 有顯著差異，p〈〇〇〇5。
[0119] 在本發(fā)明中，通過反復(fù)實驗，篩選出了蛋白吸附能力好、本底灰度均勻、對檢測干 擾弱的羧基化學(xué)表面為檢測表面，并篩選出了合適的PBS沖洗液和流速，以盡可能沖洗掉非 特異性吸附而又保留了特異性吸附；篩選出了合適的封閉試劑BSA及其濃度、用量和流速， 以及檢測樣品的用量、流速，建立了一套標準化檢測程序。在3種被檢測物的檢測中，看到兩 個對照點與芯片本底灰度幾乎相同，說明選擇的封閉試劑能夠后極好的封閉芯片表面，極 好的減少了非特異吸附。在陽性檢測位點上，灰度均明顯的高于隱性位點，SPSS統(tǒng)計學(xué)分析 表明有顯著差異，說明利用此蛋白芯片可以檢測弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒。在進一 步所做的檢測C反應(yīng)蛋白的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度的樣品通過檢測位點后，所顯 示的灰度（即分子膜層的厚度)也呈現(xiàn)不同灰度梯度，SPSS軟件統(tǒng)計學(xué)分析表明被檢測樣品 濃度與對應(yīng)的檢測位點的灰度威爾遜相關(guān)系數(shù)達9.53,并且呈明顯的線性關(guān)系，這說明用 橢偏顯微成像技術(shù)的微流控蛋白芯片可以定量檢測。通過該芯片系統(tǒng)來檢測弓形蟲、風(fēng)疹 病毒和單純皰疹病毒，更好的指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。
[0120] 綜上所述，我們通過研究，得出結(jié)論，用基于橢偏顯微成像技術(shù)的蛋白芯片可以檢 測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒。
[0121] 實施例2
[0122] -種種橢偏顯微成像蛋白芯片，該芯片是由以下方法制備得到：
[0123] 將羧基改性表面的硅片裝配鑒定探針：在檢測位點上分別裝配弓形蟲、風(fēng)疹病毒 和單純皰疹病毒的抗原，然后采用PBS進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到 橢偏顯微成像蛋白芯片;制備參數(shù)參考實施例1中的標準化檢測和/或鑒定程序中的參數(shù)。
[0124] 風(fēng)疹病毒抗體的定量檢測
[0125] 1、臨床血清樣品的fe正曲線和定量檢測
[0126] 建立校準曲線，血清樣品（942號，218國際單位/毫升)進行系列稀釋，稀釋濃度為 0011，0043,0170,0681，272511]/11^5個濃度梯度的風(fēng)疹病毒抗體，用?831'稀釋。風(fēng)疹病毒抗 原作為檢測探針固定在芯片上，BSA封閉，分別檢測5種濃度的標準血樣，水平軸上為對應(yīng)5 種不同濃度的灰度值的變化，Y軸上產(chǎn)生的校準曲線。
[0127] 在獲得校準曲線后，可以根據(jù)其灰度值確定未知濃度的樣品中的抗體濃度。傳統(tǒng) 的酶聯(lián)免疫吸附抗體試劑盒檢測結(jié)果作為對照組，采用單因素分析法分析了兩者之間的相 互關(guān)系。
[0128] 通過檢測不同濃度梯度的風(fēng)疹病毒抗體標準品取得了定量檢測校準曲線，用48點 芯片檢測病人血樣，檢測位點中，我們還留取不同檢測點作為空白對照、陰性血清對照、以 及鼠 IgG抗體檢測anti-IgG抗體，這些檢測點給我們提供對比。
[0129] 2、統(tǒng)計分析
[0130]用Microsoft Office Excel，采用單因素方差分析計算相應(yīng)P值。在定性和定量檢 測方面，用檢測區(qū)域的灰度值與空白對照區(qū)域進行比較，PS005表示兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意 義。與ELISA和BIE比較，P多005表示兩種方法檢測結(jié)果一致，無差異。
[0131] 3、結(jié)果
[0132] 3.1檢測不同濃度梯度風(fēng)疹病毒抗體標準品所得圖像如圖4所示。
[0133] 3.2檢測不同濃度梯度風(fēng)疹病毒抗體標準品所得濃度灰度值，如表3所示：
[0134] 表3
[0136] 3.3檢測風(fēng)疹病毒IgG抗體標準品校準曲線，如圖5所示。
[0137] 3.4本實施例檢測風(fēng)疹病毒抗體陽性血清芯片圖，如圖6所示。
[0138] 3.5檢測15例風(fēng)疹病毒抗體陽性血清芯片檢測點對照表，如表4所示。
[0139] 表4

[0142] 3.6應(yīng)用橢偏光學(xué)芯片檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果對比柱狀圖，如圖7所示。
[0143] 從兩種方法檢測結(jié)果可以看出，橢偏顯微成像光學(xué)蛋白芯片檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫 檢測方法具有相同的高低趨勢。
【主權(quán)項】
1. 一種用于同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的方法，其特征是，包括以下步 驟： (1) 制備鑒定芯片： 在具有羧基表面改性的硅片的檢測位點上分別裝配弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒 的抗原，然后進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到鑒定芯片； (2) 實施鑒定： 將待鑒定溶液注入到步驟（1)中鑒定芯片的檢測位點內(nèi)，待鑒定溶液中的抗體分子與 所述鑒定芯片上的抗原分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致芯片的檢測位點表面的分子膜層的厚度或密 度發(fā)生變化;然后進行沖洗； (3) 讀取芯片： 采用橢偏顯微成像儀檢測步驟(2)中的所述變化，由此判定待鑒定溶液中是否含有弓 形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒以及獲得它們的抗體含量。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟（1)中，羧基改性表面的硅片的制備方法如 下:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅烷和濃硫酸的混合液浸泡沖洗后的硅片， 再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽和琥珀酸鈉無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅 片，獲得羧基改性表面的硅片。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：所述氨基硅烷和濃硫酸的體積比為1: (2~~ 4)，采用氨基硅烷和濃硫酸的混合液的浸泡時間為20~40min，所述飽和琥珀酸鈉無水乙醇 溶液的浸泡時間為1.5~3h。4. 如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征是，步驟（1)中，在裝配探針之前，需要將表面 羧基改性的硅片置于微流控檢測膜片上，采用微流控芯片加樣系統(tǒng)進行點加探針，微流控 加樣流速為1.4~1.6μ1/π?η，用量為10~12μ1。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：步驟（1)中，采用40~60μ1 PBS進行沖洗，沖洗 速度為8~12μ1/η?η。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:步驟(2)中，待鑒定溶液的注入速度為1.4~1.6 μL/min，用量為 10 ~12μ1。7. -種橢偏顯微成像蛋白芯片的制備方法，其特征是，包括以下步驟:在具有羧基改性 表面的硅片的檢測位點上分別點加弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的抗原，然后采用PBS 進行沖洗;再采用封閉試劑封閉所述檢測位點，得到橢偏顯微成像蛋白芯片；其中，羧基改 性表面的硅片的制備方法包括:首先采用去離子水沖洗硅片，然后采用氨基硅烷和濃硫酸 的混合液浸泡沖洗后的硅片，再采用無水乙醇沖洗浸泡后的硅片，最后采用飽和琥珀酸鈉 無水乙醇溶液浸泡沖洗后硅片，獲得羧基改性表面的硅片。8. 采用權(quán)利要求7所述的方法得到的橢偏顯微成像蛋白芯片。9. 一種用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒的試劑盒，該試劑盒 包含權(quán)利要求8所述的蛋白芯片。10. 下述應(yīng)用，包括： 權(quán)利要求8所述的蛋白芯片在同時鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒中的應(yīng)用； 權(quán)利要求8所述的蛋白芯片在是制備用于同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純 皰疹病毒的試劑盒的應(yīng)用； 權(quán)利要求9所述的試劑盒在同時檢測和/或鑒定弓形蟲、風(fēng)疹病毒和單純皰疹病毒中的 應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/68GK106093427SQ201610387434
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月2日 公開號201610387434.0, CN 106093427 A, CN 106093427A, CN 201610387434, CN-A-106093427, CN106093427 A, CN106093427A, CN201610387434, CN201610387434.0
【發(fā)明人】孫紅柳, 王巧云
【申請人】濱州醫(yī)學(xué)院